PSEUDOMONAS AERUGINOSA

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

VETERINARIJOS AKADEMIJA

Veterinarijos fakultetas

Vaida Sutkevičiūtė

PSEUDOMONAS AERUGINOSA IŠSKYRIMAS IŠ ŠUNŲ

AUSŲ IR ATSPARUMO ANTIMIKROBINĖMS

MEDŢIAGOMS NUSTATYMAS

PSEUDOMONAS AERUGINOSA ISOLATION FROM THE

EARS OF DOGS AND DETERMINATION OF ITS

RESISTANCE TO ANTIMICROBIAL AGENTS

Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų

Darbo vadovė: Prof. dr. Jūratė Šiugţdaitė

2

DARBAS ATLIKTAS UŢKREČIAMŲJŲ LIGŲ KATEDROJE PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ

Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Pseudomonas aeruginosa išskyrimas iš šunų

ausų ir atsparumo antimikrobinėms medţiagoms nustatymasˮ.

1. Yra atliktas mano paties/pačios;

2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir uţsienyje;

3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŢ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DĖL DARBO GYNIMO

(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE/KLINIKOJE

(aprobacijos data) (katedros/klinikos vedėjo/jos vardas, pavardė)

(parašas)

Magistro baigiamojo darbo recenzentas

(vardas, pavardė) (parašas)

Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:

(data) (gynimo komisijos sekretorės (-riaus) vardas, pavardė) (parašas)

Magistro baigiamasis darbas yra įdėtas į ETD IS

3

TURINYS

1.1. P. aeruginosa sukeliamas išorinės ausies uţdegimas ... 10

1.2. P. aeruginosa struktūra, genomas ir patogeniškumo veiksniai ... 13

1.3. P. aeruginosa atsparumas antimikrobinėms medţiagoms ... 16

1.3.1. P. aeruginosa bioplėvelės formavimo mechanizmas ... 16

1.3.2. P. aeruginosa atsparumo β−laktaminiams antibiotikams mechanizmas ... 17

1.3.3. P. aeruginosa atsparumo aminoglikozidams mechanizmas ... 18

1.3.4. P. aeruginosa atsparumo fluorochinolonams mechanizmas ... 18

1.3.5. P. aeruginosa atsparumas polimiksinams ... 20

1.4. P. aeruginosa – bakterijų atsparumo fenomenas ... 20

1.5. P. aeruginosa infekcijų gydymo alternatyvos ... 21

2. TYRIMO METODIKA IR ORGANIZAVIMAS ... 23

2.1. Įvairių veiksnių įtaka P. aeruginosa išskyrimui iš šunų ausų ... 23

2.2. P. aeruginosa identifikavimas ... 25

2.3. P. aeruginosa atsparumo antimikrobinėms medţiagoms nustatymas ... 27

2.4. Statistinių duomenų analizė ... 29

3. REZULTATAI ... 30

3.1. Mikroorganizmų išskyrimas iš kliniškai sveikų šunų ausų ... 30

3.2. Įvairių veiksnių įtaka P. aeruginosa išskyrimui iš kliniškai sveikų šunų ausų ... 31

3.2.1. Lyties įtaka P. aeruginosa išskyrimui iš kliniškai sveikų šunų ausų ... 31

3.2.2. Amţiaus įtaka P. aeruginosa išskyrimui iš kliniškai sveikų šunų ausų ... 32

3.2.3. Veislės įtaka P. aeruginosa išskyrimui iš kliniškai sveikų šunų ausų ... 32

3.3. Mikroorganizmų išskyrimas iš kliniškai sergančių šunų ausų ... 34

3.4. Įvairių veiksnių įtaka P. aeruginosa išskyrimui iš kliniškai sergančių šunų ausų ... 35

4

3.4.2. Amţiaus įtaka P. aeruginosa išskyrimui iš kliniškai sergančių šunų ausų ... 36

3.4.3. Veislės įtaka P. aeruginosa išskyrimui iš kliniškai sergančių šunų ausų ... 36

3.5. P. aeruginosa atsparumo antimikrobinėms medţiagoms nustatymas ... 37

4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 40

IŠVADOS ... 42

PADĖKA ... 43

5

SANTRAUKA

Darbo autorius − Vaida Sutkevičūtė

Darbo vadovas − Prof. dr. Jūratė Šiugţdaitė

Darbo tema: „Pseudomonas aeruginosa išskyrimas iš šunų ausų ir atsparumo antimikrobinėms medţiagoms nustatymas”. Tyrimas atliktas 2013 – 2014 metais Lietuvos sveikatos mokslų universitete, Uţkrečiamųjų ligų katedroje, mikrobiologijos laboratorijoje. Darbo apimtis – 47 puslapiai, jame pateiktos 6 lentelės ir 10 paveikslų.

Darbo tikslas − išskirti P. aeruginosa iš šunų ausų bei nustatyti išskirtų padermių atsparumą antimikrobinėms medţiagoms.

Darbo uţdaviniai:

1. Išskirti P. aeruginosa iš kliniškai sveikų ir sergančių šunų ausų.

2. Įvertinti lyties, amţiaus ir veislės įtaką P. aeruginosa išskyrimui kliniškai sveikų šunų grupėje.

3. Įvertinti lyties, amţiaus ir veislės įtaką P. aeruginosa išskyrimui kliniškai sergančių šunų grupėje.

4. Nustatyti P. aeruginosa atsparumą antimikrobinėms medţiagoms kliniškai sergančių šunų grupėje.

Tyrimo metu paimti 88 mėginiai iš šunų ausų. Iš jų 49 mėginiai paimti iš kliniškai sveikų šunų ausų ir 39 mėginiai iš šunų ausų, kuriems pasireiškė klinikiniai išorinės ausies uţdegimo poţymiai.

Atlikus tyrimus nustatėme, kad iš 49 mėginių, paimtų iš kliniškai sveikų šunų ausų, P.

aeruginosa išskirta 14 (41,18 proc.) mėginių. Iš 39 mėginių, paimtų iš kliniškai sergančių šunų ausų, P. aeruginosa išskirta 20 (43,47 proc.) mėginių.

Įvertinus lyties, amţiaus ir veislės įtaką P. aeruginosa išskyrimui kliniškai sveikų šunų grupėje, įtakos turėjo lytis (p<0,05), tačiau nei amţius, nei veislė P. aeruginosa išskyrimui įtakos neturėjo. Įvertinus lyties, amţiaus ir veislės įtaką P. aeruginosa išskyrimui kliniškai sergančių šunų grupėje, nei lytis, nei amţius, nei veislė įtakos neturėjo.

P. aeruginosa padermės, išskirtos iš kliniškai sergančių šunų ausų, pasiţymėjo daugybiniu

atsparumu − buvo atsparios amoksicilinui (100,0 proc.), ampicilinui (100,0 proc.), tylozinui (100,0 proc.), fuzidino rūgščiai (100,0 proc.), penicilinui G (100,0 proc.) bei tetraciklinui (100,0 proc.). P.

aeruginosa jautrios buvo gentamicinui (65,0 proc.) ir enrofloksacinui (35,0 proc.).

Raktiniai ţodţiai: Pseudomonas aeruginosa, otitis externa, šuo, genomas, antimikrobinės

6

SUMMARY

The author of the work − Vaida Sutkevičūtė Scientific adviser − Prof. dr. Jūratė Šiugţdaitė

Subject of the work: „Pseudomonas aeruginosa isolation from the ears of dogs and determination of its resistance to antimicrobial agents”. Research was made in the Microbiology Laboratory, Department of Infectious Diseases, Lithuanian University of Health Sciences, in 2013-2014. The length of the work is 47 pages, the work includes 6 tables and 10 pictures.

