In Figura 4.1 sono riportati in forma grafica i dati relativi alle cariche batteriche totali e degli psicrotrofi rilevate in campioni di panne prelevati in inverno e in estate al caseificio A.

(1)

4. RISULTATI

4.1 Conte microbiche

In Figura 4.1 sono riportati in forma grafica i dati relativi alle cariche batteriche totali e degli psicrotrofi rilevate in campioni di panne prelevati in inverno e in estate al caseificio A.

Tali panne derivano da latte raccolto alla stalla, prima del conferimento al caseificio, a diverse temperature: temperatura ambiente, 18 °C, 12 °C e 8 °C, sia in inverno che in estate.

Ogni dato rappresenta la media delle conte relative a due settimane di campionamento con relativa deviazione standard.

1 2 3 4 5 6 7 8

T°ambiente 18°C 12°C 8°C T°ambiente 18°C 12°C 8°C

temperatura

Log ufc/ml

conte psicrotrofi conte totali ESTATE

INVERNO

Figura 4.1 Conte microbiche totali (colore rosso) e dei batteri psicrotrofi (colore blu) di panne ottenute per affioramento di latte derivato da raccolta doppia (T°ambiente e 18 °C) e da raccolta singola (12°C, 8°C). I dati si riferiscono a panne campionate al caseificio A nei mesi di marzo, aprile, maggio (inverno) seconda metà di luglio, agosto e settembre (estate). Ogni colonna rappresenta la media di 6 valori relativi a 6 giornate di campionamento. Le barre rappresentano la deviazione standard.

Per quanto riguarda la Carica Batterica Totale (CBT) le conte estive risultano

tendenzialmente superiori rispetto a quelle invernali. In estate la CBT varia da 5,4 a 6,9 Log

(2)

provenienti da latte non refrigerato dopo la munta, sia in estate che in inverno, appaiono significativamente maggiori rispetto a quelle relative a panne provenienti da latte refrigerato dopo la munta (18, 12 e 8 °C): d’inverno il valore della CBT di panne provenienti da latte non refrigerato è 6,1 Log ufc/ml contro 5,2 Log ufc/ml (carica media delle panne derivanti da latte refrigerato); d’estate la CBT di panne provenienti da latte non refrigerato è 6,9 Log ufc/ml contro 5,7 Log ufc/ml (carica media delle panne derivanti da latte refrigerato).

Per quanto riguarda le conte degli psicrotrofi si può vedere dalla Fig 4.1 che non c’è una variabilità stagionale: in inverno le conte degli psicrotrofi variano da 4,0 a 5,9 Log ufc/ml mentre in estate variano da 3,6 a 5,8 Log ufc/ml. Analogamente all’andamento rilevato per la CBT, sia in inverno che in estate la conta degli psicrotrofi da panne derivanti da latti non refrigerati alla stalla è significativamente maggiore rispetto a quelle relative a panne provenienti da latte refrigerato (18, 12 e 8°C); infatti i valori massimi della conta degli psicrotrofi registrati sia d’inverno che d’estate (circa 5,9 Log ufc/ml per entrambe le stagioni) per le panne provenienti da latte non refrigerato sono significativamente maggiori delle rispettive medie per le panne provenienti da latte refrigerato (4,6 e 4,3 Log ufc/ml) . In Figura 4.2 sono riportati in forma grafica i dati relativi alle cariche batteriche totali e degli psicrotrofi rilevate in campioni di panne prelevati in inverno e in estate al caseificio B. Tali panne derivano da latte raccolto alla stalla, prima del conferimento al caseificio, a diverse temperature: temperatura ambiente, 18 °C, 12 °C e 8 °C in estate e 18°C e 12°C in inverno. Ogni dato rappresenta la media delle conte relative a due settimane di campionamento con relativa deviazione standard. Non essendo stato effettuato il campionamento in inverno di panne provenienti da latte refrigerato a 8 °C, il confronto tra le cariche estive e invernali viene effettuato solo relativamente alle panne derivate da latte refrigerato dopo la munta a 12 °C e 18 °C.

Per quanto riguarda la Carica Batterica Totale, le conte estive risultano tendenzialmente (ma non significativamente) superiori rispetto a quelle invernali. In estate la CBT media delle panne provenienti da latte refrigerato a 18 °C e 12 °C è 7,1 Log ufc/ml, contro 6,58 Log ufc/ml, che è la CBT media delle panne derivanti da latte refrigerato in inverno.

In estate la CBT delle panne provenienti da latte refrigerato a 8 °C è 6,15 Log ufc/ml, e

risulta tendenzialmente inferiore a quella delle panne derivate da latte refrigerato a 12 °C e

18°C, che misurano rispettivamente 7,19 Log ufc/ml e 6,84 Log ufc/ml.

(3)

0 1 2 3 4 5 6 7 8

18°C 12°C 18°C 12°C 8°C

temperatura

Log ufc/ml

conte psicrotrofi conte totali

INVERNO ESTATE

Figura 4.2 Conte microbiche totali (colore rosso) e dei batteri psicrotrofi (colore blu) di panne ottenute per affioramento di latte derivato da raccolta doppia (18 °C) e raccolta singola (12 °C e 8 °C). I dati si riferiscono a latte prelevato alla stalla per il caseificio B alle temperature di 18°C e 12°C nei mesi di novembre e dicembre (inverno) e prelevato a 18°C, 12°C e 8°C nella prima metà di luglio (estate). Ogni colonna rappresenta la media di 6 valori relativi a 6 giornate di campionamento. Le barre rappresentano la deviazione standard

Anche per quanto riguarda le conte degli psicrotrofi si può vedere che le cariche delle panne provenienti da latte refrigerato a 18 °C e 12 °C in estate sono tendenzialmente superiori (ma non significativamente) a quelle delle panne di latte raccolto in inverno. In estate la media di tali conte è infatti 6,73 Log ufc/ml, contro quella invernale che è 6,14 Log ufc/ml. Nuovamente, come già rilevato per la CBT, in estate la carica degli psicrotrofi delle panne provenienti da latte raccolto a 8 °C (5,99 Log ufc/ml) si mostra inferiore a quella delle panne derivate da latte refrigerato a 12 °C e 18 °C (6,96 Log ufc/ml e 5,99 Log ufc/ml).

Raffrontando i due grafici riportati in Figura 4.1 e 4.2, si può notare che per le stesse

temperature e stagione di raccolta del latte alla stalla per il conferimento al caseificio, le

cariche sia totali che degli psicrotrofi rilevate in panne campionate al caseificio B risultano

significativamente superiori a quelle delle panne campionate al caseificio A. In estate la

(4)

ufc/ml e 6,48 Log ufc/ml, contro i rispettivi valori di 5,69 Log ufc/ml e 4,50 Log ufc/ml di quelle del caseificio A. Così in inverno relativamente al caseificio B, si registrano medie di carica totale e degli psicrotrofi pari a 6,58 Log ufc/ml e 6,14 Log ufc/ml, che si discostano di oltre un ordine di grandezza dai rispettivi valori del caseificio A di 5,24 Log ufc/ml e 4,67 Log ufc/ml.

