L’utilizzo dell’HPLC ci ha consentito di individuare l’MPT in campioni di siero e di urine.

MPT

Un’accurata misurazione della funzionalità renale è di fondamentale importanza nella valutazione della progressione della insufficienza renale cronica e nella decisione di attuare una terapia di sostituzione della funzionalità renale (AS. Levely, 1990; R. Takahira, 2001). L’analisi comparativa del valore diagnostico della concentrazione nel siero e nelle urine del MPT è stata effettuata mediante HPLC.

L’utilizzo dell’HPLC ci ha consentito di individuare l’MPT in campioni di siero e di urine.

La quantificazione della molecola nei campioni è stata resa possibile grazie ad uno standard di MPT sintetizzato ed inviatoci dal professore Nishikawa (T. Nishikawa, 2006).

Una volta ricevuta la molecola, per prima cosa abbiamo costruito una curva di taratura dello standard fig. 1. considerando un range di concentrazione che va da 0,6 γ/ ml a 6 γ/ ml.

La concentrazione dello standard è stata determinata mediante spettofotometro . Conoscendo l’ἐ

molare del Trp = 4550 ed impostando lo strumento a 287, 5 nm. abbiamo potuto calcolare la

concentrazione mediante la legge di Lambert-Beer. L’ assorbanza è risultata essere di 0,301 da cui

la concentrazione espressa in molarità di 66 μM che equivalgono a 0,024 γ / λ.

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retta taratura y = 18723x - 295,3 R

= 0,9849

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000

0 0,2 0,4 0,6 0,8

concentrazione micrg/100 micrl

in te n s it à

Serie1

Lineare (Serie1)

Fig 1: retta di taratura dello standar.

Abbiamo individuato il tempo di ritenzione della molecola fig 2., come si può osservare dal grafico il tempi variano in un range compreso tra 16,45-16,99 min. le differenze che si osservano nei tempi di ritenzione dei vari picchi possono dipendere da variabili procedurali. Quindi una volta stabiliti i parametri necessari ad impostare l’analisi dei campioni, siamo passati alla valutazione della

concentrazione di MPT nei sieri e nelle urine dei pazienti presi in esame. Mediante un programma

di analisi dei dati Origin Pro8 abbiamo calcolato l’area dei picchi risultanti dalla elaborazione dei

dati ottenuti con l’HPLC di sieri ed urine e le abbiamo confrontate con il picco dello standard, a

concentrazione nota, presente allo stesso tempo di ritenzione. Abbiamo svolto l’analisi su 10

pazienti con diversa compromissione della funzionalità renale, in fig.3 a-b-c sono riportati 3 dei

grafici risultati dall’analisi del siero ed urine mediante HPLC.

Fig 2: in questo grafico possiamo vedere le curve ottenute da diverse concentrazioni di standard dalle quali è stato possibile determinare il tempo di ritenzione dell’MPT nelle condizioni

sperimentali.

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a

b

Fig.3: grafici dell’analisi mediante HPLC di siero(a) ed urine (b) la freccia indica il picco

dell’MPT.

Dai grafici emerge che siamo riusciti ad evidenziare l’MPT sia nel siero che nell’urina. Nelle urine

abbiamo individuato la molecola nell’89% dei campioni analizzati, nel plasma la percentuale è del

68%. Per verificare se questa differenza è dovuta ad un limite strumentale, lo studio continuerà

mediante analisi con spettrometria di massa.