The aim of the work is to excrete P. aeruginosa from the ears of dogs and to determine

resistance of excreted stock to antimicrobial materials. Tasks of the work:

1. To excrete P. aeruginosa from the ears of dogs being clinically healthy and ill.

2. To assess the impact of gender, age and breed to P. aeruginosa secretion in the group of clinically healthy dogs.

3. To assess the impact of gender, age and breed to P. aeruginosa secretion in the group of clinically ill dogs.

4. To determine P. aeuruginosa resistance to antimicrobial materials in the group of clinically ill dogs.

88 samples from the ears of dogs were taken during the research. 49 samples were taken from clinically healthy dogs and 39 samples from ears of those dogs that faced clinical symptoms of auricular inflammation.

Having made the analysis we determined that P. aeruginosa was excreted in 14 samples out of 49 taken from ears of clinically healthy dogs (41.18 pct.). P. aeruginosa was excreted in 20 samples out of 39 (43.47 pct.) taken from ears of clinically ill dogs.

Having assessed the impact of gender, age and breed, gender influenced P. aeruginosa secretion in the group of clinically healthy dogs (p<0,05), however, neither age nor gender had impact on P.

aeruginosa secretion. Having assessed the impact of gender, age and breed on P. aeruginosa secretion

in the group of clinically ill dogs, gender, age and breed did not have any impact on it.

P. aeruginosa stocks, excreted from ears of clinically ill dogs, are characterized in multiple

resistance – they were resistant to amoxicillin (100.0 pct.), ampicillin (100.0 pct.), tylozine (100.0 pct.), fusidic acid (100.0 pct.), penicillin G (100.0 pct.) and tetracycline (100.0 pct.). P. aeruginosa were sensitive to gentamicin (65.0 pct.) and enrofloxacin (35.0 pct.).

7

SUTRUMPINIMAI

angl. – angliškai

DNR − deoksiribonukleorūgštis

E. coli – Esherichia coli

EPM − ekstraceliulinės polimerinės medţiagos

G+C kiekis – guanino arba citozino nukleobazių procentinė dalis DNR arba RNR molekulėje Gram− gramneigiamos bakterijos

Gram+ gramteigiamos bakterijos

IKE – integriniai ir konjugaciniai elementai iRNR – informacinė RNR

KSV/g – kolonijas sudarantis vienetas viename grame tiriamosios medţiagos Lac− laktozės neskaidančios bakterijos

Lac+ laktozę skaidančios bakterijos liet. − lietuviškai

LPS – liposacharidai

MIC − minimali slopinanti koncentracija mm − milimetras

O antigenas – somatinis antigenas p – tikimybė

P. aeruginosa – Pseudomonas aeruginosa

pav. − paveikslas

pH − vandenilio jonų (H+

) koncentracijos tirpale matas, parodantis tirpalo rūgštingumą ar šarmingumą RNR − ribonukleino rūgštis

rRNR – ribosominė RNR

S. aureus – Staphylococcus aureus

S. intermedius – Staphylococcus intermedius

S. pseudointermedius – Staphylococcus pseudointermedius

spp. – rūšys

TPD – metil – para – fenileno – diamino − dihidrochlorido tirpalas μm – mikrometras

8

ĮVADAS

Ţinoma, kad šunų ausų infekcijos yra tarp 10 daţniausių apsilankymo pas veterinarą prieţasčių. Manoma, kad jos gali pasireikšti daugiau nei 20 proc. šunų (Petrov et al., 2013). Ir nors sukaupta nemaţai ţinių apie įvairias ausų infekcijas šunims, jiems daţniausiai diagnozuojamas išorinės ausies uţdegimas (Turkyilmaz, 2006).

Išorinės ausies uţdegimo prieţastys labai įvairios: polinkis sirgti ausų ligomis dėl ausų anatominės struktūros, drėgmės susilaikymas, netinkama ausų prieţiūra ar netaisyklingai atliktos manipuliacijos, ilgas gydymas antibiotikais, obstrukcines ar sisteminės ligos (Petrov at al., 2013). Dėl šių prieţasčių padidėja uţdegiminio eksudato gamyba, kinta ausies sieros pH, dėl to sukuriama palanki terpė bakterijoms patekti ir vystytis, ypač P. aeruginosa (Degi et al., 2010). Ir nors išorinės ausies uţdegimas nėra pavojinga liga, P. aeruginosa sukeltų infekcijų gydymas gali būti ilgas ir varginantis tiek gyvūnui, tiek jo šeimininkui (Turkyilmaz, 2006).

Kaip ţinoma, P. aeruginosa yra oportunistinis ţmonių ir gyvūnų patogenas. Ši bakterija labai retai infekuoja sveikus audinius, dėl šios prieţasties turi būti paţeistas apsauginis audinių barjeras (Paterson, 2012).

P. aeruginosa puikiai ţinomos dėl jų tolerancijos, gebėjimo aktyviai pasipriešinti įvairiems

toksiškiems junginiams, įskaitant ir antibiotikus (Cornelis, 2008). Šiam atsparumui įgyti P. aeruginosa panaudoja beveik visus ţinomus enzimų ir mutacijos mechanizmus. Daţnai šie mechanizmai veikia vienu metu, taip papildydami vienas kitą ir suteikdami atsparumą kitoms padermėms (Strateva, Yordanov, 2009). Dar vienas bruoţas, padedantis išskirti P. aeruginosa iš kitų padermių – sideforinių junginių – pioverdino ir piocianino gamyba (El−Fouly et al., 2014). Būtent dėl įvairių atsparumo mechanizmų, fermentų gamybos bei bioplėvelės formavimo, P. aeruginosa atsparumas antimikrobinėms medţiagoms vis didėja (Harper, Enright, 2011). Todėl P. aeruginosa apibūdinama kaip „bakterijų atsparumo fenomenasˮ (Strateva, Yordanov, 2009).

Pagal Degi et al. (2010), P. aeruginosa atsparumas antimikrobinėms medţiagoms yra didelė problema. Dėl šios prieţasties, prieš pasirenkant gydymą, labai svarbu nustatyti P. aeruginosa atsparumą antimikrobinėms medţiagoms. Atsparumo antimikrobinėms medţiagoms stebėsena gali padėti nustatyti efektyviausią tam tikros vaistų grupės medţiagą tam tikrai gyvūnų rūšiai (Hariharan et al., 2009). Ir nors ši bakterija vaidina labai svarbų vaidmenį šunų išorinės ausies uţdegimo atvejais, tikslus bakterijų identifikavimas gydymo pradţioje yra esminis problemos sprendimo kriterijus (Degi et al., 2010).

9

Šio darbo tikslas – išskirti P. aeruginosa iš šunų ausų bei nustatyti išskirtų padermių

atsparumą antimikrobinėms medţiagoms.

Darbo uţdaviniai:

1. Išskirti P. aeruginosa iš kliniškai sveikų ir sergančių šunų ausų.

2. Įvertinti lyties, amţiaus ir veislės įtaką P. aeruginosa išskyrimui kliniškai sveikų šunų grupėje.

3. Įvertinti lyties, amţiaus ir veislės įtaką P. aeruginosa išskyrimui kliniškai sergančių šunų grupėje.