4.2 Isolamenti

Sono stati isolati 230 ceppi da 78 campioni di panna raccolti in 25 giornate di lavorazione di Trentingrana. Ogni isolato è stato osservato al microscopio per determinarne la morfologia cellulare. I ceppi sono stati strisciati nuovamente su PCA latte e reisolati fino a cinque volte per l’ottenimento di una coltura pura. Nonostante tale procedura, non è stato possibile purificare 41 dei 230 ceppi, che pertanto sono stati eliminati. Tra i 189 restanti, 100 dei quali provenienti dalla lavorazione del caseificio A e 89 da quella del caseificio B, sono state individuate 138 forme bacillari, di cui 86 mobili, e 51 forme cocciche.

4.3 Caratterizzazione fenotipica e genotipica

Gli isolati sono stati sottoposti a prove di caratterizzazione fisiologica e tecnologica.

Sulla base della morfologia osservata al microscopio e dei risultati al test Gram e ai test per la produzione di catalasi e ossidasi, i 189 ceppi sono stati suddivisi in 7 gruppi:

- I gruppo: Gram positivi, catalasi negativi, ossidasi negativi, classificati come probabili batteri lattici;

- II gruppo: Gram negativi, catalasi positivi, ossidasi positivi classificati come probabili Pseudomonas;

- III gruppo: Gram negativi, catalasi positivi, ossidasi negativi classificati come probabili Enterobacteriaceae;

- IV gruppo: Gram negativi, catalasi positivi, ossidasi negativi, forma coccoide a gruppi, classificati come probabili Acinetobacter;

- V gruppo: Gram positivi, catalasi positivi, ossidasi positivi;

- VI gruppo: Gram positivi, catalasi positivi, ossidasi negativi, forma bacillare;

- VII gruppo : Gram positivi, catalasi positivi, ossidasi negativi, forma coccoide.

(5)

4.3.1 Identificazione degli isolati tramite sequenziamento

L’identificazione a livello di specie tramite PCR con i primers P0-UNI0515 e successivo sequenziamento è stata eseguita su 37 ceppi. L’identificazione genotipica dei rimanenti isolati è in corso presso il laboratorio della fondazione Edmund Mach di S. Michele all’Adige.

Si riporta di seguito l’esempio di una foto di un gel d’agarosio in cui sono state visualizzate le bande ottenute dopo corsa elettroforetica dell’amplificato, di 15 ceppi isolati, tramite PCR con la coppia di primers P0 e UNI 0515.

La banda visualizzata nel gel si ferma poco sopra la banda 500 bp del marker

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Figura 4.6 Elettroforesi su gel di agarosio dei prodotti di PCR ottenuti da amplificazione con la coppia di primers P0 e UNI0515. Nel pozzetto M è stato caricato il marker (1 Kb DNA plus ladder, Invitrogen), nei pozzetti da 1 a 15 sono stati caricati i campioni di DNA. In ogni lane sono stati caricati 5 µl di amplificato. La freccia indica la banda di 500 bp del marker

(6)

4.3.2 Analisi dei risultati delle prove fenotipiche

I risultati delle prove fenotipiche dei gruppi individuati sono di seguito riportati in tabelle in cui si indica, da sinistra a destra, il numero del ceppo, la specie (quando identificata), il caseificio e la temperatura di raccolta del latte d’origine, la morfologia della colonia, la crescita e la produzione di esoproteasi alle temperature testate, l’attitudine all’acidificazione e l’attività lipolitica e lecitinasica. La risposta positiva dei ceppi ai test condotti viene indicata con segno “+”, in alternativa è posto un segno “-“.

Anche i risultati delle prove di crescita con antibiotico sono organizzati in tabelle. Per i ceppi Gram positivi è stata riportata la crescita (+) o non crescita (-) in cefalosporina, vancomicina, cloramfenicolo, tetraciclina ed eritromicina alle quattro concentrazioni testate di 5 µg/ml, 10 µg/ml , 15 µg/ml e 20 µg/ml. I dati di crescita in kanamicina non sono stati riportati in quanto lo sviluppo di tutti i Gram positivi è stato inibito da tale antibiotico. Per i ceppi Gram negativi è stata riportata la crescita in kanamicina, cloramfenicolo e tetraciclina. I dati inerenti alla crescita in cefalosporina, vancomicina ed eritromicina non sono stati riportati in quanto tutti i Gram negativi sono cresciuti in presenza di tali antibiotici. Questi sono infatti specifici contro i Gram positivi, in quanto vanno a destabilizzare l’integrità della parete cellulare durante la sua formazione.

4.3.2.1 Primo gruppo

Sono stati identificati cinque ceppi classificati come probabili batteri lattici, tutti isolati da panne campionate al caseificio A. I risultati delle prove fenotipiche cui sono stati sottoposti sono riportati in Tabella 4.1.

Temperature di crescita (°C)

Attività esoproteasi (°C) N°

ceppo Caseificio / T latte °C

Morfologia

10 15 20 30 37 30 20 15 10

Attività acidif.

Attività lipasi

Attività lecitinasi

4005 A/ambiente

Cocchi - + + + + - - - - + - -

4017 A/18

Cocchi + + + + - - - - - + - -

4018 A/18

Cocchi + + + + + - - - - + - -

4026 A/12

Bacilli - + + + + - - - - + + -

4253 A/12

Bacilli - + + + + + + + - - + -

Tabella 4.1 Caratterizzazione fenotipica di cinque isolati identificati come probabili batteri lattici (I gruppo)

(7)

Come si può notare dai dati in Tabella, tutti gli isolati provenivano dal caseificio A. Sono state individuate due forme bacillari e tre cocciche. Tutti gli isolati sono cresciuti a 15 °C, 20 °C e 30 °C. Non sono cresciuti tre ceppi a 10 °C e uno a 37 °C. I ceppi isolati si sono dimostrati acidificanti e non proteolitici eccezion fatta per il ceppo 4253 che è proteolitico anche a basse temperature (fino a 15 °C), ma non è acidificante. Il ceppo 4253 insieme al 4026, sono i soli che hanno mostrato attività lipolitica. Nessun isolato si è dimostrato capace di degradare le lecitine.

Crescita in presenza di antibiotici

In Tabella 4.2 sono riportati i risultati relativi alle prove di crescita in antibiotici cui gli isolati in questione sono stati sottoposti.

