IL BIORISANAMENTO

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TIPI DI BIORISANAMENTO

UTILIZZO DI MICRORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI

L’utilizzo di OGM è una delle frontiere nel biorisanamento e può essere considerato il passo successivo rispetto al genetic bioaugmentation. Invece di fornire materiale genetico utile per la degradazione dello xenobiotico, le tecniche di ingegneria genetica e metabolica hanno reso possibile utilizzare direttamente microrganismi GM.

Peixoto et al. Microbial Enzymes 2011. Petroleum-Degrading Enzymes: Bioremediation and New Prospects.

Negli OGM l’aggiunta di geni codificanti per particolari enzimi, porta alla costruzione de novo di nuovi pathway catabolici e rende questi batteri capaci di biodegradare xenobiotici e di selezionarsi positivamente in un sito inquinato.

Un’alternativa che ha preso piede negli ultimi anni è anche quella del diretto utilizzo di enzimi immobilizzati.

LIMITI: PERICOLO DELLA GESTIONE

DEGLI OGM IN AMBIENTI NATURALI!

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QUALI SONO I LIMITI?

Ci sono fattori cruciali che limitano il biorisanamento. I batteri utilizzati devono:

• Essere in grado di degradare in maniera apprezzabile gli inquinanti di interesse.

• Essere attivi in-situ e in grado di svolgere la loro attività degradativa nelle specifiche condizioni ambientali del sito.

• Persistere nell’ambiente senza turbarne la biodiversità.

• Se geneticamente modificati devono avere sistemi di contenimento che ne prevenga la dispersione nell’ambiente.

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QUALI SONO I LIMITI?

Ci sono fattori cruciali che limitano il biorisanamento. I batteri utilizzati devono:

• Essere in grado di degradare in maniera apprezzabile gli inquinanti di interesse.

LIMITI:

• I batteri devono possedere le attività degradative necessarie. Ma spesso microrganismi impiantati hanno mostrato cinetiche di degradazione che differiscono da quelle osservate nei loro ambienti naturali.

• Spesso nei siti si osserva una scarsa biodisponibilità del contaminante all’azione degradativa dei microrganismi dovuta a scarsa solubilità: NAPL (non-aqueous phase liquid).

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QUALI SONO I LIMITI?

Ci sono fattori cruciali che limitano il biorisanamento. I batteri utilizzati devono:

• Essere attivi in-situ e in grado di svolgere la loro attività degradativa nelle specifiche condizioni ambientali del sito.

LIMITI:

• pH, temperatura, umidità, disponibilità di accettori di elettroni, di fonti di carbonio e di energia, influiscono sul periodo di acclimatazione dei microrganismi nell’ambiente e sulla loro efficacia come degradatori. • Spesso i siti inquinati sono ambienti multifasici con

caratteristiche chimico-fisiche variabili.

• La struttura e la concentrazione del contaminante hanno un grande effetto sulla fattibilità della bioconversione microbica.

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QUALI SONO I LIMITI?

Ci sono fattori cruciali che limitano il biorisanamento. I batteri utilizzati devono:

• Persistere nell’ambiente senza turbarne la biodiversità.

LIMITI:

• Il metabolismo dei microrganismi degradatori può indurre una variazione dei parametri ambientali o produrre metaboliti secondari tossici per gli stessi o per altri microrganismi presenti nell’ambiente.

• In alcuni casi è necessaria l’applicazione del co-metabolismo: nel caso in cui il composto non è direttamente una fonte di carbonio e di energia per il microrganismo degradatore, e dovrà prima essere modificato. In questo caso il controllo va esteso a più popolazioni microbiche.

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QUALI SONO I LIMITI?

Ci sono fattori cruciali che limitano il biorisanamento. I batteri utilizzati devono:

• Se geneticamente modificati devono avere sistemi di contenimento che ne prevenga la dispersione nell’ambiente.

LIMITI:

• Diverse strategie di ingegneria metabolica permettono di limitare la dispersione del microrganismo OGM nell’ambiente, ma sono tecniche che richiedono un continuo monitoraggio e spesso la somministrazione dall’esterno di specifici nutrienti per il ceppo OGM.

• Non si può essere certi dell’assenza totale di eventi di trasferimento genico orizzontale.