4. Nustatyti P. aeruginosa atsparumą antimikrobinėms medţiagoms kliniškai sergančių šunų grupėje.

10

1. LITERATŪROS APŢVALGA

1.1. P. aeruginosa sukeliamas išorinės ausies uţdegimas

Išorinės ausies uţdegimu (Otitis externa) vadinamas ausies tūtelės odos uţdegimas. Išorinės ausies uţdegimu gana daţnai serga šunys, rečiau − katės. Uţdegimas skatina ausies sieros ir uţdegiminio eksudato gamybą, tai sudaro palankią terpę bakterijoms. Lanksti kremzlė dėl uţdegimo kalcifikuojasi ir sutrikdo ausies drenaţą. Vertikalusis bei horizontalusis ausies kanalai dar labiau susiaurėja, sunkiau nuteka uţdegiminis skystis. Ilgai trunkanti liga sąlygoja uţdegimo apimtos odos, dengiančios ausį, sustorėjimą bei vidurinės ausies uţdegimą (Biţokas ir kt., 2008).

Ausies uţdegimą sukelia daugybė prieţasčių, kurios skirstomos į predisponuojančias, pirmines ir antrines. Predisponuojantys veiksniai didina išorinės ausies uţdegimo riziką ir ausį padaro imlesnę infekcijai. Šiems veiksniams priskiriama anatominė ausų stuktūra (per daug nulėpusios, siauras ausies kanalas, padidėjęs jautrumas išorinėje ausies kanalo aplinkoje), šuns veislė, jatrogeninės traumos, netinkamas gydymas, auglių obstrukcijos ar polypai. Infekciją gali sukelti ir į ausį patekę pašaliniai kūnai, išoriniai dirgikliai: sieros sankaupos, kai ausys ilgai nevalomos, vanduo, patekęs šunį maudant, jam plaukiojant, lyjant lietui, ar ausyse esančios plaukų sąvėlos.

Pirminiai veiksniai tiesiogiai sukelia išorinės ausies uţdegimą. Tai ausų erkutės (Otodectes

cynotis) ir odos parazitai (Demodex canis, Otodectes, Sarcoptes ir kt.), alergija, autoimuninės ligos,

pirminė seborėja, blusos, hormonų pusiausvyros sutrikimas, T ląstelių limfoma, riebalinis adenitas, endokrininiai sutrikimai (hipertireoidizmas, hiperadrenokorticizmas, keratinizacijos sutrikimai).

Antrinėms prieţastims priskiriamos sąlyginai patogeninių bakterijų asociacijos ir grybeliai, kurie ausyje gyvena simbiozėje ir dauginasi. Susilpnėjęs organizmo atsparumas, pakitę augimo veiksniai (padidėjusi šiluma, pH, drėgnumas) sąlygoja patogeninės ir sąlyginai patogeninės mikrofloros augimą ir sukelia bakterines ausų ligas (Ţilienė ir kt., 2011).

63 padermės, priklausančios Pseudomonas spp. genčiai, buvo išskirtos iš skirtingų aplinkos šaltinių: dirvoţemio, vandens, klinikinių pavyzdţių. Buvo nustatyta, kad net 20 jų priklauso P.

aeruginosa (El−Fouly et al., 2014). P. aeruginosa aptinkama drėgnoje aplinkoje, todėl yra ypač

paplitusi atogrąţų klimate (Steen, Paterson, 2012). P. aeruginosa aptinkamos mėginiuose, paimtuose iš pelkių, jūrų pakrančių bei gyvūnų audinių (Stover et al., 2000).

P. aeruginosa yra gramneigiama, laktozės neskaidanti aerobinė bakterija. Priskiriama

oportunistiniams ţmonių ir gyvūnų patogenams, tačiau pirminę ligą sukelia retai. Buvo įrodyta, kad P.

aeruginosa sukelia daugybę infekcijų: piodermą, dermatitą, cistitą ir kitas šlapimo takų infekcijas

11 nosies ertmės, burnos, tonzilių, ryklės, distalinės šlaplės dalies, apyvarpės, spermos, makšties, junginės. Tyrimais su gyvūnais nustatyta, kad P. aeruginosa gali būti ir atskira infekcijų prieţastis, tokių kaip išorinės ausies uţdegimas, cistitas, endokarditas, dermatitas, ţaizdų infekcijos, konjuktyvitas, prostatitas, šlapimo takų infekcijos, osteomielitas, lėtinis rinitas, pleuritas, mastitas, septicemija (Seol et al., 2002).

Šios gramneigiamos bakterijos daţnai aptinkamos ir šunų bei kačių ausyse (Paterson, 2012). Ausų uţdegimas, sukeltas P. aeruginosa, daţniausiai prasideda ūmiai. Šunys krato galvą, kasosi ausis. Ausies kaušelyje atsiradusios išskyros būna gleivingos, nemalonaus kvapo, nuo geltonos iki ţalios spalvos. Daţnai būna paţeistas ir ausies būgnelis. Vidurinė ausis daţnai atrodo nepaţeista, bet po kurio laiko atsiranda patinimas, hemoraginis, tamsus (nuo ţalios iki rudos spalvos) eksudatas. Iš vidurinės ausies daţniausiai infekcija patenka ir į vidinę ausį. Vidurinės ausies uţdegimas pasireiškia ~ 83 proc. lėtinio išorinės ausies uţdegimo atvejų.

Esant ūminiam ausies uţdegimui, odos edema skverbiasi į gilesnius ausies audinius, keisdama ausies sieros sandarą. Šie pokyčiai lemia gramneigiamų bakterijų skaičiaus padidėjimą išorinėje klausomojoje landoje. Ausies landa susiaurėja, sutrinka ventiliacija, didėja drėgmė ir temperatūra, aplinka tampa daugiau anaerobinė. Dėl šių prieţasčių didėja gramneigiamų bakterijų populiacija. P.

aeruginosa išskiria medţiagas, padedančias išvengti šeimininko imuninio atsako: toksinus, proteazes

(egzotoksiną A, lecitinazę).

Ūminės ligos stadijos eigoje ausies kanale susidaro palankios sąlygos bakterijoms, ypač gramteigiamoms, patekti ir vystytis. Kai liga tampa lėtine, susidaro ausies kanalo stenozė, kartu padidėja drėgmės kiekis bei pH. Vėliau, uţdegimui dar labiau progresuojant, terpė tampa palanki ir gramneigiamoms bakterijoms, o ypač P. aeruginosa (Steen, Paterson, 2012).

P. aeruginosa gana retai išskiriamos iš šunų ausų, kuriems nepasireiškė klinikiniai išorinės

ausies uţdegimo poţymiai. Todėl šie mikroorganizmai buvo išskirti tik iš sergančių išorinės ausies uţdegimu šunų ausų. Nustatytas vidutinis mikroorganizmų skaičius − 4,16 ± 0,31 KSV/g. Ir šis skaičius, lyginant su šunų be išorinės ausies uţdegimo poţymių, buvo gerokai didesnis (Yoshida et al., 2002).

Ištyrus 73 kliniškai sveikų šunų ausų mėginius ir 149 šunų mėginius, kuriems pasireiškė klinikiniai išorinės ausies uţdegimo poţymiai, P. aeruginosa nebuvo išskirta iš šunų be klinikinių išorinės ausies uţdegimo poţymių. Tik 2 proc. buvo išskirta iš šunų, sergančių išorinės ausies uţdegimu (Topala et al., 2013).