Cefalosporina (µg/ml)

Vancomicina (µg/ml)

Cloramfenicolo (µg/ml)

Tetraciclina (µg/ml)

Eritromicina (µg/ml) N°

ceppo

5 10 15 20 5 10 15 20 5 10 15 20 5 10 15 20 5 10 15 20 4005 - - - - + + - - + + - - + + - - + + - -

4017 - - - - + - - - + + + +

4018 - - - - + - - - + + + + + + - - + + + +

4026 - - - - + + + + + + - - + - - - + + + +

4253 + + - - - + + + - - - - -

Tabella 4.2 Crescita in antibiotico dei cinque isolati classificati come batteri lattici (I gruppo)

Nessuno dei ceppi isolati riesce a crescere in presenza di concentrazioni maggiori di 15 µg/ml di cefalosporina e tetraciclina. Sono tendenzialmente negativi alla crescita anche in presenza di vancomicina e cloramfenicolo: solo il ceppo 4026 e 4018 sono riusciti a crescere rispettivamente in vancomicina e cloramfenicolo anche a concentrazioni di 20 µg/ml. Tre ceppi su cinque sono resistenti anche all’eritromicina fino a concentrazioni di 20 µg/ml.

4.3.2.2 Secondo gruppo

Sono stati trovati 52 ceppi Gram negativi, catalasi positivi, ossidasi positivi. Tra essi 40,

hanno presentato morfologia bastoncellare mobile e sono cresciuti su terreno PM e quindi

sono stati classificati come probabili appartenenti al genere Pseudomonas. I risultati delle

prove fenotipiche di questi 40 isolati sono riportati in Tabella 4.3.

(8)

ceppo Specie

Caseificio / T latte °C

10 15 20 30 37 30 20 15 10

4000 P. syringae A/ambiente + + + + - - - -

4024 A/12 + + + + + - - - - + - -

4027 A/12 + + + + + - - - - + - -

4028 A/12 + + + + + - - - - + - -

4032 A/8 + + + + + - - - + -

4048 B/12 + + + + + + - - - - + -

4049 P. fluorescens B/12 + + + + + + + - - - + -

4050 B/12 + + + + + - - - - + + -

4052 B/12 + + + + + + + - - - + -

4077 B/12 + + + + + + - - - -

4093 B/18 + + + + + + + - - - - -

4094 B/18 + + + + + + - - - -

4095 B/18 + + + + + + - - - -

4096 B/18 + + + + + + + - - - - -

4097 B/18 + + + + + + - - - + - -

4098 A/ambiente + + + + + + - - - + - -

4102 A/ambiente + + + + + + - - - -

4108 P. fluorescens A/18 + + + + + + + + + + + -

4109 P. fluorescens A/18 + + + + + + + + + + - -

4110 A/18 + + + + + - - - - + - -

4111 A/18 + + + + + - - - - + + +

4128 A/ambiente + + + + + - - - -

4129 P. fluorescens A/ambiente + + + + - + + + + - - -

4131 P.putida^* A/ambiente + + + + + + - - - -

4136 P. syringae A/ambiente + + + + + + - - - + + -

4138 A/18 + + + + + - - - - + + -

4145 P. syringae A/18 + + + + + + + + + - + -

4146 P. fluorescens A/18 + + + + - + + + + - - -

4147 P. fluorescens A/18 + + + + + + + + + - + -

4152 P.putida* A/8 + + + + + + + + + - + -

4205 P.putida* B/12 + + + + - - - + + +

4228 P. syringae B/18 + + + + - + + + + - + -

4230 P. syringae syringae

B/18 + + + + - + + + + - - -

4234 B/18 + + + + - + + + + - + -

4236 P. fluorescens B/18 + + + + + + + + + - - -

4249 P.putida* A/8 + + + + + - - - -

4250 P.putida* A/8 + + + + + - - - -

4257 A/12 + + + + - - - + -

4260 A/12 + + + + + - - - + -

4271 A/ambiente + + + + + + + + + - + -

Tabella 4.3 Caratterizzazione fenotipica dei 40 isolati identificati come probabili appartenenti al genere Pseudomanas (II gruppo). *Ceppi identificati tramite multiplex PCR oltre che sequenziamento

(9)

Su 40 isolati, 25 provenivano dal caseificio A e 15 dal caseificio B. Sono stati identificati tramite sequenziamento sette ceppi appartenenti alla specie P. fluorescens, cinque ceppi a P. syringae e cinque a P. putida la cui specie è stata confermata anche tramite multiplex PCR. Tendenzialmente, gli isolati sono capaci di crescere in un ampio range di temperature da 10 °C a 37 °C; solo 8 isolati su 40 non sono cresciuti alla temperatura di 37 °C. 13 ceppi hanno mostrato un’attività acidificante. 25 isolati hanno dimostrato attività esoproteasica ma circa solo la metà (12 isolati) ha mantenuto tale attività anche a basse temperature (fino a 10 °C). 18 ceppi hanno mostrato di possedere attività lipolitica. Solo due isolati - 4205 (P.

putida) e 4211 - hanno mostrato un’attività di degradazione delle lecitine e gli stessi possedevano anche attività lipolitica e acidificante.

Tra i 52 ceppi Gram negativi, catalasi positivi ossidasi positivi, 12 non sono cresciuti su PM. I risultati delle prove fenotipiche di questi 12 isolati sono riportati in Tabella 4.4.

Attività esoproteasi °C) N°

ceppo Specie Morfologia Caseificio / T latte °C

10 15 20 30 37 30 20 15 10

Attività lecitinasi 4007 Flavobacteriacae bacilli A/ambiente + + + + - + + + - - - -

4016 Psychrobacter cocchi A/18 + + + + - - - -

4051 cocchi B/12 + + + + + - - - + -

4099 bacilli A/ambiente + + + + + + - - - +

4104 bacilli A/ambiente + + + + + + + - - - - +

4106 cocchi A/ambiente + + + + + - - - - + - +

4034 Psychroflexus bacilli A / 8 + + + + + - - - - + - -

4123 Flavobacteriacae bacilli m.* A/ 8 + + + + + + + + + + - + 4198 Flavobacteriacae bacilli m.* B/12 + + + + - + - - - + - -

4239 bacilli B/12 + + + + - - - + -

Tabella 4.4 Caratterizzazione fenotipica dei 12 isolati Gram negativi, catalasi positivi, ossidasi positivi, non cresciuti su PM (II gruppo)

* bacilli m. = bacilli visti mobili al microscopio

(10)

Mediante osservazione al microscopio, sono state riconosciute prevalentemente forme bacillari (9 bacilli contro due forme cocciche) di cui due mobili. Eccetto gli isolati 4198 e 4239, tutti i ceppi sono stati isolati da panne campionate al caseifico A. Sono stati identificati tramite sequenziamento tre ceppi appartenenti al genere delle Flavobacteriacae uno alle Psychrobacteriacae e un Psychroflexus. Tendenzialmente gli isolati sono capaci di crescere in un ampio range di temperature da 10 °C a 37 °C: eccetto 4 ceppi che non sono cresciuti alla temperatura di 37 °C. 4 ceppi hanno mostrato un’attività acidificante. 7 isolati hanno mostrato attività esoproteasica ma solo il ceppo 4123 (appartenente alle Flavobacteriaceae) mantiene tale attività anche a basse temperature (fino a 10°C). Solo 2 ceppi hanno mostrato di possedere attività lipolitica e la metà (6 isolati) hanno mostrato un’

attività di degradazione delle lecitine.