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QUALI SONO LE TECNICHE DI MONITORAGGIO?

Il biorisanamento è una procedura che deve essere adeguata alle condizioni sito-specifiche e richiede, in tutte le fasi, lo studio ed il monitoraggio accurato della diversità microbica presente. La

conoscenza delle variazioni delle

comunità microbiche durante il

biorisanamento è infatti ancora

limitata. Ci sono diverse metodiche

utilizzate per identificare i microrganismi per mezzo di marcatori molecolari.

Ghosal et al. Current State of Knowledge in Microbial Degradation of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs): A Review. Front Microbiol. 2016;7:1369

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QUALI SONO LE TECNICHE DI MONITORAGGIO?

Le più semplici sono le TECNICHE COLTURALI. Esse si basano sull’utilizzo di terreni differenziali con diversi nutrienti per la selezione ed amplificazione di alcune popolazioni microbiche eventualmente presenti al sito ambientale.

Questi terreni permettono spesso di evidenziare differenze morfologiche tra le colonie di diverse specie microbiche in base alle differenti reazioni metaboliche.

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QUALI SONO LE TECNICHE DI MONITORAGGIO?

Alla crescita dei microrganismi in laboratorio, spesso seguono i TEST BIOCHIMICI per valutare la presenza di alcune attività enzimatiche di interesse.

Test negativi

Test positivi

ONPG = β-galattosidasi, ADH = arginina diirdolasi, LDC = lisina decarbossilasi, ODC = ornitina decarbossilasi H2S = produzione H2S a partire da S2O3, URE = ureasi ecc..

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QUALI SONO LE TECNICHE DI MONITORAGGIO?

Approcci di

proteomica

basate su

tecniche di

spettrometria di

massa

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QUALI SONO LE TECNICHE DI MONITORAGGIO?

In ultima analisi, al posto di o insieme ai marcatori genetici, l’utilizzo di anticorpi può essere usata per verificare la presenza di specifiche proteine o marcatori di superficie sulle cellule. Si utilizzano a questo proposito anticorpi marcati con diversi fluorofori.

L’utilizzo del citofluorimetro a flusso consente poi lo screening veloce delle diverse popolazioni cellulari, ed è una tecnica sempre più utilizzata sia nella clinica che nella microbiologia ambientale.

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ESEMPI DI BIORISANAMENTO

I microrganismi più utilizzati

Co-substrati e pathway Metano, metanolo, propano AEROBIOSI Ammonio, nitrati AEROBIOSI Toluene, butano, fenolo AEROBIOSI Metanolo ANAEROBIOSI Glucosio, lattato, solfato, piruvato ANAEROBIOSI Esempi di enzimi e microrganismi Metano monoossigenasi, metanolo deidrogenasi, catecolo diossigenasi (Sphingomonas) Ammonia monoossigenasi (Nitrobacter, Nitrosomonas) Toluene monoossigenasi e diossigenasi (Rhodococcus, Pseudomonas) Alcol deidrogenasi (Pseudomonas, Sphingomonas, Streptomices) Dealogenasi, (Dehalococcus, Desulfovibrio, Clostridium, Geobacter) Contaminanti TCE, DCE, VC, IPA, PCB, idrocarburi alogenati TCE, DCE, VC, TNT TCE, DCE, VC,

BTEX, TCA PCE, TCE, VC, idrocarburi alogenati

BTEX, PCE, IPA, composti alogenati

I microrganismi più frequentemente utilizzati in applicazioni di biorisanamento appartengono agli ordini: Pseudomonas,

Sphingomonas, Rhodococcus, Mycobacterium, Methanogenes, Clostridium, Dehalococcus.

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I solventi clorurati, tipicamente, vengono scaricati nell’ambiente come liquidi organici puri o come miscele di liquidi organici. La maggior parte dei solventi clorurati è moderatamente solubile in acqua: ne consegue una tendenza a formare una fase liquida separata alla base dell’acquifero (DNAPL). I composti più solubili, con densità leggermente superiore rispetto a quella dell’acqua, riescono invece a scendere più lentamente verso gli strati più profondi e possono migrare, secondo la direzione di deflusso della falda.

