Capitolo 2: Scopo della Tesi Capitolo 1: Introduzione Abstract . ....................................................................................................................... Riassunto ............................................................

(1)

INDICE

Riassunto...

I

Abstract...

III

Capitolo 1: Introduzione

………. 1

1.1 FIV come modello animale per lo studio di HIV………. 1

1.2 Classificazione………. 2

1.3 Morfologia……… 3

1.4 Organizzazione del genoma………. 4

1.5 LTR……….. 5

1.6 Geni strutturali………. 6

1.7 Geni accessori………. 8

1.8 Ciclo vitale e replicazione………. 10

1.9 Epidemiologia……… 14

1.10 Patogenesi………. 15

1.11 Risposta immune……… 16

1.12 Esperimenti di vaccinazione condotti per FIV………. 19

1.13 FIV come vettore per terapia genica……… 24

1.14 Progetto di vaccinazione per FIV……… 28

(2)

Capitolo 3: Materiali e Metodi

……… 32

3.1 Produzione del costrutto di packaging……….. 32

3.2 Produzione dei costrutti vettore………. 35

3.3 Produzione del plasmide esprimente Env ed il fGM-CSF……… 38

3.4 Propagazione dei plasmidi………. 40

3.5 Lettura spettrofotometrica……… 41

3.6 Elettroforesi su gel d’agarosio……….. 42

3.7 Linee cellulari utilizzate………. 42

3.8 Preparazione del DNA per trasfezione………. 44

3.9 Trasfezione……… 44

3.10 Trasduzione……… 45

3.11 Analisi al FACS……….. 46

3.12 Dosaggio immunoenzimatico della proteina p25……….. 47

3.13 Valutazione dell’attività biologica dell’fGM-CSF……….. 48 3.13.1 Valutazione della cinetica di crescita delle TF-1 in presenza di fGM-CSF………. 48

3.13.2 Saggio di proliferazione con timidina triziata……… 48

3.14 Valutazione dell’espressione di Env……… 49

Capitolo 4: Risultati

………. 50

4.1 Preparazione del plasmide pVIVO esprimente Env ed il fGM-CSF…… 50 4.2 Valutazione dell’attività biologica dell’fGM-CSF……….. 51

(3)

4.3 Produzione del costrutto di packaging e dei costrutti vettore………….. 54

4.3.1 Produzione e caratterizzazione del costrutto di packaging……… 54

4.3.2 Produzione dei costrutti vettore………. 55

4.4 Analisi dell’efficienza di trasduzione del costrutto vCMV-GFP…………. 56

4.5 Produzione e caratterizzazione di un vettore con LTR ibrida………. 59

4.6 Produzione e caratterizzazione del costrutto vhLTR/PGK……… 61

4.7 Comparazione dei sistemi di concentrazione del vettore ed analisi della durata di espressione del transgene………

66

Capitolo 5: Discussione

……….. 70

Riferimenti Bibliografici

……… 78