Crescita in presenza di antibiotici

In Tabella 4.5 sono riportati i risultati relativi alle prove di crescita in presenza di antibiotici per i 40 isolati probabili appartenenti al genere Pseudomonas.

Nessuno dei ceppi isolati riesce a crescere in presenza di concentrazioni maggiori di 10 µg/ml di Kanamicina. Gli isolati sono tendenzialmente negativi alla crescita anche in

presenza di tetraciclina: solo 5 ceppi dal 4249 al 4271 (tutti isolati da panne campionate al

caseificio A) riescono a resistere ad alte concentrazioni di tetraciclina (fino a 20 µg/ml). 25

ceppi riescono a crescere ad alte concentrazioni di cloramfenicolo (fino a 20 µg/ml).

(11)

Crescita in kanamicina (µg/ml)

Crescita in cloramfenicolo (µg/ml)

Crescita in tetraciclina (µg/ml) N°

ceppo

5 10 15 20 5 10 15 20 5 10 15 20

4000 + - - - + + - - + + - -

4024 - - - - + + + + + - - -

4027 + - - - + + + + + - - -

4028 - - - - + + + + + - - -

4032 + + - - + + - - + - - -

4048 - - - - + + + + - - - -

4049 + - - - + + + + + - - -

4050 - - - - + + + + - - - -

4052 - - - - + + + + + - - -

4077 + - - - + + - - + - - -

4093 + - - - + + + + + + - -

4094 + - - - + + + - + - - -

4095 + - - - + + + - + - - -

4096 + - - - + + + - + - - -

4097 + - - - + + + + + - - -

4098 + - - - + + + - + - - -

4102 + - - - + + - - + + - -

4108 + - - - + + - + + + - -

4109 - - - - + + + - + - - -

4110 - - - - + - - - + - - -

4111 + - - - + + + - + - - -

4128 - - - - + + - - + - - -

4129 + - - - + + + + + - - -

4131 - - - - + + + + + + - -

4136 - - - - + + + + + - - -

4138 + - - - + + + + + + - -

4145 - - - - + + + + + + - -

4146 - - - - + + + + + + + -

4147 + + - - + + + - + + - -

4152 - - - - + + + - + + - -

4205 + + - - + + + - + - - -

4228 - - - - + + + + + + + -

4230 - - - - + + + + + + - -

4234 - - - - + + + + + + - -

4236 - - - - + + + + + + - -

4249 - - - - + + + + + + + +

4250 - - - - + + + + + + + +

4257 - - - - + + + + + + + +

4260 - - - - + + + + + + + +

4271 - - - - + + + + + + + +

Tabella 4.5 Crescita in antibiotico dei 40 isolati classificati come Pseudomonas ssp. (II gruppo).

(12)

In Tabella 4.6 sono riportati i risultati relativi alle prove di crescita in presenza di antibiotici per i 12 isolati Gram negativi, catalasi positivi, ossidasi positivi ma non cresciuti su PM.

Kanamicina (µg/ml) Cloramfenicolo (µg/ml) Tetraciclina (µg/ml) N°

ceppo

5 10 15 20 5 10 15 20 5 10 15 20

4007 + - - - + + - - - -

4034 - - - - + + - - + - - -

4051 + - - - + + + + + + - -

4099 + - - - + + + + + + - -

4103 + - - - + + + + + - - -

4104 - - - - + + + + + + + +

4106 - - - - + + - - + - - -

4107 + - - - + + - - + + - -

4123 + - - - + + - - + - - -

4198 + + - - + + + + + + - -

4239 - - - - + + + + + + + +

Tabella 4.6 Crescita in antibiotico dei 12 isolati Gram negativi, catalasi positivi, ossidasi positivi, non cresciuti su PM (II gruppo)

Nessuno dei ceppi isolati riesce a crescere in presenza di concentrazioni maggiori di 10 µg/ml di Kanamicina. Gli isolati tendenzialmente non crescono anche in presenza di

tetraciclina: solo i ceppi 4104 e 4239 riescono a crescere in presenza di alte concentrazioni di tetraciclina (fino a 20 µg/ml). Cinque ceppi riescono a crescere ad alte concentrazioni di cloramfenicolo (fino a 20 µg/ml).

4.3.2.3 Terzo gruppo

Sono stati trovati 22 ceppi Gram negativi, catalasi positivi, ossidasi negativi. Tra essi 11

sono cresciuti su terreno VRBA. Tra questi 11 isolati, otto sono cresciuti formando colonie

viola, gli altri tre hanno invece formato colonie trasparenti. Su indicazione della casa

produttrice del terreno utilizzato i tre ceppi cresciuti in colonie trasparenti sono stati

riconosciuti come Enterobacteriaceae del genere Proteus. I risultati delle prove fenotipiche

degli 11 isolati cresciuti su VRBA sono riportati in Tabella 4.7.

(13)

Attività esoproteasi

(°C) N°

ceppo Specie Morfologia Caseificio/

T latte °C

10 15 20 30 37 30 20 15 10

4001 bacilli A/ambiente + + + + - + - - - -

4030 bacilli A/8 + + + + - - - -

4056 bacilli B/12 + + + + + - - - -

4062 bacilli m.* B/18 + + + + + - - - -

4076 bacilli m.* B/12 + + + + + + - - - -

4078 bacilli m.* B/8 + + + + + + - - - -

4086 Enterobacter bacilli m.* B/8 + + + + + - - - - + - - 4256 Enterobacter bacilli m.* A/12 + + + + + + + + + - + - 4117 Proteus ** bacilli m.* A/18 + + + + + - - - - + + +

4229 Proteus** bacilli m.* B/18 + + + + + - - - -

4237 Proteus** bacilli m.^* B/18 + + + + + - - - - Tabella 4.7 Caratterizzazione fenotipica degli 11 isolati identificati come probabili appartenenti al genere delle Enterobacteriacae (III gruppo)

** ceppi identificati come appartenenti al genere Proteus per colore trasparente della colonia cresciuta su terreno VRBA

Tutti gli isolati, all’osservazione al microscopio, hanno rilevato morfologia bastoncellare e otto, tra cui i tre Proteus, sono risultati mobili. Quattro ceppi provenivano dal caseificio A e i restanti otto da quello B. Il 4086 e 4256 sono stati identificati tramite sequenziamento come appartenenti alla famiglia delle Enterobacteriaceae. Tendenzialmente gli isolati sono capaci di crescere in un ampio intervallo di temperature, da 10 °C a 37 °C: solo il 4001 e il 4030 non sono cresciuti a 37 °C. Quattro ceppi hanno mostrato attività esoproteasica a 37

°C ma, tra questi, solo il 4256 (Enterobacter) risulta esoproteasico anche a basse temperature (fino a 10 °C). Solo il 4117 (Proteus), ha mostrato attività lecitinasica e contemporaneamente anche attività lipolitica e acidificante. Anche il 4086 e il 4246 (Enterobacter) sono risultati rispettivamente l’uno acidificante e l’altro lipolitico.