12

P. aeruginosa sukeliamas otitas pasireiškia tiek šunims, tiek katėms. Daţniau P. aeruginosa

aptinkama šunims nukarusiomis ausimis, kurioms būdinga siaura išorinė klausomoji landa (Paterson, 2012). Daugiau nei pusė P. aeruginosa padermių išskirta iš koker spanielių ausų (Seol et al., 2002). Steen, Paterson (2012) kartu su koker spanieliais išskiria ir pudelius, nes dėl jų ausies kanalo struktūros jiems daţnai pasireiškia išorinės ausies uţdegimas. Katėms P. aeruginosa infekcija veislė neturi įtakos (Steen, Paterson, 2012).

Yoshida et al. (2002) ištyrė 110 šunų, kuriems buvo diagnozuotas išorinės ausies uţdegimas. Iš 110 šunų, 50 šunų abiejų ausų mėginiai buvo pateikti nustatyti išorinio ausies kanalo temperatūrą ir drėgmę. Visi tirti šunys turėjo anatomiškai plačius ausų kanalus, į kuriuos buvo galima įterpti drėgmės matavimo prietaisą (Testo, Vokietija). Tas pats buvo atlikta ir 43 šunims be klinikinių išorinės ausies uţdegimo poţymių. Tiek ausies kanalo temperatūra, tiek drėgmė buvo matuojama ausies kanale, 3 centimetrų gylyje 1 minutę. Temperatūra ir drėgmė buvo analizuojami pagal veisles, tokias kaip koker spanielis, Labradoro retriveris, vokiečių aviganis ir kitas. Grupės buvo lyginamos tarpusavyje. Nors atrodo, jog nukarusios ausys gali turėti įtakos šilumos sulaikymui, tyrimai parodė, jog didesnė išorinės ausies temperatūra neturi įtakos išorinės ausies uţdegimui. Nebuvo jokių reikšmingų skirtumų tarp veislių, turinčių ir neturinčių polinkį į išorinės ausies uţdegimą, pavyzdţiui, koker spanielių ir Labradoro retriverių. Manoma, kad padidėjusi drėgmė gali padidinti jautrumą įvairioms infekcijoms. Taigi, šiuo tyrimu nustatyta, kad nei stačios, nei nukarusios ausys neturi įtakos šilumos ir drėgmės sulaikymui išoriniame ausies kanale.

P. aeruginosa infekcijos daţniau pasitaiko jauniems pacientams, neretai infekcija būna susijusi

su alergija bei ektoparazitais. Vyresniems pacientams imunosupresija (sisteminių ar endokrininių ligų atveju) bei išorinės klausomosios landos navikai gali ypač padidinti šios infekcijos riziką. P.

aeruginosa retai infekuoja ,,sveikus” audinius, todėl labai svarbu išsiaiškinti pirmines ligos prieţastis

(Steen, Paterson, 2012).

Turkyilmaz (2006) tyrimo tikslas buvo išskirti P. aeruginosa iš šunų ausų bei įvertinti infekcijos tikimybę Aydin regione, Turkijoje. Šiam tikslui buvo paimti 92 mėginiai iš išorinės ausies uţdegimu sergančių šunų ausų. Bakterijos buvo išskirtos iš 88 (96,0 proc.) mėginių. Iš gramneigiamų mikroorganizmų daugiausia išskirta P. aeruginosa 17/40 (43,0 proc.). Net 5 šunims P. aeruginosa buvo išskirta rugpjūčio mėnesį. P. aeruginosa daţniausiai aptinkama koker spanielių 7/23 (30,0 proc.), terjerų 4/23 (17,0 proc.), bokserių 1/6 (17,0 proc.) ir pudelių 4/24 (16,0 proc.) ausyse. Buvo nustatyta, kad P. aeruginosa daţniausiai aptinkama 4−6 metų (50,0 proc.), 0−3 metų (38,0 proc.) bei ≥7 metų

13 (13,0 proc.) amţiaus šunims. Be to nustatyta, kad šis patogenas daţniau aptinkamas patelių ausyse (56,0 proc.).

1.2. P. aeruginosa struktūra, genomas ir patogeniškumo veiksniai

P. aeruginosa ląstelių skersmuo paprastai maţesnis nei 1 μm, ilgis − 1,5−5 μm. P. aeruginosa

turi polinį ir lateralinį ţiuţelius, dėl to ši bakterija greičiau juda (El−Fouly et al., 2014). Be to, polinis ţiuţelis veikia sukibimą ir yra galingas imuninio atsako stimuliatorius (Kung et al., 2010). P.

aeruginosa gali augti 41oC temperatūroje (kitų padermių − 44oC) (El−Fouly et al., 2014).

Nors P. aeruginosa yra aerobinė bakterija, prireikus nitratai gali būti panaudojami kaip alternatyvus elektronų akceptorius anaerobinėmis sąlygomis. Pseudomonas spp. yra sideforinių junginių šaltinis, kurių pagrindinis − pioverdinas. Šį metodą sukūrė ir rūšių nustatyme pritaikė Jean−Marie Meyer, Strasbūre. Šis išradimas ypač padėjo identifikuoti P. aeruginosa. Ši gramneigiama bakterija gamina ir kitą fluorescuojantį mėlynos spalvos fenazino pigmentą piocianiną. Jis atsakingas uţ „mėlynų pūliųˮ atsiradimą ţaizdoje (Cornelis, 2008). Savo chemine struktūra jis yra panašus į flavoproteinus, flavinmononukleotido ir flavindinukleotido junginius, kurie naudojami fitopatogenų kontrolei. Piocianinas, vandenyje tirpus biologiškai aktyvus junginys, gaminamas P. aeruginosa, sutrikdo elektronų pernašą ląstelėse, todėl pasiţymi priešgrybelinėmis savybėmis (El−Fouly et al., 2014).

P. aeruginosa yra neatsiejamai atspari įvairioms antimikrobinėms medţiagoms (Penna et al.,

2011). Todėl kalbant apie P. aeruginosa patogeniškumą, labai svarbu aptarti jos genomą.

P. aeruginosa pagal Pseudomonas nomenklatūrą priklauso I rRNR grupei. Ši gramneigiama

bakterija turi didţiausią G+C kiekį DNR molekulėje. P. aeruginosa genomas yra sudarytas iš vienos apskritos chromosomos ir įvairaus skaičiaus plazmidţių. Chromosoma sudaryta iš šerdies ir kintamųjų dalies, kuri sudaro įvairias genomo dydţio variacijas. Kintamųjų segmentai išsidėstę visame genome, maţdaug trečdalis jų yra gretimi tRNR ir iRNR genams. Genomo įvairovei labai svarbu aplinkinių genomo ląstelių integracija (angl. ICE’s, liet. IKE) į tRNRLys

arba tRNRGly genus. Šios ląstelės skiriasi savo medţiagų apykaitos genais, todėl dalintis pradeda sintetiniai genai, padedantys jiems horizontaliai plisti į kitus genų rinkinius.

P. aeruginosa genome yra medţiagų transporto, transkripcijos reguliavimo ir dvi komponentų

reguliavimo sistemos, kurios atspindi jo apykaitos universalumą, t.y. gebėjimą į pagalbą pasitelkti didelį komponentų kiekį. P. aeruginosa geba kolonizuotis ir išlikti įvairiose nišose, pavyzdţiui, vandens buveinėse, rizosferoje, gyvūnų gleivinėse bei audiniuose (Cornelis, 2008).

14 Didţioji dalis papildomo genomo gali būti nustatyta jo netipiniu G+C kiekiu, kodono ir tetranukleotidų naudojimu. Kadangi P. aeruginosa yra charakterizuojama dideliu G+C kiekiu (66,6 proc.), genai, gauti iš kitų rūšių (kas būdinga ir didţiajai daliai papildomo genomo), paprastai turi maţesnį G+C kiekį negu P. aeruginosa branduolio genomas.

