Mercodia MPO ELISA
Instruzioni per l’uso 10-1176-01
Reagenti per 96 rilevazioni
Per l’uso diagnostico in vitro nell’UE/SEE, nel Regno Unito e in Canada
Prodotto da Mercodia AB Sylveniusgatan 8A SE-754 50 Uppsala
Stato normativo nel resto del mondo: Solo per ricerca.
Non per l’uso nelle procedure diagnostiche.
Spiegazione dei simboli usati sulle etichette
∑ = 96
Reagenti per 96 rilevazioni
Data di scadenza
Conservare tra i 2–8°C
Lotto n.
© Mercodia 2008-2021
Per l’uso diagnostico in vitro
Uso proposto
Mercodia MPO ELISA fornisce un metodo per la determinazione quantitativa di MPO nel plasma-EDTA.
Relazione e spiegazione del test
La mieloperossidasi (MPO), una glicoproteina contenente ferro, è un complesso tetramerico con legami covalenti e un peso molecolare di 150kDa. È composto da due catene alfa glicosilate con PM 59-64 kDa e due catene beta non glicosilate con PM 14 kDa. La MPO si trova in abbondanza nei granuli azzurrofili primari dei neutrofili ed è presente nei monociti.
In risposta a invasione microbica, la MPO è rilasciata dai granuli citoplasmatici dei neutrofili nel fagosoma e nello spazio extracellulare, catalizzando la conversione di perossido di idrogeno e ioni cloro (Cl-) in acido ipocloroso, un potente agente ossidante.
La mieloperossidasi è utilizzata normalmente come marcatore di infiammazioni delle vie aeree causate da asma o irritanti ambientali. Si ritiene che la MPO partecipi a diverse fasi dell'aterogenesi e abbia un ruolo potenziale nella promozione dell'aterosclerosi. L’associazione tra livelli elevati di MPO nel siero e la malattia coronarica (CAD) supporta il ruolo importante della MPO come marcatore infiammatorio nella CAD, rendendo possibile l’identificazione di pazienti a rischio di episodi cardiaci in assenza di necrosi del miocardio.
Principio di procedura
Mercodia MPO ELISA è un immunodosaggio enzimatico a due siti in fase solida.
Si basa sulla tecnica del sandwich diretto nella quale due anticorpi monoclonali sono diretti contro determinanti antigenici separati sulla molecola MPO.
Durante l’incubazione, la MPO nel campione reagisce con anticorpi anti-MPO coniugati a pozzetti di microtitolazione. Dopo il lavaggio, sono aggiunti gli anticorpi anti-MPO coniugati a perossidasi e dopo la seconda incubazione e un semplice lavaggio che rimuove gli anticorpi marcati degli enzimi non legati, il legame coniugato è rilevato tramite reazione con la 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina (TMB). La reazione è fermata mediante aggiunta di acido per dare un punto finale colorimetrico che è letto tramite spettrofotometria.
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Preacauzioni e avvisi
• Per l’uso diagnostico in vitro nell’UE/SEE, nel Regno Unito e in Canada. Non per uso interno o esterno nell’uomo o negli animali.
• Stato normativo nel resto del mondo: Solo per ricerca. Non per l’uso nelle procedure diagnostiche.
• Tutti i campioni dei pazienti devono essere manipolati come capaci di trasmettere infezioni.
• Ciascun pozzetto può essere usato una sola volta.
• La Stop Solution contiene <5% di acido solforico.
La Stop Solution è contrassegnata:
Pericolo
H315 – Provoca irritazione cutanea.
H318 – Provoca gravi lesioni oculari.
P280 – Indossare guanti/indumenti protettivi/Proteggere gli occhi/il viso.
P264 – Lavare accuratamente le mani dopo l’uso.
P302 + P352 + P362 + P364 – IN CASO DI CONTATTO CON LA PELLE: lavare abbondantemente con acqua e sapone. Togliersi di dosso gli indumenti contaminati e lavarli prima di indossarli nuovamente.