Tra i 22 ceppi Gram negativi, catalasi positivi, ossidasi negativi, 11 non sono cresciuti su VRBA e all’analisi al microscopio hanno mostrato forma bacillare (due sono risultati mobili). I risultati delle prove fenotipiche di questi 11 isolati sono riportati in Tabella 4.8.

Tramite sequenziamento sono stati identificati un ceppo appartenente al genere

(14)

Mycoplasma e uno alle Xanthomonadaceae, entrambi provenienti dal caseificio A. Altri cinque isolati provenivano dal caseificio A, quattro dal B.

(°C) N°

ceppo Specie Morfologia Caseificio/

T latte °C

10 15 20 30 37 30 20 15 10

4004 Mycoplasma bacilli m.* A/ambiente + + + + - + - - - - + -

4037 bacilli A/8 + + + + - + - - - +

4105 bacilli A/ambiente + + + + + - - - - + - -

4121 bacilli A/8 + + + + + - - - - + - +

4161 bacilli A/12 + + + + - - - + - +

4162 bacilli A/12 + + + + - - - -

4240 bacilli B/12 + + + + - - - + -

4241 bacilli m.* B/12 + + + + + - - - + -

4242 bacilli B/12 + + + + - - - + -

4243 bacilli B/12 + + + + - - - + -

4267 Xanthomonadaceae bacilli A/ambiente + + + + + + + + + - - - Tabella 4.8 Caratterizzazione fenotipica di 11 isolati Gram negativi, catalasi positivi, ossidasi negativi non cresciuti su VRBA (III gruppo)

Tutti gli isolati crescono da 10 °C a 30 °C, solo quattro resistono fino a 37 °C. In genere i ceppi non risultano esoproteasici, eccezion fatta per i ceppi 4004, 4037 e 4267 (Xanthomonadaceae) che mostra tale attività enzimatica fino 10 °C. Circa metà degli isolati (cinque) ha mostrato attività lipolitica, tre sono risultati acidificanti e tre produttori di lecitinasi. Il 4121 e il 4161, entrambi del caseificio A, hanno mostrato sia attività lecitinasica che acidificante.

Crescita in presenza di antibiotici

In Tabella 4.9 sono riportati i risultati relativi alle prove di crescita in presenza di antibiotici per gli 11 isolati cresciuti su VRBA.

Nessuno dei ceppi isolati riesce a crescere in presenza di concentrazioni maggiori di 10

µg/ml di kanamicina. Tendenzialmente, gli isolati non crescono nemmeno in presenza di

tetraciclina: solo tre ceppi riescono a crescere in presenza di alte concentrazioni di questo

antibiotico (fino a 20 µg/ml). I ceppi mostrano invece una maggior resistenza all’azione del

cloramfenicolo; infatti un solo ceppo (4237) è sensibile anche a 5 µg/ml, degli altri 10 uno

(15)

(4056) è inibito a partire dai 10 µg/ml, due (4001, 4117) da 15 µg/ml, gli altri sette isolati, tra cui due appartenenti al genere Proteus, non sono inibiti nemmeno dalla concentrazione massima (20 µg/ml).

ceppo 5 10 15 20 5 10 15 20 5 10 15 20

4001 + + - - + + - - + + - -

4030 + - - - + - - -

4056 - - - - + - - - + - - -

4062 - - - - + + + + + - - -

4076 + - - - + + + + + - - -

4078 + - - - + + + + + + + +

4086 + - - - + + + + + + + +

4256 - - - - + + + + + + + +

4117 - - - - + + - - + + - -

4229 - - - - + + + + + + + -

4237 - - - - + + + + + - - -

Tabella 4.9 Crescita in antibiotico degli 11 isolati classificati come Enterobacteriaceae (III gruppo)

In Tabella 4.10 sono riportati i risultati relativi alle prove di crescita in presenza di antibiotici per gli 11 isolati Gram negativi, catalasi positivi, ossidasi negativi, non cresciuti su VRBA .

Gli isolati sono tendenzialmente inibiti dalla kanamicina: solo i ceppi 4037 e 4267, isolati

entrambi del caseificio A, crescono fino a 20 µg/ml. La crescita dei ceppi è inibita anche in

presenza di tetraciclina: solo il 4242 e il 4267 crescono anche in presenza della massima

concentrazione di antibiotico (20 µg/ml). Gli isolati mostrano invece una maggior

resistenza all’azione del cloramfenicolo; infatti cinque ceppi crescono anche in presenza

della massima concentrazione testata (20 µg/ml). Solo il 4267 (Xantomonadaceae) risulta

resistente a tutte le concentrazioni dei tre antibiotici testati.

(16)

ceppo 5 10 15 20 5 10 15 20 5 10 15 20

4004 + - - - + + - - + + + -

4037 + + + + + + - - + - - -

4105 - - - - + + - - + - - -

4121 + - - - + - - - + - - -

4161 + - - - + + + - + + + -

4162 + - - - + + + + + + + -

4240 + - - - + + + + + + - -

4241 + - - - + + + - + - - -

4242 + - - - + + + + + + + +

4243 + - - - + + + + + - - -

4267 + + + + + + + + + + + +

Tabella 4.10 Crescita in antibiotico dei 12 isolati Gram negativi, catalasi positivi, ossidasi negativi non cresciuti su VRBA (III gruppo)

4.3.2.4 Quarto gruppo

Sono stati trovati 23 ceppi Gram negativi, catalasi positivi, ossidasi negativi, descritti al microscopio come dei cocchi riuniti in gruppi e quindi classificati come probabili appartenenti al genere Acinetobacter, attribuzione poi confermata tramite sequenziamento di 13 isolati. I risultati delle prove fenotipiche di questi 41 isolati sono riportati in Tabella 4.11.

Tutti gli isolati, 14 provenienti dal caseificio A e nove dal B, crescono in un ampio intervallo di temperature, da 10 °C a 37 °C. Solo due, il 4264 e il 4265 non crescono a 37

°C. I ceppi non si sono mostrati esoproteasici, ad eccezione del 4122 e del 4104;

quest’ultimo possiede attività esoproteasica fino a basse temperature (10 °C). Otto isolati

sono risultati acidificanti. Quattro di questi sono stati riconosciuti come deboli acidificanti

(+/-), per la colorazione gialla meno intensa rispetto alle altre colonie positive al test. Tutti i

ceppi, eccetto tre, hanno mostrato attività lipolitica e otto hanno mostrato attività

lecitinasica.

