Riassunto
E' stato precedentemente dimostrato che l'incubazione prolungata con 5'-amminoimidazolo-4-carbossammide (AICA) riboside produce frammentazione nucleare ed atiiazione d ella caspasi-- n elle cellule d i n euroblastoma umano Y5Y, carateristiche tipiche delllapoptosii lAICA riboside in grado di entrare nella cellula e, per mezzo delllenzima adenosina chinasi, esser fosforilato nel citosol a ribotide il quale mima la AMP e porta all'atiiazione della proteina chinasi atiiata da AMP (AMPK)i a AMPK appartenente alla famiglia delle serina-treonina chinasi, considerata un sensore dei liielli di energia cellulare in molti tessutii a AMPK, atiiata per fosforilazione sul residuo amminoacidico hrr17 della subunitt α, regola processi di consumo e di rigenerazione di A P in condizioni fsiologiche normali (come la contrazione muscolare scheletrica e cardiaca sia a riposo che durante llesercizio) e in condizioni patologiche (come lo stress metabolico, llipossia, llischemia, la depriiazione da glucosio)i Non chiaro il ruolo che la AMPK siolga nelllapoptosi; alcuni Autori hanno riportato la sua atiiazione d urante l a m orte c ellulare programmata mentre altri l'hanno descrita c ome c oiniolta n el m eccanismo d i protezione da essai
o scopo della presente tesi chiarire il meccanismo di apoptosi indoto da AICA ribosidei a iia mitocondriale caraterizzata d al r ilascio d i c itocromo c mitocondriale al citosol, doie si lega alla proteina Apaf r e proioca l'atiiazione della caspasi 9i Per chiarire se l'apoptosi indota d a A ICA r iboside, c oiniolga l a i ia mitocondriale, sono stati eiidenziati il rilascio del citocromo c e l'atiiazione della caspasi 9 mediante western blotingg estrati di cellule tratate a iari tempi con AICA
riboside e di colture di controllo, sono stati sotoposti a S -PAAE, t rasferiti s u membrana PVSF ed infne incubati con anticorpi appropriatii Abbiamo osseriato che le modifcazioni di morfologia nucleare sono precedute dal rilascio di citocromo C e dalllatiiazione di caspasi-9i
Nell'intento di capire se l'atiiazione della AMPK sia coiniolta nel meccanismo della citotossicitt, abbiamo incubato le cellule di neuroblastoma con un altro stimolatore della AMPK, la metformina, o con un inibitore, il composto Ci latiiitt della AMPK stata saggiata atraierso la tecnica del western bloting, usando un anticorpo anti-AMPK fosforilata, per rileiarne la presenzai a iitalitt cellulare stata misurata eseguendo il saggio delllM (bromuro di --(4,5-dimetiltiazol-7-il)-7,5-difeniltetrazolio)) e la morfologia nucleare stata analizzata al microscopio a fuorescenza dopo la colorazione con Soechsti
ratamenti d i A ICA r iboside o m etformina p roducono a tiiazione d e lla A M PK rileiabile git dopo --5 orei ratamento con metformina 5 mM per 17 ore riducono la iitalitt cellulare e inducono la comparsa di corpi apoptoticii Il composto C non produce protezione quando llapoptosi indota da AICA r iboside n elle cellule di neuroblastomai Questo suggerisce che llatiiitt d i A MPK d eie e ssere f nemente regolata, perché sia la stimolazione che llinibizione della AMPK riducono la iitalitti AICA riboside potrebbe accumularsi in indiiidui con un errore innato del metabolismo delle purine che causi un aumento nella sintesi de novo e/o una soiraespressione della 5l-nucleotidasi (l'enzima che trasforma il ribotide in riboside)i I risultati della presente tesi suggeriscono che l'efeto t o ssico d i A I CA r i boside s u
alcuni tipi di neuroni può partecipare alle manifestazioni neurologiche di sindromi correlati con disfunzioni del metabolismo purinicoi