Didţioji dalis P. aeruginosa papildomo genomo gali būti sugrupuota į keturias pagrindines kategorijas: 1) integriniai ir konjugaciniai elementai IKE (angl. ICE’s), 2) pakeitimo salelės, 3) profagai ir fago tipo elementai ir 4) transpozonai, insercinės sekos (angl. IS’s) ir integronai. Tačiau reikėtų pripaţinti, kad papildomo genomo komponentai daţnai yra formuojami skirtingų funkcinių modulių kombinacija. Vis dėlto šios klasifikacinės sistemos naudojimas suteikia naudingus pagrindus

P. aeruginosa papildomo genomo aptarimui (Kung et al., 2010).

IKE yra terminas, sudarytas Burrus ir kt. (Burrus, Waldor, 2004), skirtas aprašyti persiduodančius genetinius elementus, kurie turi integruotis į replikoną, kad būtų uţbaigta replikacija. IKE turi tiek su plazmidėmis, tiek su fagu susijusių DNR savybių. Kaip ir plazmidės, IKE gali egzistuoti kaip ţiediniai ekstrachromosominiai elementai ir yra perduodami pačių atliekamu jungimusi.

Lipopolisacharidai, O antigenas, pioverdinas, pilės ir ţiuţeliai yra kritiniai P. aeruginosa tinkamumo veiksniai. Šios makromolekulės dalyvauja pagrindiniuose procesuose, tokiuose kaip bakterijų sąveika, geleţies įsisavinimas, sukibimas ir judrumas.

Labiausiai nutolusi LPS molekulės dalis yra sudaryta iš pasikartojančių cukraus dalelių, ţinomų kaip O antigenas/polisacharidas. Tarp padermių, gaminančių O antigeną, egzistuoja ryški variacija jo struktūroje ir grandinės ilgyje, ji leidţia klasifikuoti padermes pagal serotipą. Išskyrus O15 ir O17 serotipų padermes, kurios naudoja biosintetinius genus, nešamus į kitas genomo dalis, genai, koduojantys pagrindinius enzimus O antigeno biosintezei yra randami vienoje vietoje, uţimančioje bendrąsias genetines vietas visose P. aeruginosa padermėse. Šie genai uţkoduoja baltymus, tarpininkaujančius cheminei modifikacijai ir nuosekliam cukraus surinkimui, gautų polisacharidų subvienetų translokacijai į periplazmą ir polisacharido subvienetų susijungimui, kad būtų suformuotos pasikartojančios polisacharidų grandinės, sudarančios O antigeną. Nors individualių O antigenų virulentiškumo savybių palyginimas dar tik bus atliekamas, keletas tyrimų parodė, kad O antigenas prisideda prie P. aeruginosa patogeniškumo. Dėl to genetinės pioverdino vietos (turinčios geną, koduojantį pioverdino receptorių, neribosominius peptidų sintezės genus ir manomą ABC transporterio geną) labai išsiskiria tarp P. aeruginosa padermių.

R- ir F-tipo piocianinai yra profagai su defektais, nes jie turi fago uodegėlės geną, tačiau neturi genų, būtinų fago galvutei susiformuoti, replikacijai ir integracijai (Kung et al, 2010).

15

P. aeruginosa IV tipo pilės, kurios yra pilino monomerinių subvienetų polimerai, tarpininkauja

sukibimui prie daugybės ląstelių paviršių ir dalyvauja bioplėvelės formavimęsi (Sriramulu et al., 2005). Kiekviena pilino geno grupė yra unikali dėl pilino, kurią ji koduoja, ilgio ir sekos, taip pat dėl susijusių papildomų genų, kurie koduoja baltymus, veikiančius pilino posttransliacinę glikolizaciją. Įdomu tai, kad I pilino grupės genas ir jo atitinkamas glikoziltransferazės genas yra per stipriai atstovaujami P. aeruginosa padermėse, atskirtose nuo cistinės fibrozės pacientų ir tuo būdu yra tarp kelių horizontaliai įgytų alelinių genų pavyzdţių, susijusių su tam tikra infekcijos rūšimi. II grupės pilės neturi susijusio papildomo geno su svetimais genais. Papildomų genų, susijusių su III ir V pilių grupėmis, funkcijos nėra ţinomos, tačiau manoma, kad jos koduoja baltymus, kurie taip pat keičia piliną per posttransliacines modifikacijas, tokias kaip glikolizacija. IV pilių grupės atveju susijęs genas uţkoduoja arabinosiltransferazę, kuri prijungia arabinofuranozę prie keleto skirtingų pilino amino rūgščių liekanų.

Bakteriofagai yra labai gausūs ir genetiškai įvairūs organizmai, sudaryti iš baltymo plėvelės, supančios viengubą arba dvigubą susuktą DNR arba RNR genomą, kuris maţų maţiausiai turi genus, būtinus baltymų kodavimui, leidţiančius fagui parazituoti bakterinės replikacijos mechanizmą. P.

aeruginosa fagai yra rezervuaras genetinei įvairovei (Kung et al., 2010).

Transpozonai yra genetiniai organizmai, kurie patys sukuria savo translokaciją iš vienos vietos į kitą, paprastai tai būna nesusijusi vieta toje pačioje arba kitoje DNR molekulėje (Bennet, 2004), jie aptinkami tiek P. aeruginosa, tiek kitose bakterijose. Visi funkciniai transpozonai turi geną arba genų grupę, koduojančią transpozazę arba transpozazės kompleksą, kuris sukelia transpoziciją prisišliedamas prie trumpų inversinio pasikartojimo sekų transpozono kraštuose. Didţioji dalis P. aeruginosa transpozonų gali transponuoti į įvairias DNR molekulės vietas (Kung et al., 2010).

Kaip minėta anksčiau, exoU genas koduoja P. aeruginosa III tipo sekrecijos sistemos baltymą−efektorių. Kitas P. aeruginosa III tipo sekrecijos sistemos baltymas efektorius, kurį koduoja papildomas genas, yra exoS (Hauser, 2009). Kaip ir exoU, tai yra galingas virulentiškas veiksnys, tačiau jo prigimtis yra daug sudėtingesnė. ExoS sudaro 76,0 proc. amino rūgšties, trečdalis III tipo sekrecijos baltymo efektoriaus, laikoma, kad exoT ir exoS genai atsiranda dėl genų dvigubinimo. Priešingai negu exoT genas, kuris randamas kiekvienoje P. aeruginosa padermėje, exoS genas yra tik apie 70,0 proc. visų P. aeruginosa padermių. Todėl exoS genas yra P. aeruginosa papildomo geno dalis, o exoT genas − nėra (Kung at al., 2010).

16

1.3. P. aeruginosa atsparumas antimikrobinėms medţiagoms

1.3.1. P. aeruginosa bioplėvelės formavimo mechanizmas

Nepaliaujamai auga gramneigiamų bakterijų atsparumas. Kai kurios gramneigiamos bakterijos įgyja atsparumą trims ir daugiau daţniausiai vartojamų antibiotikų klasėms (Čaplinsas, Andziukevičiūtė, 2012).

Kaip ţinoma, dėl įvairių atsparumo mechanizmų, bioplėvelės formavimo, P. aeruginosa atsparumas antibiotikams vis didėja. Manoma, kad bioplėvelės formavimasį, kaip apsauginį mechanizmą, daţnai skatina antibiotikai (Harper, Enright, 2011).