P332 + P313 – In caso di irritazione della pelle: Consultare un medico.
P305 + P351 + P338 + P310 – IN CASO DI CONTATTO CON GLI OCCHI:
Sciacquare accuratamente per parecchi minuti. Togliere le eventuali lenti a contatto se è agevole farlo. Continuare a sciacquare. Contattare immediatamente un CENTRO ANTIVELENI o un medico.
• Il Enzyme Conjugate Buffer, Cal 0, 1, 2, 3, 4, 5, il Wash Buffer, il Assay Buffer e il Sample Buffer contenente <0.06% 5-cloro-2-metil-4-isotiazolin-3-one e 2-metil-2H-isotiazol-3-one (3:1).
Il Enzyme Conjugate Buffer, i Calibrators, il Wash Buffer, il Assay Buffer e il Sample Buffer sono etichettati:
Attenzione
H317 – Può provocare una reazione allergica cutanea.
P280 – Indossare guanti protettivi.
P261 – Evitare di respirare i vapori.
P272 – Gli indumenti da lavoro contaminati non devono essere portati fuori dal luogo di lavoro.
P302 + P352 – IN CASO DI CONTATTO CON LA PELLE: Lavare abbondantemente con acqua e sapone.
P333 + P313 – In caso di irritazione o eruzione della pelle: Consultare un medico.
P501 – Smaltire il prodotto e il recipiente secondo ogni regolamento locale, regionale, nazionale e internazionale.
Materiali richiesti ma non inclusi
• Pipette con volumi adeguati (riutilizza le pipette in dotazione per l’aggiunta della Assay Buffer, soluzione enzyme conjugate 1X , Substrate TMB e Stop Solution)
• Provette, becher e cilindri per la preparazione di reagenti
• Provette per la diluizione dei campione
• Acqua ridistillata
• Agitatore magnetico
• Miscelatore di vortice
• Lettore micro piastra con 450 nm filtro
• Piastra dello shaker 700-900 giri/minuto, movimiento orbital
• Micro piastra piano di lavaggio con la funzione traboccare-lavare (consigliato ma non obbligatorio)
Reagenti
Ogni kit MPO ELISA contiene reagenti per 96 pozzetti, sufficienti per 42 campioni e una curva di calibrazione in duplicato. Per serie di analisi più ampie, usare reagenti provenienti da confezioni portanti identici numeri di lotto. La data di scadenza del kit completo è indicata sull’etichetta esterna. Si raccomanda di conservare a una temperatura di 2-8ºC.
Coated Plate 1 piastra 96 pozzetti Pronto all’uso Anticorpo monoclonale murino anti-MPO strisce da 8 pozzetti
Per le strisce di microtitolazione non utilizzate, sigillare nuovamente la confezione con nastro adesivo e utilizzare entro 2 mesi.
Calibrators 1, 2, 3, 4, 5 5 fiale 1000 μL Liofilizzato
Codificato con colore giallo Aggiungere 1000 μL
Concentrazione indicata sull’etichetta della fiala di acqua ridistillata Conservazione dopo la ricostituzione: 2-8°C per 2 mesi. a fiala
Per la conservazione di Calibrator ricostituiti per periodi superiori a 8 settimane, conservare a - 20°C.
Calibrator 0 1 fiala 1000 μL Pronto all’uso
Codificato con colore giallo
Sample Buffer 1 fiala 12 mL Pronto all’uso
Codificato con colore giallo
Assay Buffer 1 fiala 12 mL Pronto all’uso
Codificato con colore rosso
Enzyme Conjugate 11X 1 fiala 1.3 mL Preparazione, Anticorpo monoclonale murino anti-MPO vedi sotto coniugato a perossidasi
Enzyme Conjugate Buffer 1 fiala 13 mL Pronto all’uso Codificato con colore blu
Wash Buffer 21X 1 bottiglia 50 mL Diluire con 1000 mL Conservazione dopo la diluizione: di acqua ridistillata
2-8°C per 2 mesi per preparare la
soluzione di wash buffer 1X.
