Data l’importanza della transizione G

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4. Discussione

La regolazione della proliferazione cellulare e la sua flessibilità in risposta alle esigenze risulta essere alla base del funzionamento corretto del compartimento staminale ematopoietico: in condizioni omeostatiche, le cellule staminali ematopoietiche risultano per il 75% in stato quiescente ed entrano in ciclo raramente per garantire l’integrità e il mantenimento del compartimento mediante la produzione costante di progenitori che provvedono al turnover giornaliero del sistema; in condizioni di stress ematologico entrano massivamente in ciclo e si espandono drammaticamente in modo da ricostituire il pool staminale eventualmente danneggiato (Weissmann et al. 2003; passegue’ et al. 2005). Questo peculiare comportamento proliferativo del compartimento staminale in relazione alle necessità dell’intero sistema di ripristinare un equilibrio richiede un fine controllo del ciclo cellulare e della sua progressione, soprattutto in relazione all’uscita della quiescenza e alla regolazione dell’ equilibrio tra self-renewal e differenziamento.

Data l’importanza della transizione G

/S nel controllo della proliferazione di una certa popolazione e il ruolo del complesso Ciclina E/Cdk2 nel superamento del punto di restrizione e nella progressione in fase, si è proceduto a definire il ruolo di ciclina E1 all’interno del compartimento staminale ematopoietico.

La caratterizzazione fenotipica del sistema ematopoietico di un topo costitutivamente privo di

ciclina E1 non rivela anomalie in condizioni stazionarie: non sono presenti difetti

ematopoietici macroscopici né a livello embrionale (Parisi et al.; 2003) né in età adulta, la

cellularità del midollo osseo in termini di cellule mononucleate risulta paragonabile a quella

di un topo wild-type e il profilo delle diverse popolazioni ematopoietiche presenti a livello

del sangue periferico e del compartimento midollare risulta complessivamente normale.

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A parte un lieve incremento dei linfociti B, infatti, la popolazione granulocitica, quella dei linfociti T e quella eritroide non presentano differenze significative tra wild-type e knock-out.

Anche per quanto riguarda il compartimento staminale midollare, il topo knock-out per ciclina E1 mostra un profilo in cui sia la popolazione staminale LSK che le sottopopolazioni relative alle LT-HSC, ST-HSC e MPPs non risultano distinguibili dal corrispettivo wild-type.

A completamento della descrizione del compartimento ematopoietico in condizioni di equilibrio, l’isolamento della popolazione dei progenitori mieloidi (CMP) e linfoidi (CLP) non ha rivelato alcuna differenza imputabile all’assenza di ciclina E1.

L’analisi del ciclo cellulare delle popolazioni staminali del midollo osseo, inoltre, mostra che gli indici di proliferazione relativi a LT-HSC, ST-HSC e MPP non presentano differenze significative del topo knock-out rispetto al wild-type.

Complessivamente, l’assenza di caratteri significativamente diversi a livello fenotipico e proliferativo del compartimento staminale ematopoietico di topi privi di ciclina E1 porta a concludere che in condizioni di steady-state la ciclina E1 non è criticamente coinvolta nell’ematopoiesi adulta né nella proliferazione delle popolazioni ematopoietiche staminali.

L’analisi funzionale del compartimento ematopoietico staminale in assenza di ciclina E1 è partita da un saggio in vitro per quantificare le cellule ematopoietiche primitive presenti nel midollo in base alla loro capacità clonogenica a lungo termine: il fenotipo emerso mostra che il midollo knock-out presenta una drammatica incapacità di formare colonie a lungo termine pur avendo, in base alla caratterizzazione fenotipica, una popolazione di cellule staminali paragonabile a quella del topo wild-type.

Non trascurabile è la particolare morfologia delle colonie formate dal midollo privo di ciclina E1: queste, al contrario delle colonie relative al midollo wild-type, risultano molto piu’

piccole e non presentano alcuna caratteristica di differenziamento, suggerendo un difetto

staminale nel processo di differenziamento.

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Dopo un tale fenotipo ottenuto in vitro, l’indagine è stata proseguita cercando di effettuare una caratterizzazione funzionale in vivo del compartimento staminale in assenza di ciclina E1, valutando l’efficienza di self-renewal del midollo knock-out rispetto a quello wild-type grazie ad un saggio di ripopolazione competitiva a lungo termine primario seguito da tre successivi trapianti seriali. Il saggio è stato ripetuto in due background murini differenti, un ceppo puro (BL6/C57) e uno misto (C57/129), ma i risultati ottenuti da entrambi gli approcci coincidono e mostrano un fenotipo ben definito: durante la prima ricostituzione il midollo knock-out presenta una capacità ripopolativa identica a quella del wild-type per cui entrambi contribuiscono in egual modo all’ematopoiesi; a partire dal secondo passaggio seriale si evidenzia un vantaggio ripopolativo del midollo privo di ciclina E1.

Infatti, mentre il midollo wild-type in conseguenza del ripetuto stress dovuto al trapianto progressivamente perde abilità ricostituiva, il midollo knock-out è caratterizzato da una maggiore efficienza di self-renewal e riesce a conservare il proprio potenziale ricostituivo anche dopo quattro passaggi seriali di ricostituzione a lungo termine.

Questo dato è confermato da quanto emerge dalla caratterizzazione del compartimento ematopoietico knock-out per ciclina E1 in conseguenza allo stress indotto dalla somministrazione di

5-fluorouracile, un potente agente citotossico.

Il 5-FU causa una deplezione mirata delle cellule in attiva proliferazione risparmiando la popolazione staminale che risulta largamente quiescente e provocando la sua drammatica espansione volta alla ricostituzione del sistema danneggiato.

L’analisi del compartimento ematopoietico del topo knock-out quattro giorni dopo la

somministrazione del 5-fluorouracile mostra un’espansione della popolazione staminale

LSKlow tre volte superiore rispetto a quella riscontrata nel topo wild-type.

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Per testare se questa espansione così evidente fosse dovuta ad un maggior incremento della proliferazione in assenza di ciclina E1, è stato caratterizzato il ciclo cellulare della popolazione LSKlow in seguito a trattamento con 5-FU.

Dall’analisi sono emersi indici di proliferazione assolutamente paragonabili tra knock-out e wild-type, che escludono che la ciclina E1 possa avere effetto sulla proliferazione della popolazione staminale ematopoietica in condizioni di stress e stabiliscono che l’espansione massiccia rilevata nel topo knock-out in conseguenza a 5-FU è dovuta ad maggiore self- renewal in condizioni di stress.

Concludendo, se in condizioni omeostatiche, l’assenza di ciclina E1 non è responsabile di alcun difetto ematopoietico e non risulta criticamente coinvolta né nell’ematopioiesi né nella normale proliferazione della popolazione staminale probabilmente anche a causa di un vicariamento funzionale effettuato dalla ciclina E2, in condizioni di stress mostra un ruolo specifico e cell-autonomous.

In assenza di ciclina E1, infatti, il compartimento staminale ematopoietico presenta una maggior capacità di self-renewal in condizioni di stress accompagnata da una difficoltà del processo di differenziamento.

Questa serie di evidenze sperimentali hanno portato a ipotizzare un possibile coinvolgimento

specifico della ciclina E1 nella regolazione dell’equilibrio tra self-renewal e differenziamento

del compartimento staminale ematopoietico.