Steen, Paterson (2012) tyrimo tikslas buvo ištirti komerciškai prieinamų ausų preparatų atsparumą Pseudomonas spp., išskirtų iš 48 šunų, sergančių išorinės ausies uţdegimu. Šis tyrimas parodė, kad iš 8 išbandytų preparatų tik 3 buvo veiksmingi prieš Pseudomonas spp. Dar 3 preparatams

Pseudomonas spp. buvo visiškai atsparios, o likusių 2 preparatų veiksmingumas buvo nepastovus, t.y.

jie buvo veiksmingi tik kelioms padermėms. Dėl šių prieţasčių P. aeruginosa apibūdinama kaip ,,bakterijų atsparumo fenomenas” (Strateva, Yordanov, 2009).

Ţinoma, kad P. aeruginosa formuojama bioplėvelė yra besivystantis procesas, kurį sudaro keturi pagrindiniai etapai: bakterinis nusėdimas ir negrįţtamas sukibimas, mikrokolonijų formavimas, brendimas ir ląstelių dispersija atgal į jų planktoninę stadiją. Paskutiniais tyrimais buvo įrodyta, kad bioplėvelės formavimasis yra grieţtai reguliuojamas procesas, nes atskiruose jo etapuose dalyvauja skirtingi genai.

Bakterinis nusėdimas ir negrįţtamas ląstelių sukibimas su paviršiumi yra veikiamas biologinių, fizikinių ir cheminių faktorių. Jiems priskiriamos substrato savybės (tokios kaip nelygumai ir hidrofobiškumas), makromolekulių „kondicionavimo plėvelė” paviršiuje, sistemos hidrodinamika, veikimo charakteristikos (tokios kaip jonų stiprumas, pH ir multivalentinių katijonų dalyvavimas) bei ląstelės paviršiaus savybės (tokios kaip hidrofobiškumas, ţiuţelių ir pilių išraiška, lipopolisacharidai ir ekstraceliulinės polimerinės medţiagos (angl. EPS, liet. EPM).

Kitame bioplėvelės formavimosi etape vyksta prisijungusių ląstelių agregacija ir mikrokolonijų formavimasis. P. aeruginosa bakterijoje šis procesas vyksta per paviršinę translokaciją trūkčiojančiu judėjimu, priskiriamą IV tipo pilių grupei (Herzberg, Elimelech, 2008).

Po prisijungimo padidinama EPM sintezė, taip bioplėvelėje sukuriama trijų dimensijų struktūra (Branda et al., 2005). P. aeruginosa pagrindiniai bioplėvelės polisaharidai yra alginatai, tačiau joje yra ir kitų polisacharidų, praturtintų gliukoze ir manoze. Buvo įrodyta, kad šį brendimo etapą lydi antibiotikams atsparių bioplėvėlės ląstelių vystymasis (Herzberg, Elimelech, 2008).

17 Paskutinis etapas bioplėvelės formavimesi yra ląstelės atsiskyrimas. Ląstelės atsiskyrimas yra aktyvi ląstelių dispersijos nuo bioplėvelės matricos forma (Romeo, 2006), o ne fizikinis ląstelių agregatų atskyrimas, daţnai apibūdinamas kaip pašalinimas. Šio bioplėvelės formavimosi ciklo etape atsiskyrusios subrendusios bioplėvelės ląstelių subpopuliacijos iš naujo inicijuoja bioplėvelės formavimąsi naujose vietose. Kol ląstelių dispersijos mechanizmai nėra pilnai ištirti, ląstelių dispersija siejama su pasikeitimais maistingųjų medţiagų lygiuose ir kvorumo jutimu.

Bakterijoms prisijungus prie paviršiaus keičiasi genų, veikiančių ląstelių fiziologiją ir fenotipus, išraiška. Įrodyta, kad P. aeruginosa sukuria algC geną, įtrauktą į alginatų biosintezę, ląstelėms jungiantis prie paviršiaus. P. aeuroginosa, taip pat su pilėmis ir ţiuţeliais susiję genai, įtraukti į jungimąsi prie paviršiaus, yra nuslopinami brendimo stadijoje.

Taip pat įrodyta, kad ţiuţeliai yra svarbūs P. aeruginosa bioplėvelės dispersijos etape. Pastaruoju metu buvo pastebėti laikini pasikeitimai P. aeruginosa bioplėvelės baltymų išraiškoje, jos brendimo ir dispersijos etapuose. Brendimo etapuose bioplėvelėje buvo suţadinti baltymai, įtraukti į virulentiškumą, pritaikymą, atsparumą antiobiotikams, nitrifikaciją ir kvorumo jutimą. Taip pat įrodyta, kad su kvorumu susiję efliukso siurbliai buvo suţadinti bioplėvelės formavimosi metu. Iš jų buvo reikalaujama aktyviai veikti mechanizmuose, kurie yra atsparūs antibiotikams (Herzberg, Elimelech, 2008).

1.3.2. P. aeruginosa atsparumo β − laktaminiams antibiotikams mechanizmas

Dėl maţo išorinės membranos pralaidumo, P. aeruginosa atspari daugeliui antimikrobinių medţiagų. Natūralus rūšies atsparumas susijęs su šiais β − laktaminiais antibiotikais: penicilinu G, aminopenicilinu, įskaitant β − laktamazės inhibitorius bei pirmosios ir antrosios kartos cefalosporinus. Ţinoma, kad P. aeruginosa lengvai įgyja papildomų atsparumo mechanizmų, taip dar labiau apsunkinant gydymą (Strateva, Yordanov, 2009).

Atlikus antimikrobinio atsparumo tyrimus, iš β − laktaminių antibiotikų aktyviausiu pripaţintas imipenemas. Iš 183 tirtų padermių, 177 P. aeruginosa padermės buvo jautrios, 2 vidutiniškai jautrios ir tik 4 padermės atsparios. Iš trečiosios kartos cefalosporinų cefoperazonui buvo jautrios 159 P.

aeruginosa padermės, 9 vidutiniškai jautrios ir 15 padermių buvo atsparios. Ceftazidimui buvo jautri

141 padermė, 6 vidutiniškai jautrios ir 36 padermės atsparios. Kalbant apie trečiosios kartos cefalosporinus, cefoperazono aktyvumas buvo didesnis nei ceftazidimo (Seol at al., 2002).

18

1.3.3. P. aeruginosa atsparumo aminoglikozidams mechanizmas

Yra ţinoma keletas atsparumo aminoglikozidams mechanizmų: pagrindinis jų − fermentų modifikacija, maţas išorinės membranos pralaidumas, aktyvus efliuksas bei taikinio modifikacija. Jų metu prie antibiotikų molekulės AME’s prijungia fosfatą, adenyl ar acetyl grupių radikalus, taip sumaţindama antibiotikų prisitvirtinimą prie bakterijų sienelės (Strateva, Yordanov, 2009).

Neomicinas gana plačiai naudojamas vietiškai P. aeruginosa sukeltam šunų otitui gydyti, tačiau jis pasiţymi ţemiausia stiprumo klase, t.y. jis maţiau veiksmingas prieš keletą gramneigiamų mikroorganizmų, tarp jų ir P. aeruginosa. Gentamicinas taip pat pasiţymi maţesniu veiksmingumu prieš P. aeruginosa sukeltą otitą šunims, tačiau jis gali būti naudojamas kaip alternatyva, jeigu P.

aeruginosa buvo atspari neomicinui (Morris, 2004).