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Substrate TMB 1 bottiglia 22 mL Pronto all’uso
Soluzione incolore Nota! Sensibile alla luce!
Stop Solution 1 fiala 7 mL Pronto all’uso
0.5 M H2SO4
Preparazione di soluzione della enzyme conjugate 1X
Preparare la quantità necessaria della soluzione enzyme conjugate 1X con la diluizione dell’Enzyme Conjugate 11X (1+10) nell’Enzyme Conjugate Buffer o in base alla tabella sottostante. Mescolare lievemente. Quando si prepara la soluzione enzyme conjugate 1X per tutta la piastra, versare tutto l’Enzyme Conjugate Buffer nella fiala dell’Enzyme Conjugate 11X.
Numero di strisce Enzyme
Conjugate 11X Enzyme
Conjugate Buffer 12 strisce (una piastra)
8 strisce 4 strisce
1 fiala 700 μL 350 μL
1 fiala 7.0 mL 3.5 mL Conservazione dopo la diluizione: 2-8ºC per 2 settimane.
La raccolta e il trattamento del modello
Una considerazione importante nelle condizioni di manipolazione preanalitica è la prevenzione di rilascio artificiale di MPO da neutrofili nei campioni, che può portare a falsi risultati incrementati. Questo è particolarmente importante in quanto l’MPO ha mostrato potenziale come marcatore per la malattia coronarica essendo stato riportato un collegamento tra l’incremento delle concentrazioni di MPO circolante e l’incremento del rischio di malattia coronarica, l’incremento del rischio in pazienti con sindrome coronarica acuta e utilità clinica nell’identificazione e prognosi di pazienti con arresto cardiaco.
Concentrazioni di MPO più elevate nel plasma eparinato, plasma citrato e siero possono essere spiegate con un rilascio di MPO da neutrofili in vitro, e tale aumento è dipendente dal tempo a temperatura ambiente dopo il prelievo.
Si consiglia l’uso di plasma-EDTA per la misurazione di MPO perché i valori non sono confusi da un rilascio ex vivo poco controllabile di MPO da neutrofili e può quindi riflettere con maggiore precisione la concentrazione di MPO in circolo.
Plasma-EDTA
Il plasma-EDTA è il tipo di campione consigliato per le rilevazioni di MPO.
Prelevare il sangue mediante puntura endovenosa in provette contenenti EDTA come anticoagulante e separare la frazione del plasma con la centrifugazione.
Siero, plasma eparinato e plasma citrato
Siero, plasma eparinato e plasma citrato possono essere usati nell'analisi. Il siero o la presenza di eparina o citrato anticoagulante non compromettono la misurazione dell'analita. Tuttavia, quando si valutano i risultati devono essere considerati possibili effetti della manipolazione preanalitica.
Conservazione
I campioni di sangue in plasma-EDTA possono essere conservati per 1 ora a temperatura ambiente prima di essere centrifugati a 1500g per 10 min. Il plasma separato è analizzato direttamente oppure conservato congelato sotto i -20ºC fino all'analisi.
Diluizione dei campioni
Di norma, i campioni dovrebbero essere diluiti 1:5 (50 μL campione + 200 μL Sample Buffer) prima dell'analisi.
Procedura del test
Tutti i reagenti e i campioni devono essere portati a temperatura ambiente prima dell’uso. Preparare una calibratura curva per ciascuna serie di anilisi. Il prodotto è stato ottimizzato e validato senza utilizzare la pellicola sigillante.
1. Ricostituire Calibrator 1-5 con 1000 µL di acqua ridistillata per ogni fiala.
2. Preparare la soluzione enzyme conjugate 1X, la soluzione wash buffer 1X e i campioni.
3. Preparare un numero sufficiente di pozzetti di micropiastre per alloggiare i Calibrators, controles e campioni in duplicato.