Acque di falda

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ESEMPI : Idrocarburi alifatici alogenati (CAH)

Esempio di pathway di degradazione microbico de)l PCE a Cloruro di Vinile (VC), ed etano.

Il processo di attenuazione biologica dei solventi clorurati, partendo da composti come PCE e TCE, comprende:

• _{Ossidazione aerobica (diretta o co-metabolica);}

• Declorurazione riduttiva anaerobica (diretta o co-metabolica).

Nelle reazioni di tipo diretto, il microrganismo che media la reazione guadagna energia e si accresce a spese del CAH, che viene degradato o ossidato. Nelle reazioni di tipo co-metabolico, la degradazione o l’ossidazione del CAH è causata, in maniera aspecifica, da un enzima prodotto durante il metabolismo microbico (spesso aerobio) di un altro composto.

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Nell’ossidazione aerobica diretta i CAHs sono ossidati ad anidride carbonica, acqua, cloro ed elettroni, mentre l’ossigeno è ridotto ad acqua. I CAHs che possono essere ossidati direttamente in condizioni aerobiche includono: DCE (dicloroetilene); DCA (dicloroetano); VC (cloruro di vinile); CA (cloroetano); MC (diclorometano); CM (clorometano).

QUESTE SONO EFFETTUATE DA MICRORGANISMI AEROBI AMBIENTALI UBIQUITARI COME

Pseudomonas e Sphingomonas. à Si agisce su questi con

BIOSTIMULATION.

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Nell’ossidazione aerobica co-metabolica i CAHs sono ossidati da un enzima prodotto durante il metabolismo microbico di un altro composto. I donatori di elettroni includono metano, etano, etene, propano, butano, idrocarburi aromatici e ammoniaca. Una monoossigenasi media la reazione di donazione di elettroni. I CAHs che possono essere ossidati per via co-metabolica in condizioni aerobiche includono: TCE (tricloroetilene); DCE (dicloroetilene); VC (cloruro di vinile); TCA (tricloroetano); DCA (dicloroetano); CF (cloroformio); MC (diclorometano)

QUESTE SONO EFFETTUATE DA MICRORGANISMI AEROBI AMBIENTALI UBIQUITARI COME Pseudomonas e

Sphingomonas. à Si agisce su questi con

BIOSTIMULATION.

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Nella declorurazione riduttiva anaerobica (diretta e co-metabolica) i batteri guadagnano energia e crescono mentre uno o più atomi di cloro sono sostituiti da idrogeno. Il composto clorurato funge da accettore di elettroni, mentre l’idrogeno da donatore diretto di elettroni. La declorurazione riduttiva può avvenire, in teoria, sotto la maggior parte delle condizioni anaerobiche, ma sembra che quelle più efficaci siano quelle solfatoriducenti e metanogeniche.

Il processo è mediato da specifici gruppi di microrganismi (batteri): Dehalobacter restrictus (in grado di degradare PCE e TCE a DCE); Dehalococcoides ethenogenes (in grado di consentire il passaggio da DCE a VC e a Etilene).

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Ci sono numerosi esempi di applicazioni di biorisanamento da CAH portate avanti, soprattutto negli Stati Uniti.

Engineered Approaches to In Situ

Bioremediation of Chlorinated Solvents:

Fundamentals and Field Applications. United States Environmental Protection Agency

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Engineered Approaches to In Situ Bioremediation of Chlorinated Solvents: Fundamentals and Field Applications. United States Environmental Protection Agency

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ESEMPI DI BIORISANAMENTO: IPA

Ci sono molti esempi descritti di approcci di biorisanamento per idrocarburi policiclici aromatici. Sono descritti sia approcci in situ che ex situ e sia

di Biostimulation che di Bioaugmentation. La maggior parte riguardano la degradazione dei composti utilizzando il metabolismo di batteri

aerobi come Pseudomonas e Sphingomonas.

Ceppi ambientali di questi batteri sono in grado di crescere utilizzando gli IPA come fonte di carbonio ed energia (approccio metabolico diretto). Ciò avviene grazie ad un’ampia varietà di enzimi ad attività mono- e diossigenasica in grado di degradare lo scheletro dei composti aromatici.