Hariharan (2009) atliko retrospektyvinį tyrimą. Atlikta paskutiniųjų 5 metų duomenų analizė (St. George’s University, Grenada). Buvo atrinkti klinikiniai šunų ligų atvejai, kurių sukelėjas P.

aeruginosa. 44 mėginiai buvo imami iš: 21 (47,7 proc.) mėginys esant išoriniam ausies uţdegimui, 10

(22,7 proc.) mėginių dėl dermatito, ţaizdų ir pūlinių, 8 (18,2 proc.) šlapimo mėginiai, 3 (6,8 proc.) gimdos ir makšties tepinėliai, 1 (2,2 proc.) tamponas iš akių bei 1 (2,2 proc.) išmatų mėginys. Nustatytas atsparumas 6 antimikrobinėms medţiagoms. Maţiausias atsparumas buvo nustatytas gentamicinui (<10,0 proc.), kiek didesnis enrofloksacinui (15,8 proc.). Didţiausias atsparumas nustatytas amoksicilinui − klavulano rūgščiai bei cefalotinui (100,0 proc.). Dauguma padermių buvo atsparios tetraciklinui (85,0 proc.) ir maţiau nei pusė neomicinui (41,8 proc.).

Per 5 metus, tiriant šunų išorinės ausies uţdegimo atvejus, išskirta 1819 įvairių mikroorganizmų padermių, 319 iš jų − P. aeruginosa. Šio tyrimo metu buvo vertinamas bakterijų atsparumas 13 antimikrobinių medţiagų. Tyrimas parodė, kad dauguma gramneigiamų bakterijų, įskaitant P.

aeruginosa, buvo jautrios amikacinui ir gentamicinui. Lyginant su 1995 metų tyrimais, atliktuose tame

pačiame regione, 95,0 proc. P. aeruginosa padermių, išskirtų iš šunų ausų, buvo jautrios amikacinui ir gentamicinui (Hariharan et al., 2006).

Turkyilmaz (2006) nustatė, kad P. aeruginosa ypač jautri gentamicinui (81,0 proc.), kiek maţiau jautri penicilinui G (75,0 proc.), danofloksacinui (44,0 proc.), streptomicinui (38,0 proc.), ampicilinui (19,0 proc.), linkomicinui (13,0 proc.) bei tetraciklinui (13,0 proc.).

1.3.4. P. aeruginosa atsparumo fluorochinolonams mechanizmas

Fluorochinolonų atsparumo mechanizmas dvejopas: struktūriniai pokyčiai ląstelėse – taikiniuose ir aktyvaus efliukso sistema. Modifikacijos metu įvyksta taškinė mutacija, jos metu koduojama DNR girazė ir topoizomerazė IV (Strateva, Yordanov, 2009).

19 Pagal Morris (2004), fluorochinolonų klasės antibiotikai veikia baktericidiškai − slopina bakterijų DNR girazę, kuri yra atsakinga uţ DNR sintezę. Jų baktericidinis aktyvumas priklauso nuo koncentracijos, todėl šio preparato bakterinis atsparumas daţnai išsivysto dėl jo naudojimo subterapinėmis dozėmis. Šios antibiotikų klasės naudojimas tapo įprastas gydant lėtinį/pasikartojantį otitą, sukeltą P. aeruginosa.

Fluorochinolonai, ypač enrofloksacinas, per pastaruosius 10 metų buvo plačiai naudojami P.

aeruginosa sukeltam išorinės ir vidurinės ausies uţdegimui gydyti. Maţdaug 40,0 proc. enrofloksacino

metabolizuojama į ciprofloksaciną. Susidaro biologiškai aktyvus metabolitas, kuris transformuojamas į keletą papildomų junginių, kurių didţioji dalis išsiskiria su šlapimu (Seol et al., 2002). Abi šios veikliosios medţiagos, t.y. enrofloksacinas ir ciprofloksacinas, ilgai cirkuliuoja gydytų gyvūnų organizme (Blondeau et al., 2012). Ciprofloksacinas pripaţintas veiksmingiausiu fluorochinolonu prieš

P. aeruginosa (Seol et al., 2002). Naudojant šias veikliąsias medţiagas atskirai, P. aeruginosa

atsparumas enrofloksacinui pasireiškė rečiau nei ciprofloksacinui.

Ir nors enrofloksacinas jau seniai naudojamas gydant P. aeruginosa sukeltą otitą, naujais tyrimais įrodyta, kad net iki 87,5 proc. P. aeruginosa in vitro gali būti atsparios šiam preparatui (Morris, 2004).

Marbofloksacinas ţinomas kaip plataus veikimo spektro baktericidinis preparatas. Jis naudojamas prieš daug gramteigiamų ir gramneigiamų mikroorganizmų, taip pat ir prieš P. aeruginosa. Pastebimas jo poveikis po antibiotikų vartojimo tiek in vivo, tiek ex vivo, todėl jis tinkamas naudoti šunims įvairiose klinikinėse situacijose (Seol et al., 2002). Ir nors marbofloksacinas taip pat priklauso fluorochinolonų grupės antibiotikams, jo MIC geriau veikia P. aeruginosa nei enrofloksacinas ar ciprofloksacinas (Morris, 2004).

Kaip ţinoma, orbifloksacinas − plataus veikimo spektro baktericidinė medţiaga, prisiriama fluorochinolonų klasei. In vitro veikia daug gramteigiamų ir gramneigiamų bakterijų. Slopindamas DNR girazę, jis neleidţia bakterijoms gaminti DNR, bakterijos nustoja gaminti baltymus ir dėl to ţūsta. (http://www.ema.europa.eu/ema/index.jsp?curl=pages/medicines/veterinary/referrals/Orbax/vet_referra l_000086.jsp&mid=WC0b01ac05805c5170&source=homeMedSearch&category=human. Prieiga per internetą 2014 09 03).

Harada et al. (2012) tyrė orbifloksacino PAE’s ir MIC poveikį P. aeruginosa, išskirtų iš šunų, po antibiotikų naudojimo. Šie farmakodinaminiai kintamieji labai svarbūs norint tinkamai dozuoti antimikrobines medţiagas. PAE apibrėţiama kaip trumpo sąlyčio su antibiotikais trukmė, per kurią nuslopinamas bakterijų augimas; PA−SME apibrėţiamas kaip laiko intervalas, apimantis PAE ir

20 papildomą laiką, kurio metu augimą slopina MIC. Tyrimas parodė, kad orbifloksacinas pasiekia PAE ir PA−SME koncentracijas kiekvienoje injekcijos vietoje įprastomis gydomosiomis dozėmis. Tyrimu įrodyta, kad orbifloksacinas veiksmingas prieš P. aeruginosa naudojant jį rekomenduojamomis dozėmis.

1.3.5. P. aeruginosa atsparumas polimiksinams

Kaip ţinoma, polimiksino B preparatas pasiţymi stipriu baktericidiniu veikimu. Jis didina bakterijų ląstelių membranos pralaidumą suardydamas membranos fosfolipidų komponentus ir sumaţindamas osmosinį slėgį ląstelėse. Dėl šių prieţasčių šis antibiotikų derinys yra ypač tinkamas P.

aeruginosa sukeltam otitui gydyti (Morris, 2004).