4. Pipettare 25 µL di ogni Calibrator, controles e campione negli appositi pozzetti.
5. Aggiungere 100 µL di Assay Buffer ad ogni pozzetto.
6. Incubare in un agitatore di piastre (700-900 rpm) per 1 ora a temperatura ambiente (18-25°C).
7. Lavare 6 volte con 700 μL di soluzione wash buffer 1X a pozzetto utilizzando un lavapiastre automatico con funzione lavaggio overflow, dopo il lavaggio finale invertire e colpire la piastra con decisione sulla carta assorbente.
Nella procedura di lavaggio non utilizzare la funzione immersione.
Oppure manualmente:
Eliminare il volume di reazione capovolgendo la micropiastra su un lavabo.
Aggiungere 350 μL di soluzione wash buffer 1X a ogni pozzetto. Eliminare la soluzione wash, picchiettare con decisione più volte contro carta assorbente per rimuovere l'eccesso di liquido. Ripetere 5 volte. Evitare immersioni prolungate durante la procedura dilavaggio.
8. Aggiungere 100 µL di soluzione enzyme conjugate 1X a ogni pozzetto.
9. Incubare in un agitatore di piastre (700-900 rpm) per 1 ora a temperatura ambiente (18-25°C).
10. Lavare come descritto sopra.
11. Aggiungere 200 µL di Substrate TMB a ogni pozzetto.
12. Incubare in panchina per 15 minuti a temperature ambiente (18-25ºC).
13. Aggiungere 50 µL di Soluzione Stop a ogni pozzetto.
Mettere la piastra in un agitatore per circa 5 secondi per garantire la miscelazione.
14. Leggere la densità ottica a 450 nm e calcolare i risultati.
Effettuare la lettura entro 30 minuti.
Nota! Fare particolare attenzione a non contaminare il substrato TMB con la soluzione dell’enzima coniugato.
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Controllo di qualità interno
I pool di siero interni con basse, intermedie e alte concentrazioni di MPO devono essere analizzati periodicamente come campioni, e i risultati tracciati di giorno in giorno. È buona norma di laboratorio registrare i seguenti dati per ciascuna analisi:
numero di lotto del kit, date di ricostituzione dei componenti del kit, valori di DO per Calibrators e controlli.
I laboratori dovrebbero seguire le norme governative o i requisiti di accreditamento per la frequenza dei controlli di qualità.
Il calcolo dei risultati
Nota! Il Calibrator 0 (controllo negativo) non deve essere utilizzato nel calcolo della curva di calibrazione.
La concentrazione di MPO in campioni sconosciuti deve essere calcolata se possibile utilizzando la riduzione di dati computerizzata. Utilizzare le assorbanze ottenute in contrapposizione alle concentrazioni note di Calibrator 1-5 e l’analisi di regressione spline cubica per costruire la curva di calibrazione. Moltiplicare le concentrazioni di MPO calcolate per il fattore di diluizione (es. x5).
Esempio di foglio di calcolo
Pozzetti Identità A450 nm Conc. μg/L**
1A-B 1C-D 1E-F 1G-H 2A-B 2C-D 2E-F 2G-H 3A-B
Calibrator 0 Calibrator 1*
Calibrator 2*
Calibrator 3*
Calibrator 4*
Calibrator 5*
Campione 1 Campione 2 Campione 3
0.066/0.062 0.101/0.108 0.195/0.193 0.453/0.468 1.479/1.422 2.471/2.476 0.265/0.260 0.817/0.821 1.582/1.591
76 272 548 *Concentrazione indicata sull’etichetta della fiala
**Risultato moltiplicato per fattore di diluizione (x5)
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Esempio di una calibratura curva
La curva qui mostrata è una curva di calibrazione tipica. Non usare questa curva per determinare i risultati delle analisi reali.
Limitazioni della procedura
Come tutti i test diagnostici, una diagnosi clinica definitiva non deve essere basata sui risultati di un singolo test, ma dovrebbe essere effettuata dal medico in seguito alla valutazione di tutti i risultati clinici. I campioni lipemici, itterici o emolizzati non interferiscono con l’analisi.