Ciclo di Krebs

Primo stadio:

ATTIVAZIONE dell’anello aromatico

X OH

OH X

Benzene e

derivati diossidrilati Composti

(catecoli)

Upper pathway

Mono- e diossigenasi

Secondo stadio:

APERTURA dell’anello aromatico

OH OH Prodotto di apertura dell’anello Lower pathway Composti diossidrilati (catecoli) X Diossigenasi ring-cleavage Biomassa + energia

COOH COOH O H OH H CH3 OH OH OH CH3 OH OH OH OH C H3 OH . C H3 COOH CHO OH COOH CO OH C H3 COOH CHO OH C H₃ benzene toluene o-, m-, p-cresol phenol

catechol 3-methylcatechol 4-methylcatechol

CH3

OH OH H H

cis, cis-muconic acids cis-muconic semialdehydes Benzoic acid DO Dehydrogenase MO MO MO MO DO MO MO MO COOH COOH . C H₃ COOH COOH C2,3O (extradiol) C1,2O (intradiol) acetate acetaldehyde + pyruvic acid acetyl-CoA + succinate uppe r pa thw ay s lo we r p at h wa ys H O H OH H cis-dihydrodiol DO Cis-dihydrodiol Cis-dihydrodiol Dehydrogenase Dehydrogenase

Gli upper pathways convergono verso la formazione di un numero

limitato di catecoli

Questo tipo di “assetto metabolico” favorisce la

combinazione di diversi upper pathway ampliando

cosi’ la gamma di inquinanti che possono

essere degradati dai batteri!!! Ortho -pathw ay Me ta-pa thw_ay

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ESEMPI DI BIORISANAMENTO: IPA

Bewley and Webb (2001) hanno descritto un approccio di biorisanamento in situ, di una falda acquifera contaminata con IPA, BTEX. È stata utilizzata una procedura di:

• _{Biostimulation, fornendo urea,} ammonio solfato e nitrato di sodio alla flora batterica autoctona, insieme a surfattanti in grado di solubilizzare i composti aromatici, e:

• _{Bioaugmentation utilizzando un mix} commercialmente disponibile di batteri in grado di degradare IPA (PHENOBAC, Microbac Ltd, Durham). In 2 anni di trattamento la presenza di IPA si è ridotta del 92%

Bewley R. et al. In situ bioremediation of groundwater contaminated with phenols, BTEX and PAHs using nitrate as electron acceptor. Land Contamination & Reclamation 9(4). 2001.

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UNO STUDIO DI BIORISANAMENTO: Novosphingobium sp. PP1Y

Diesel oil drop

Free cells

Il microrganismo Novosphingobium puteolanum PP1Y è stato isolato da un sito contaminato da IPA nel porto di Pozzuoli e caratterizzato.

• È un membro degli Sfingomonadali

• In grado di crescere utilizzando un ampio range di IPA come fonte di C ed energia.

• _{L’analisi del suo genoma ha rivelato una} grande abbondanza di geni codificanti per:

• Mono- e diossigenasi • Glicosil-idrolasi

Infatti il ceppo ha pathway metabolici specializzati per la degradazione degli idrocarburi aromatici, e sintesi di un ampio

range di polisaccaridi. Notomista E. et al. The Marine Isolate Novosphingobium sp. PP1Y ShowsSpecific Adaptation to Use the Aromatic Fraction of Fuels as the Sole Carbon and Energy Source. Microbial Ecology 61, 582–594 (2011).

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Sono stati effettuati esperimenti di bioremediation in laboratorio, creando microcosmi, cioè microambienti di suolo a condizione controllate costituiti da terreno, fenenantrene per simulare l’inquinamento da IPA e cellule PP1Y come degradatori.

I grafici di degradazione del phenantrene dimostrano che il batterio è stato in grado di mineralizzare il phenanthrene in circa 50 ore quando fornito in acetone e ca. 150 quando disciolto in paraffine.

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Le capacità degradative sono state poi studiate in presenza di una miscela di inquinanti costituita da fenentrene, 2,6 dimetilnaphtalene e pirene. In questo caso PP1Y ha mostrato di essere in grado di degradare il componenti del mix a velocità comparabili con quelle osservate per i singoli idrocarburi. In particolare PP1Y ha dimostrato di degradare più del 50% di fenantrene e di 2,6 dimetilnaphtalene in circa 40 ore.