(17)

(°C) N°

ceppo Specie Caseificio/

T latte °C

10 15 20 30 37 30 20 15 10

4035 Acinetobacter A/8 + + + + + - - - - +/- + -

4041 Acinetobacter B/8 + + + + + - - - - +/- + +

4043 Acinetobacter B/8 + + + + + - - - + -

4061 Acinetobacter B/18 + + + + + - - - - +/- + -

4070 Acinetobacter B/12 + + + + + - - - - + + +

4100 Acinetobacter A/ambiente + + + + + - - - - +/- + - 4104 Acinetobacter A/ambiente + + + + + + + + + - - +

4120 A/8 + + + + + - - - - + + +

4122 Acinetobacter A/8 + + + + + + - - - + - +

4124 A/8 + + + + + - - - - + - +

4125 A/8 + + + + + - - - - + - +

4126 A/8 + + + + +

- - - + +

4169 Acinetobacter B/18 + + + + + - - - + -

4171 Acinetobacter B/18 + + + + + - - - + -

4199 Acinetobacter B/12 + + + + - - - + -

4235 B/18 + + + + + - - - + -

4238 Acinetobacter B/12 + + + + + - - - + -

4247 A/18 + + + + + - - - + -

4248 A/18 + + + + + - - - + -

4255 A/12 + + + + + - - - + -

4261 A/12 + + + + + - - - + -

4264 Acinetobacter A/ambiente + + + + - - - + -

4265 A/ambiente + + + + - - - + -

Tabella 4.11 Caratterizzazione fenotipica degli isolati classificati come probabili Acinetobacter (IV gruppo)

Crescita in presenza di antibiotici

In Tabella 4.12 sono riportati i risultati delle prove di crescita in antibiotico per i 23 isolati.

Nessun ceppo cresce in presenza di kanamicina eccezion fatta per il ceppo 4035 che cresce

fino a 20 µg/ml. Gli isolati sono tendenzialmente negativi alla crescita in presenza di

tetraciclina; solo il ceppo 4247 e 4248 crescono infatti fino a 20 µg/ml. I ceppi si mostrano

più resistenti all’azione del cloramfenicolo, infatti otto isolati crescono fino a 20 µg/ml.

(18)

Resistenza a kanamicina (µg/ml)

Resistenza a cloramfenicolo (µg/ml)

Resistenza a tetraciclina (µg/ml)

N°

ceppo

5 10 15 20 5 10 15 20 5 10 15 20

4035 + + + + + + - - + - - -

4041 - - - - + + + + - - - -

4043 - - - - + + - - - -

4061 + + - - + + + + + - - -

4070 - - - - + + - - + - - -

4100 + - - - + + + + - - - -

4104 - - - - + + + - + + + -

4120 - - - - + - - - -

4122 + - - - + - - - + - - -

4124 - - - - + - - - + - - -

4125 + - - - + - - - + + - -

4126 - - - - + - - - + + - -

4169 - - - - + + + - + - - -

4171 - - - - + + + - + - - -

4199 - - - - + - - - -

4235 - - - - + + + - - - - -

4238 + - - - + + + + + - - -

4247 - - - - + + + + + + + +

4248 - - - - + + - - + + + +

4255 - - - - + + + + + + + -

4261 - - - - + + + + + + + -

4264 - - - - + + + + - - - -

4265 - - - - + + + - - - - -

Tabella 4.12 Crescita in antibiotico dei 23 isolati classificati come probabili Acinetobacter (IV gruppo)

4.3.2.5 Quinto gruppo

Sono stati individuati 22 ceppi Gram positivi, catalasi positivi, ossidasi positivi. I risultati

delle prove fenotipiche cui sono stati sottoposti sono riportati in Tabella 4.13. Mediante

osservazione al microscopio sono state individuate 21 forme bacillari, di cui 15 mobili, e

una coccoide. 14 ceppi provenivano dal caseificio A e otto dal B. Tendenzialmente tutti gli

isolati crescono da 10 °C a 37 °C eccezion fatta per tre ceppi non crescono a 10 °C e otto

ceppi che non crescono a 37 °C. Gli isolati non hanno mostrato attività esoproteasica; solo

tre ceppi sono risultati esoproteasici di cui il 4144, fino a 15 °C. La metà dei ceppi ha

mostrato attività acidificante, sette sono risultati lipolitici e nessuno ha mostrato attività

(19)

lecitinasica, ad eccezione di tre isolati. Uno di questi, il 4112, del caseificio A, è anche lipolitico e acidificante.

Attività esoproteasi(°C) N°

ceppo Morfologia

Caseificio/

T latte °C

10 15 20 30 37 30 20 15 10

4010 bacilli A/18 + + + + + - - - - + - -

4011 bacilli m.* A/18 + + + + + - - - - + - -

4015 bacilli m.* A/18 + + + + + - - - - + + -

4020 bacilli m.* A/12 + + + + + - - - - + - -

4038 bacilli m.* B/8 + + + + + + - - - -

4040 cocchi B/8 + + + + + - - - + -

4053 bacilli m.* B/12 - + + + + + - - - - + -

4054 bacilli m.* B/12 - + + + + - - - - + - -

4057 bacilli B/12 + + + + + - - - + -

4112 bacilli m.* A/18 + + + + + - - - - + + +

4127 bacilli A/8 + + + + + + - - - -

4141 bacilli m.* A/18 + + + + - - - -

4142 bacilli m.* A/18 + + + + - - - -

4143 bacilli A/18 + + + + + - - - - + - -

4144 bacilli A/18 + + + + + + + + - - + -

4150 bacilli m.* A/8 + + + + - - - -

4151 bacilli m.* A/8 + + + + - - - + - +

4153 bacilli m.* A/8 + + + + - - - -

4155 bacilli A/8 + + + + - - - + - -

4201 bacilli m.* B/12 + + + + - + - - - - + -

4207 bacilli m.* B/12 + + + + - - - - + - +

4252 bacilli m.* A/12 - + + + + - - - + - -

Tabella 4.13 Caratterizzazione fenotipica dei 22 isolati Gram positivi, catalasi positivi, ossidasi positivi (V gruppo)

(20)

Crescita in presenza di antibiotici

In Tabella 4.14 sono riportati i risultati delle prove di crescita con antibiotico per i 22 ceppi Gram positivi, catalasi positivi, ossidasi positivi. Tendenzialmente tutti crescono in presenza di cefalosporina, vancomicina, cloramfenicolo ed eritromicina, fino alla massima concentrazione impiegata (20 µg/ml). Riguardo alla tetraciclina, gli isolati risultano meno resistenti a tale antibiotico: a 20 µg/ml crescono solo tre isolati provenienti dal caseificio A.