Valori previsti
La buona pratica prevede che ogni laboratorio stabilisca il proprio intervallo di valori previsti.
MPO (μg/L)
OD 450 nm
Caratteristische e esecuzione Il limite della scoperta
Il limite di rivelabilità è definito come la Capacità di Rivelazione in base alla ISO11843-1. La Capacità di Rivelazione deve essere considerata parte di un metodo di verifica, piuttosto che la concentrazione minima misurabile.
Il limite di rivelabilità è inferiore alla concentrazione di Calibrator 1 determinata con la
metodologia descritta in ISO1183-Parte 4. La concentrazione per campioni con assorbanza inferiore al Calibrator 1 non dovrebbero essere calcolati, bensì espressa come inferiore o uguale (≤) alla concentrazione indicata sulla fiala per il Calibrator 1.
Effetto gancio
I campioni con una concentrazione fino a 30 000 µg/L sono stati testati senza fornire risultati bassi falsi.
Riacquisto
Il recupero all’aggiunta è 85%-96% (media 89%).
Il recupero alla diluizione è 97%-108% (media 101%).
Precisione
Ogni campione è stato analizzato in 4 repliche in 33 momenti diversi.
Variationskoeffizient Campioni Valore principale
µg/L Ripetibilità%* Interno di
laboratorio%**
1 2 3
11.58 34.93 119.21
4.4 3.0 3.1
9.9 8.6 5.5 *Variabilità intra-assay
**La variabilità totale della prova
Specificità
Sono state riscontrate le seguenti reazioni crociate:
Reazione incrociata
TPO ≤ 0.01%
CRP ≤ 0.01%
EPO 3.53%
Lisozima 0.03%
Elastasi 0.12%
Antitripsina alfa 1 ≤ 0.01%
12 Calibratura
Il kit MPO ELISA è calibrato in base a una preparazione di MPO commerciale, validata, altamente purificata. La concentrazione di mieloperossidasi è espressa in μg/L.
Garanzia
I dati sul rendimento presentati qui sono stati ottenuti usando le procedure indicate. Qualsiasi cambiamento o modifica nella procedura non raccomandata da Mercodia AB può avere effetti sui risultati, in tale caso Mercodia rinuncia a tutte le garanzie espresse, implicite o legali, inclusa la garanzia implicita di commerciabilità o idoneità per l’uso. Mercodia AB e i suoi distributori autorizzati, in tal caso, non saranno responsabili dei danni indiretti o consequenziali.
Riferimenti
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Current Atherosclerosis Reports 7:127-131
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Clin Biochem 42:149-1492
Shih J. et al. (2008) Effect of Collection Tube Type and Preanalytical Handling on Myleoperoxidase Concentrations. Clin Chem 54:6 1076-1079
Schindhelm RK. et al. (2009) Myeloperoxidase: a useful biomarker for cardiovascular disease risk stratification? Clin Chem 55:1462-1470
Ulteriori riferimenti sono disponibili sulla nostra pagina web: www.mercodia.com
*Non forniti Per tutti i dettagli vedere a pagina 8
Per assistenza tecnica contattare: support@mercodia.com Protocollo di sintesi Mercodia MPO ELISA
Aggiungere Calibrators, kontrolli* e
campioni 25 μL
Aggiungere Assay Buffer 100 μL
Incubare 1 ora a 18-25°C in agitatore di piastre
700-900 rpm Lavare piastra con soluzione wash
buffer 1X 700 µL, 6 volte
Aggiungere soluzione enzyme
conjugate 1X 100 μL
Incubare 1 ora a 18-25°C in agitatore di piastre
700-900 rpm Lavare piastra con soluzione wash
buffer 1X 700 µL, 6 volte
Aggiungere Substrate TMB 200 μL
Incubare 15 minuti a 18-25°C
Aggiungere Soluzione Stop 50 μL
Agitare per 5 secondi per garantire la miscelazione
Misurare A450 nm Valutare i risultati
31-3154 Version 12.0 2021-02-10