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UNO STUDIO DI BIORISANAMENTO: Novosphingobium sp. PP1Y

Sono stati effettuati test delle capacità degradative anche con un suolo naturale urbano inquinato da IPA e altri xenobiotici e in cui sono presenti altri microrganismi.

Nel campione in cui è stato aggiunto il PP1Y la degradazione del fenantrene è più veloce rispetto a quella del controllo non bioaumentato. Il ceppo PP1Y è quindi in grado di degradare substrati aromatici con velocità comparabili con quelle dei precedenti esperimenti, adattandosi alla matrice di suolo naturale e ai microorganismi endogeni presenti.

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Infine le capacità degradative del ceppo PP1Y sono state analizzate sia in mezzo liquido sia in microcosmi, microambienti di suolo.

I risultati hanno evidenziato che la velocità di degradazione del fenantrene sembra essere maggiore nei microcosmi rispetto ai sitemi liquidi.

Questi risultati rendono il ceppo

PP1Y molto promettente per

approcci di Bioaugmentation di suoli contaminati da IPA.

BIORISANAMENTO DA

CROMO MEDIANTE

UTILIZZO BATTERI

DEL GENERE

Desulfovibro

.

BIOTECNOLOGIE PER UNA CHIMICA

SOSTENIBILE Fabio W. K. Bolos

IL CROMO È UN METALLO

LARGAMENTE IMPIEGATO NELLE

INDUSTRIE PER:

Galvanotecnica

Industria delle vernici

Gli stati di ossidazione stabili del cromo sono:

•

Cr (III)

• nutriente cellulare essenziale in alcuni processi metabolici, in tracce. • Effetti negativi in alte concentrazioni.

•

Cr (VI)

• Fortemente solubile in acqua e mobile.

RIDUZIONE DEL CROMO ESAVALENTE

METODI CHIMICO-FISICO

METODO

BIOTECNOLOGICO

A causa del suo largo impiego e della sua elevata tossicità è dimportante ridurre il Cr(VI) a Cr(III) in quanto meno dannoso.

Meccanismi di

trasporto del

cromato

Desulfovibrio vulgaris

´ Microrganismo Gram-negativo ´ Anaerobio obbligato, SRB

´ Usano un composto organico o H₂ come donatore di elettroni

´ SO₄2- _{come accettore di elettroni}

´ Cr(VI) come accettori di elettroni al posto del solfato

CONDIZIONI DI CRESCITA

•

donatore di elettroni aggiuntivi e ligando complessante per

Cr

_(Lattato)

•

Accettore di elettroni (prima solfato poi cromato)

•

tampone (MOPS pH 7)

•

cellule mantenute nel mezzo C di Postgate sotto N

privo di O

(OFN) a T 30°C

IDROGENASI [Ni-Fe]

•

Le idrogenasi [NiFe], isolate, catalizzano

sia l’evoluzione sia l'assorbimento di H

,

tramite l'azione di citocromi multi-eme a

basso potenziale quali il citocromo

c

, che

agiscono sia come donatori sia come

accettori di elettroni, a seconda del loro

stato di ossidazione. In generale, tuttavia,

le idrogenasi [NiFe] sono più attive

´

citocromo c3 come trasportatore di elettroni.

´

l'attività della idrogenasi cromo riduttasi deriva dalla riduzione diretta

IDROGENASI [Ni-Fe]

Le tre possibili strutture del legame H

sul sito Ni-Fe

A. sull'atomo di Ni,

B. a ponte tra Ni e Fe

C. sull'atomo di Fe.

CITOCROMO-c3

IDROGENASI

• catalizza la seguente reazione: 2 H₂ + ferricitocromo c₃ ⇄ 4 H+ ₊ ferrocitocromo c₃

• numerosi gruppi eme con potenziali redox estremamente negativi,

aventi quindi un alto tasso di trasferimento di elettroni.

• permette il passaggio degli elettroni tramite l'oscillazione del ferro dalla forma ferrica Fe3+ _{(ossidata) alla} forma ferrosa Fe2+ _(ridotta).