I
RIASSUNTO
Lo sviluppo dell’occhio nei Vertebrati richiede una serie di eventi morfogenetici, quali l’iniziale specificazione della piastra neurale anteriore in “eye field”, la successiva evaginazione bilaterale delle vesicole ottiche e, infine, la determinazione dei diversi strati retinici e del cristallino. Gli eventi che portano alla formazione delle strutture oculari richiedono una serie di fattori implicati nel controllo del ciclo cellulare e nel differenziamento chiamati fattori di trascrizione del campo dell’occhio (EFTFs).
Fra questi un ruolo cruciale è svolto dal fattore di trascrizione Rx1 contenente un dominio
“homeobox” di tipo “paired-like”.
Nell’organismo modello Xenopus laevis, Xrx1 è espresso inizialmente, allo stadio di neurula precoce, nella regione proliferativa della piastra neurale anteriore, successivamente la sua espressione si localizza nelle vescicole ottiche e, a stadio di larva natante, nelle coppe ottiche, nel diencefalo ventrale e nella ghiandola pineale. Al termine del differenziamento retinico la sua espressione si localizza nei fotorecettori, in alcune cellule dello strato nucleare interno e nella regione proliferativa del margine ciliare (CMZ), dove è implicato nel mantenimento della staminalità dei progenitori retinici che permettono la rigenerazione durante tutta la vita dell’animale.
Nell’ambito dello studio dei geni regolati da questo fattore di trascrizione sono stati condotti esperimenti di aumento o diminuzione sperimentale dell’espressione di Xrx1 a stadio di neurula precoce e, utilizzando “microarray” commerciali “Genechip Xenopus laevis genome array” sono stati valutati i trascritti che aumentavano o diminuivano la loro espressione in seguito a queste variazioni. Tra questi sono stati selezionati 51 geni che mostravano un andamento “coerente” ossia che aumentavano o diminuivano la loro espressione durante l’attivazione funzionale di Xrx1 e si comportavano in maniera rispettivamente opposta a seguito della perdita di funzione.
Lo scopo del mio progetto di tesi è quello di caratterizzare il profilo di espressione e di validare i dati dei “microarrays” per alcuni di questi geni ricercando anche una possibile connessione funzionale con Xrx1
I primi ad essere stati analizzati sono dei geni ben noti per il loro coinvolgimento nello sviluppo e differenziamento muscolare. Tra questi il gene principale oggetto del mio studio è
II stato MyoD su cui ho condotto ibridazioni in situ su embrioni interi a stadi precoci di sviluppo e ibridazioni in situ su sezioni di retina completamente differenziata. L’espressione all’interno della retina è stata poi ricercata conducendo ibridazioni in situ su espianti oculari di vario genere. Al fine di aumentare ulteriormente la sensibilità dell’analisi, ho condotto RT-PCR ed infine Real Time PCR, che ho utilizzato anche per ricercare una eventuale relazione funzionale tra Xrx1 e myoD paragonando l’intensità dell’espressione di myoD tra embrioni di controllo ed embrioni sovraesprimenti Xrx1. Gli stessi esperimenti di RT-PCR e Real Time PCR sono state effettuati per gli altri geni del differenziamento muscolare: Mastr e Pri- mir133/1.
Nella seconda parte mi sono occupato di studi di espressione e funzionali di un altro gene
“coerente”: jhdm1D. Questo gene fa parte di una famiglia di istone demetilasi, enzimi coinvolti nel rimodellamento della cromatina e quindi nel controllo dell’espressione genica.
Gli studi di funzione sono stati condotti microiniettando sia l’mRNA di Xrx1, sia il morfolino capace di inibirne la traduzione. Sono stati infine condotte microiniezioni del messaggero del gene jhdm1D e lipofezioni dello stesso.
Le ibridazioni in situ non mostrano espressione del gene myoD all’interno dell’occhio, seppure in letteratura sia riportata l’espressione del gene nella retina di pollo e di un topo transgenico. Risultato positivo viene invece da Real Time PCR che mostrano espressione del gene in espianti di retina e documentano un aumento dei suoi livelli a stadio di neurula precoce a seguito della sovraespressione di Xrx1.
Il messaggero di jhdm1D invece si localizza perfettamente anche a livello della CMZ, in siti sovrapponibili all’espressione di Xrx1. Gli studi funzionali mostrano inoltre la capacità del morfolino contro Xrx1 di ridurre il dominio di espressione del gene in esame.
III
ABSTRACT
Vertebrate eye development needs a series of morphogenetic events, such as initial specification of the anterior neural plate as “eye field”, the following bilateral evagination of the optic vesicles and finally determination of the different retinal layers and the lens. The steps leading to formation of ocular structures need a number of factors involved in cell cycle regulation and differentiation called eye field transcription factors (EFTFs). Among them a crucial role is played by Rx1, a transcription factor containing a paired-like homeodomain.
In Xenopus laevis, Xrx1 is initially expressed, at early neurula stage, in the proliferative region of anterior neural plate, subsequently its expression is localized in optic vesicles and, at following stages, in optic cups, ventral diencephalon and pineal gland. At the end of retinal differentiation its expression is detected in photoreceptors, in some cells of the inner nuclear layer and in the proliferative region of the ciliary margin zone (CMZ), where it is involved in maintenance of stemness in retinal progenitors that allow rigeneration along all animal’s lifetime.
Previously in our lab, a microarray analysis was carried out by use of GeneChip Xenopus laevis genome arrays, to identify genes regulated by Xrx1. This technique allowed to identify
transcripts that changed their expression levels after overexpression or downregulation of Xrx1 in early neurulae. Among them, 51 genes, that displayed a coherent behaviour, were selected. These genes are upregulated in Xrx1 loss of function or viceversa.
The aim of my thesis project is to charaterize the expression pattern and validate the data from
“microarrays” for some of these genes, finding also possibly functional connections with Xrx1.
The first genes analyzed were known for their role in muscle development and differentiation.
Among them, the main gene was myoD on which I performed whole mount in situ hybridisation at early development stages and in situ hybridisation on completely differentiated retinal cryostat section.
The expression pattern within the retina was further refined by in situ hybridisation on ocular explants. To increase the sensitivity of the analysis I have performed RT-PCR and finally Real Time PCR that I have used also to find possibly functional connections between Xrx1 and myoD, comparing the intensity of the expression pattern of myoD, between wild type
IV embryos and embryos overexpressing Xrx1. The same experiments are performed for the others muscolar differentiation genes: Mastr e Pri-mir133/1.
In the second part I worked on the expression pattern and functional analysis of another coherent gene: jhdm1D.
This gene belongs to a hystone demethylase family, that are involved in chromatin remodeling and therefore in regulation of gene expression. Functional analysis was performed on embryos microinjected with either synthetic mRNA of Xrx1 or antisense morpholino oligonucleotides able to inhibit translation of jhdm1D. Finally, I performed microinjections of jhdm1D mRNA and lipofections of jhdm1D plasmids.
In situ hybridisation doesn’t reveal myoD expression in the eye, although, in literature, this
expression is reported in chiken retina and transgenic mouse. On the contrary, Real Time PCR detects gene expression in retinal explants and shows an expression increase in early neurula embryos following microinjection of Xrx1. jhdm1D mRNA, instead, perfectly localized within the CMZ, with a pattern similar to that of Xrx1.
Functional analysis also shows the ability of morpholinos directed against Xrx1 to reduce the expression pattern of jhdm1D.