Cefalosporina (µg/ml)

Vancomicina (µg/ml)

Cloramfenicolo (µg/ml)

Tetraciclina (µg/ml)

Eritromicina (µg/ml) N°

ceppo

5 10 15 20 5 10 15 20 5 10 15 20 5 10 15 20 5 10 15 20 4010 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 4011 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 4015 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 4020 + + + + + + + + + + + + + - - - + + + + 4038 + + + + + + + + + - - - + - - - + + + + 4040 + + - - + + - - + + - - - + + + + 4053 + + + + + + + + + + + + - - - - + + + + 4054 + + + + + + + + + + + + + - - - + + + + 4057 + + - - + - - - + + - - - + + - - 4112 + + + + + + + + + + + - + - - - + + + + 4127 + + + + + + + + + + + + - - - - + + + + 4141 + + + + + + + + + + + + + + - - + + + + 4142 + + + + + + + + + + + + + + - - + + + + 4143 + + + + + + + + + + + + + + + - + + + + 4144 + + + + + + + + + + + + + + - - + + + + 4150 + + + + + + + + + + + - + - - - + + + + 4151 - - - + - - - + + + - + - - - 4153 + + - - + + + + + + + - - - + + + - 4155 + + + + + + + + + + - - + + + - + + + + 4201 + + + + + + + + + + + - + - - - + + + + 4207 - - - - + + + + + + + - + - - - + + + + 4252 + + + + - - - + - - - Tabella 4.14 Crescita in antibiotico dei 22 isolati Gram positivi, catalasi positivi, ossidasi positivi (V gruppo)

(21)

4.3.2.6 Sesto gruppo

Sono stati individuati 43 ceppi Gram positivi, catalasi positivi, ossidasi negativi, riconosciuti, dall’osservazione al microscopio, come forme bacillari, 19 delle quali mobili.

I risultati delle prove fenotipiche loro sottoposte sono riassunti in Tabella 4.15.

21 isolati provengono dal caseificio A e 22 dal B. Tutti gli isolati crescono tendenzialmente in un ampio intervallo di temperature, da 10 °C a 37 °C; solo tre ceppi non crescono a 10

°C e 11 a 37 °C. In generale gli isolati in esame non presentano attività esoproteasica; solo il ceppo 4113, del caseificio A, mostra tale attività enzimatica fino a 15 °C.

Tendenzialmente sono ceppi acidificanti e lipolitici infatti ben 28 isolati hanno mostrato

attività acidificante, e 33 attività lipolitica. 11 ceppi hanno mostrato attività lecitinasica. Di

questi otto ceppi, tutti derivanti dal caseificio A, sono anche lipolitici. Interessante è il

ceppo 4113 che si è dimostrato positivo a tutti i test e quindi risulta possedere sia attività

esoproteasica che lipolitica che lecitinasica nonché si è dimostrato essere un ceppo

acidificante.

(22)

(°C) N°

ceppo Morfologia Caseificio/

T latte °C

10 15 20 30 37 30 20 15 10

4009 bacilli A/ambiente - + + + + - - - - + - +

4042 bacilli m.* B/8 + + + + + - - - -

4045 bacilli m.* B/8 - + + + - - - + - -

4046 bacilli m.* B/8 + + + + + - - - - + - -

4071 bacilli B/12 + + + + + - - - - + - -

4072 bacilli m.* B/12 + + + + + - - - - + + -

4079 bacilli B/8 + + + + + - - - - + - -

4080 bacilli m.* B/8 + + + + + - - - - + + -

4081 bacilli m.* B/8 + + + + + - - - - + + -

4082 bacilli B/8 + + + + + - - - - + + -

4083 bacilli m.* B/8 + + + + + - - - - + + -

4087 bacilli m.* B/8 + + + + + - - - - + + -

4088 bacilli m.* B/18 + + + + + - - - - + + -

4089 bacilli m.* B/18 + + + + + - - - - + + -

4090 bacilli B/18 + + + + + - - - - + + -

4101 bacilli A/18 + + + + + - - - - + + -

4113 bacilli m.* A/18 + + + + + + + + - + + +

4118 bacilli m.* A/8 + + + + + - - - - + + +

4133 bacilli m.* A/ambiente + + + + + - - - - + + - 4135 bacilli m.* A/ambiente + + + + + - - - - + + - 4137 bacilli m.* A/ambiente + + + + + - - - - + + +

4139 bacilli m.* A/18 + + + + + - - - - + + +

4140 bacilli A/18 + + + + - - - + + +

4148 bacilli A/8 + + + + + - - - + -

4149 bacilli m.* A/8 + + + + + - - - + -

4154 bacilli A/8 + + + + + - - - - + + +

4158 bacilli A/12 + + + + - - - + + +

4159 bacilli m.* A/12 + + + + - - - + - +

4160 bacilli A/12 + + + + - - - + -

4163 bacilli A/12 + + + + - - - -

4164 bacilli A/12 + + + + - - - + -

4166 bacilli A/12 + + + + - - - -

4167 bacilli A/12 + + + + - - - + - +

4170 bacilli B/18 + + + + + - - - + -

4175 bacilli B/18 + + + + + - - - + -

4176 bacilli B/18 + + + + + - - - - + + -

4177 bacilli B/18 + + + + + - - - + -

4204 bacilli B/12 + + + + - - - + -

4206 bacilli m.* B/12 + + + + - - - + + +

4244 bacilli B/12 + + + + + - - + -

4246 bacilli B/12 + + + + + - - + -

4259 bacilli A/12 + + + + + - - - + -

4270 bacilli A/ambiente - + + + - - - + -

Tabella 4.15 Caratterizzazione fenotipica delle 43 forme bacillari Gram positive, catalasi positive, ossidasi negative (VI gruppo)

(23)

Crescita in presenza di antibiotici

In Tabella 4.16 si riportano i dati relativi alle prove di crescita in antibiotico dei 43 isolati.

Eccezion fatta per quattro ceppi, tutti gli isolati riescono a crescere alle concentrazioni più

alte di vancomicina. Poco meno della metà dei ceppi riesce a crescere anche in presenza di

cefalosporina, cloramfenicolo ed eritromicina infatti sono rispettivamente 20, 15 e 21 gli

isolati cresciuti in presenza della concentrazione massima testata (20 µg/ml) di

cefalosporina, cloramfenicolo ed eritromicina.. I ceppi in esame si mostrano invece più

sensibili all’azione della tetraciclina; a 20 µg/m crescono infatti solo sei ceppi.

