Riassunto
Riassunto ii Durante lo sviluppo embrionale i tessuti neurali si originano a partire da progenitori multipotenti che necessitano di una regolazione integrata della proliferazione, dell’uscita dal ciclo cellulare e dell’attivazione di fattori coinvolti nel differenziamento cellulare.
La retina di Xenopus laevis è un modello ideale per lo studio della diversità cellulare poiché risulta costituita da sei principali tipi di neuroni (coni, bastoncelli, cellule orizzontali, cellule amacrine, cellule bipolari, cellule gangliari) e un tipo di cellula gliale (glia di Müller) che sono facilmente riconoscibili grazie alla loro morfologia e localizzazione negli strati retinici e che si originano a partire da un singolo strato di progenitori multipotenti, con una sequenza temporale ben definita e conservata evolutivamente.
In questo contesto, il destino cellulare è determinato dall’attivazione di geni specifici, tra cui i geni homeobox Xotx5 (fotorecettori), Xotx2 e Xvsx1 (cellule bipolari). L’attivazione di tali geni segue la successione temporale con la quale i relativi tipi cellulari retinici vengono generati. Recentemente è stato dimostrato che l’attivazione di questi geni è regolata a livello traduzionale: i tre geni sono trascritti in tutti i progenitori precoci ma sono tradotti solo nelle cellule destinate a differenziare nel corrispondente tipo retinico, fotorecettori o cellule bipolari (Decembrini et al., 2006). Tale controllo traduzionale sembra essere effettuato da fattori che riconoscerebbero segnali in cis sul 3’UTR dei messaggeri.
I principali fattori, noti in letteratura in grado di regolare la traduzione legando il 3’UTR dei messaggeri, sono le proteine che legano l’mRNA (RBP) e i microRNA (miRNA). Nel mio lavoro di tesi ho studiato il possibile ruolo regolativo di quattro miRNA, precedentemente individuati nel laboratorio di Biologia Cellulare del Dipartimento di Biologia, sui messaggeri dei geni homeobox Xotx2 e Xvsx1.
Riassunto iii
In primo luogo, per verificare se questi miRNA fossero effettivamente implicati nella repressione traduzionale dei trascritti Xotx2 e Xvsx1, ho condotto esperimenti di perdita di funzione, per mezzo di lipofezioni in vescicole ottiche di embrioni di Xenopus a stadio embrionale 17-18. In questi esperimenti ho co-lipofettato il vettore pCS2-GFP (per identificare le cellule trasfettate), con oligoribonucleotidi antisenso modificati chimicamente (Decoy), ognuno in grado di inibire un determinato miRNA.
Ho poi determinato le percentuali di cellule Xotx2 positive e Xvsx1 positive sul totale di cellule lipofettate utilizzando anticorpi contro le due proteine in esperimenti di immunostaining.
In secondo luogo, ho effettuato un esperimento complementare di guadagno di funzione, co-trasfettando nelle vescicole ottiche il vettore pCS2-GFP (per identificare le cellule lipofettate) e una miscela dei quattro miRNA (o un miRNA non correlato, come controllo) e successivamente determinando le percentuali di cellule Xotx2 positive e Xvsx1 positive sul totale di cellule lipofettate. Una parte di questi embrioni è stata trattata con una molecola in grado di allungare il ciclo cellulare delle cellule retiniche (ciclopamina) per verificare i possibili effetti della lunghezza del ciclo sulla regolazione dei due trascritti.
Infine, ho condotto un simile esperimento di guadagno di funzione e trattamento con ciclopamina, co-trasfettando questa volta la miscela di miRNA, il vettore pCS2-RFP, come standard interno, e un Sensore-GFP (vettore contenente il 3’UTR di uno dei due geni, clonato a valle della proteina fluorescente GFP). L'uso di tale sensore ha permesso di verificare, misurando il rapporto di espressione fra Sensore e standard interno, se effettivamente sussistesse l’interazione miRNA/3’UTR del trascritto.
Riassunto iv I risultati ottenuti mostrano come l’inibizione dei quattro miRNA, in generale, porti ad un forte incremento della percentuale delle cellule Xotx2 positive e, solo per due dei quattro, ad un incremento, un po’ più debole, delle cellule Xvsx1 positive. Se consideriamo poi i dati ottenuti dagli esperimenti di guadagno di funzione è possibile ipotizzare come tale repressione da parte dei miRNA, nei progenitori retinici precoci della retina in sviluppo, sia più forte per il trascritto Xotx2 rispetto a Xvsx1, confermando quanto descritto nel lavoro di Decembrini et al., 2006. Inoltre gli effetti della ciclopamina sembrano confermare l’implicazione del ciclo cellulare nel differenziamento dei progenitori retinici nei vari tipi cellulari della retina matura.
In conclusione, possiamo ipotizzare che il differenziamento delle cellule retiniche, in particolare delle cellule bipolari, sia sottoposto ad un evidente controllo traduzionale da parte di miRNA e che questi siano ampiamente influenzati dalla progressione del ciclo cellulare. Ciò nonostante alcuni dei risultati sembrano suggerire una possibile implicazione di altri miRNA, non identificati, o comunque di altri meccanismi di controllo che, cooperando, permettono il differenziamento della corretta proporzione di cellule bipolari. Possiamo quindi ipotizzare che i progenitori precoci, dividendosi rapidamente sotto l’influenza di stimoli proliferativi, come il segnale del fattore sonic hedgehog, mantengono alti i livelli di alcuni miRNA che inibiscono la traduzione di Xotx2, impedendo il loro differenziamento in cellule bipolari tardive.