(24)

Crescita in cefalosporina

(µg/ml)

Crescita in vancomicina

a(µg/ml)

Crescita in cloramfenicolo

(µg/ml)

Crescita in tetraciclina

(µg/ml)

Crescita in eritromicina

(µg/ml) N°

ceppo

5 10 15 20 5 10 15 20 5 10 15 20 5 10 15 20 5 10 15 20 4009 - - - - + + + - - - + + + + + + + + 4042 + + + + + + + + + + + + - - - - + + + + 4045 + + - - + + + + + + + + + - - - + + + + 4046 + + - - + + - - + + + + + - - - + + + + 4071 + + + + + + + + + + + - + + - - + - - - 4072 + - - - + + + + + + + - + + + + + - - - 4079 + + + + + + + + + + + + + + - - + + + - 4080 + + + + + + + + + + + - + + - - + + + + 4081 + + + + + + + + + + + - + - - - + + + + 4082 + + + + + + + + + + + + + + - - + + + + 4083 + - - - + + + + + + + - + + - - + + + + 4087 + + + + + + + + + + + - + + - - + + + + 4088 + + + + + + + + + + + + + - - - + + + + 4089 + + + + + + + + + + + + + + - - + + + + 4090 + + + + + + + + + + + + + - - - + - - - 4101 + - - - + + + + + + + - + + - - + - - - 4113 + + + + + + + + + + + - + - - - + + + + 4118 + + + + + - - - + - - - + - - - + - - - 4133 + + + + + + + + + + + + + - - - + + + + 4135 + + + + + + + + + - - - + - - - + + + + 4137 + + + + + + + + + + + + + - - - + + + + 4139 + + + + + + + + + + + + + + - - + + + + 4140 + + + + + + + + + + + - + + - - + + + + 4148 + + + + + + + + + + + - + - - - + + + + 4149 + + + + + + + + + + + - + - - - + + + + 4154 - - - - + + + + + + - - - + - - - - 4158 + + - - + + + + + + + + + + - - + + + + 4159 + + - - + + + + + + + + + + - - + + + + 4160 - - - - + + + + + + + + + - - - + + - - 4163 - - - - + + + + + + - - + + + + + + + + 4164 - - - - + + + + + + + + + - - - + - - - 4166 - - - - + + + + + + + - + + + - + - - - 4167 - - - - + + + + + + + - + + + - + - - - 4170 - - - - + + + + + + + - + + + - + - - - 4175 - - - - + + + + + + + - + + + - + - - - 4176 + - - - + + + + + + + - + - - - + + + + 4177 - - - - + + + + + + + - + - - - + + + + 4204 + - - - + + + + + + + - + - + - + - - - 4206 - - - - + + + + + + + - + - - - + + + + 4244 + + - - + + + + + + + - + - - - + - - - 4246 + + - - + + + + + + + - + + + + - - - - 4259 + + + + + + + + + + + - + + + + + + + + 4270 - - - + + + + - - - -

Tabella 4.16 Crescita in antibiotico delle 43 forme bacillari Gram positive, catalasi positive, ossidasi negative (VI gruppo)

(25)

4.3.2.7 Settimo gruppo

Sono stati individuati 22 ceppi Gram positivi, catalasi positivi, ossidasi negativi riconosciuti, tramite osservazione al microscopio, come cocchi. I risultati delle prove fenotipiche sono riassunti in Tabella 4.17.

ceppo Caseificio/T latte °C

10 15 20 30 37 30 20 15 10

4008 A/ambiente - + + + - - - + -

4058 B/18 + + + + + - - - + -

4059 B/18 + + + + + - - - + -

4060 B/18 + + + + + - - - + -

4063 B/18 + + + + + - - - + -

4064 B/18 + + + + + - - - + -

4065 B/18 - + + + + - - - - + + -

4067 B/18 + + + + + - - - + -

4068 B/12 + + + + + - - - + -

4069 B/12 + + + + + - - - + -

4075 B/12 + + + + + - - - + -

4085 B/8 + + + + + - - - - + + -

4091 B/18 + + + + + - - - - + + -

4092 B/18 + + + + + - - - - + - -

4115 A/18 8

+ + + + + + - - - - + +

4116 A/18 + + + + + + - - - + + +

4202 B/12 + + + + - - - + - +

4245 B/12 + + + + + - - + -

4254 A/12 - + + + + - - - -

4266 A/ambiente + + + + - - - + -

4268 A/ambiente - + + + - - - + -

4269 A/ambiente - + + + + - - - + -

Tabella 4.17 Caratterizzazione fenotipica delle 22 forme cocciche Gram positive, catalasi positive, ossidasi negative (VII gruppo)

Sette degli isolati provenivano dal caseificio A e15 dal caseificio B. Tendenzialmente tutti i ceppi crescono in un ampio intervallo di temperatura da 10 °C a 37 °C. Solo quattro ceppi, del caseificio A, non crescono a 37 °C. Nessun ceppo possiede attività esoproteasica. Solo il 4115 e il 4116 mostrano tale attività enzimatica, ma non a temperature inferiori a 30 °C.

Sei ceppi risultano acidificanti e, ad eccezione di tre ceppi, tutti hanno mostrato anche

(26)

hanno mostrato tale attività. Interessante è il ceppo 4116 che si è dimostrato positivo a tutti i test e quindi risulta possedere sia attività esoproteasica che lipolitica che lecitinasica nonché si è dimostrato essere un ceppo acidificante.

Crescita in presenza di antibiotici.

In Tabella 4.18 si riportano i risultati delle prove di resistenza agli antibiotici per i 22 isolati in esame. Eccezion fatta per tre ceppi , tutti riescono a crescere in presenza di vancomicina fino alla massima concentrazione di 20 µg/ml. I ceppi risultano più sensibili all’azione degli altri antibiotici impiegati. A 20 µg/ml in presenza di cefalosporina ed eritromicina crescono rispettivamente sette e nove isolati. Ancor più selettiva è l’azione del cloramfenicolo e della tetraciclina, infatti in presenza di 20 µg/ml crescono rispettivamente uno e tre isolati.

Crescita in cefalosporina

(µg/ml)

Crescita in vancomicina

(µg/ml)

Crescita in cloramfenicolo

(µg/ml)

Crescita in tetraciclina (µg/ml)

Crescita in eritromicina

(µg/ml) N°

ceppo

5 10 15 20 5 10 15 20 5 10 15 20 5 10 15 20 5 10 15 20 4008 - - - - + + - - - + + + + + + - - 4058 - - - - + + + + + + - - + - - - + + - - 4059 - - - - + + + + + + - - + - - - + + - - 4060 - - - - + + + - + - - - + - - - + + - - 4063 + + - - + + + + + + - - + - - - + + - - 4064 + + - - + - - - + + - - + - - - + + - - 4065 + + - - + + + + + + + - + - - - + + - - 4067 + + - - + + + + + + - - + - - - + + - - 4068 + + + + + + + + + + - - + - - - + + + + 4069 + + + + + + + + + + - - + + + + + + + + 4075 + - - - + + + + + + - - + - - - + - - - 4085 + + + + + + + + + + - - + + - - + + + + 4091 + - - - + + + + + + + + + + - - + + + + 4092 + + + + + + + + + + - - + + - - + + + + 4115 + + + + + + + + + + - - + - - - + + + + 4116 + + + + + + + + + - - - + - - - + + + + 4202 - - - - 4245 + + - - + + + + + + - - + + + + + + + + 4254 + + + + + + + + + + - - - - 4266 - - - - + + + + + - - - - 4268 - - - - + + + + - - - - 4269 - - - - + + + - + + - - + - - - + + + + Tabella 4.18 Crescita in antibiotico delle 22 forme cocciche Gram positive, catalasi positive, ossidasi negative (VII gruppo)