Naudojant mikonazolo, polimiksino B ir prednizolono preparatą, įvertintas ausų suspensijos veiksmingumas šunų išorinės ausies uţdegimui gydyti JAV ir Kanadoje (Engelen et al., 2010). Šiame tyrime atvejai buvo suskirstyti į produkto bandymo ir kontrolės grupes. Bandymo grupėje buvo naudojamas jau minėtas preparatas, kontrolės grupėje − preparatas, kurio sudėtyje yra gentamicino, klotrimazolo ir betametazono. Prieš ir po gydymo bandymų ir kontrolės grupėse buvo stebimi 4 klinikiniai parametrai: skausmas/diskomfortas, paraudimas, patinimas ir eksudatas. Mėginiai iš ausų buvo imami steriliais vatos tamponais. P. aeruginosa išskirta iš 12,5 proc. visų mėginių. Naudojant šiuos preparatus, klinikiniai išorinės ausies uţdegimo poţymiai sumaţėjo abejose grupėse: 97,0 proc. bandymo grupėje ir 95,0 proc. kontrolinėje grupėje. Tyrimas parodė, kad mikonazolo, polimiksino B ir prednizolono preparatas ypač veiksmingas pradiniam išorinės ausies uţdegimo gydymui, sukeltam P.

aeruginosa (Engelen et al., 2010).

1.4. P. aeruginosa – bakterijų atsparumo fenomenas

Penna et al. (2011) atlikti kultūros ir antimikrobinio jautrumo tyrimai prieš P. aeruginosa sukėlė nerimą Rio de Ţaneire, Brazilijoje. Išanalizavus gautus rezultatus pastebėta, kad išorinės ausies uţdegimo atveju P. aeruginosa beveik nereaguoja į empirinio gydymo valdymą.

Penna et al. (2011) ištyrė 528 suaugusius šunis (≥2 metų amţiaus), kuriems daugiau nei prieš 15 dienų buvo diagnozuotas išorinės ausies uţdegimas. Nustatytas atsparumas 10 antimikrobinų medţiagų: iš aminoglikozidų klasės buvo naudojamas amikacinas, gentamicinas, tobramicinas ir neomicinas; fluorochinolonų – ciprofloksacinas, norfloksacinas ir enrofloksacinas; cefalosporinų – ceftriaksonas ir ceftazidinas. Taip pat buvo išbandytas polimiksinas B. Iš 528 mėginių, 167 padermės priklausė P. aeruginosa (31,6 proc.). Tiriant jautrumą antimikrobinėms medţiagoms, pastebėti kintamo jautrumo profiliai, t.y. kai kurios P. aeruginosa padermės buvo atsparios aminoglikozidams, tačiau

21 jautrios fluorochinolonams ir atvirkščiai. Kalbant apie rezultatus, P. aeruginosa atsparumas cefolosporinams svyravo nuo 97,0−100,0 proc., atsparumas aminoglikozidams − 65,7−94,7 proc. Atspariausi buvo fluorochinolonų klasės atstovai, P. aeruginosa atsparumas ciprofloksacinui ir norfloksacinui buvo labai panašus (<20,0 proc.). Efektyviausiu fluorochinolonų klasės atstovu pripaţintas ciprofloksacinas. Buvo labai netikėta, kad atsparumas enrofloksacinui siekė net 63,6 proc. Penna et al. padarė išvadą, kad P. aeruginosa tapo beveik dvigubai atsparesnė enrofloksacinui.

Kaip ţinoma, naminių gyvūnų antimikrobinio jautrumo tyrimai labai svarbūs ţmonių sveikatai. Atsiţvelgiant į bendrą ţmonių ir gyvūnų aplinką, manoma, kad bakterijos perduodamos iš ţmogaus gyvūnui ir atvirkščiai. Tačiau kaip daţnai vyksta šis bakterijų keitimasis, nenustatyta. Ţinoma, kad apie 80,0 proc. visų antibiotikų naudojami šunims.

Anthea et al. (2007) įvertino Pseudomonas spp. tarplaboratorinę variaciją. Ištirti 26 šunys, kuriems pasireiškė vienos ar abiejų pusių klinikiniai išorinės ausies uţdegimo poţymiai. Mėginiai buvo imami 3 egzemplioriais ir pateikiami į 3 skirtingas laboratorijas bakterijų kultūrų ir atsparumo tyrimams. Viso Pseudomonas spp. buvo izoliuota 18 iš 34 mėginių. Tačiau vertinant visų 3 laboratorijų rezultatus, Pseudomonas spp. išskirta 15 iš 34 mėginių. Jautrumas antimikrobinėms medţiagoms buvo lyginamas tarp dviejų laboratorijų. Rezultatai parodė, kad nei viena Pseudomonas spp. neturėjo identiškų antimikrobinio atsparumo modelių.

1.5. P. aeruginosa infekcijų gydymo alternatyvos

P. aeruginosa sukeltų infekcijų gydymas gana sudėtingas ir brangus. Klinikiniai tyrimai

reikalingi siekiant nustatyti rizikos veiksnius, efektyviausią antimikrobinį preparatą, gydymo reţimą bei trukmę. Tačiau vien to, norint įveikti P. aeruginosa infekciją, nepakanka. Reikia ieškoti ir kitų alternatyvių šios infekcijos gydymo būdų (Strateva, Yordanov, 2009).

Kaip alternatyvus P. aeruginosa gydymo būdas išbandyti bakteriofagai. Lyginant su antibiotikais, bakteriofagai turi keletą pranašumų: 1) antibiotikai lokalizuojasi virš bioplėvelės, todėl gali veikti tik bakterijos paviršiuje, o bakteriofagai infekuodami ląstelės paviršių gali replikuotis, gaminti didelės koncentracijos antibakterinį preparatą, kuris palaipsniui sunaikina bioplėvelę; 2) bakteriofagai gali pernešti fermentus, skaidančius bioplėvelės matricą; 3) bakteriofagai gali prisijungti aplinkines ląsteles ir netgi jas sunaikinti (Harper, 2011). Bakteriofagų gebėjimas susilpninti ir net sunaikinti bioplėvelės matricą gali padidinti kitų preparatų įsiskverbimą (Verma et al., 2010). Nors P.

aeruginosa plačiai paplitusi visame pasaulyje, yra maţai įrodymų, kad bakteriofagai vienodai

veiksmingi visose geografinėse zonose. Darbas su gyvūnų modeliais davė gerų rezultatų. Įrodyta, kad bakteriofagų terapija prieš P. aeruginosa veiksminga tiek ţmonėms, tiek gyvūnams (Harper, 2011).

22 Wright et al. (2009) tyrimo tikslas buvo įvertinti terapinio bakteriofago preparato (Biophage−MA) veiksmingumą ir saugumą lėtinio otito atveju, kurį sukėlė P. aeruginosa. Gydytojai turėjo įvertinti klinikinius ligos poţymius: eritema/uţdegimas, išopėjimas/granuliavimas/polypai, išskyrų kiekį, kvapą (jis buvo nustatomas naudojant VAS). P. aeruginosa buvimas buvo įvertinamas naudojant sterilų tamponą. Tyrimui buvo naudojamas otoskopas. Jau pirmą dieną klinikiniai poţymiai stipriai sumaţėjo. Vėliau klinikiniai ligos poţymiai stipriai sumaţėjo ar net visai išnyko. Tyrimu dar kartą buvo įrodyta, kad bakteriofagus naudoti veiksminga ir efektyvu prieš P. aeruginosa lėtinio otito atveju.

23

2. TYRIMO METODIKA IR ORGANIZAVIMAS

Tyrimai atlikti 2013 m. rugsėjo – 2014 m. geguţės mėn. Mikrobiologiniai tyrimai atlikti remiantis 1997 lapkričio 6 d. Lietuvos respublikos gyvūnų gerovės ir apsaugos įstatymu Nr. 8−500 („Valstybės ţinios”, 1997 lapkričio 6 d., Nr. 108−2728), poįstatyminio akto − LR valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos įsakymas „Dėl gyvūnų, skirtų eksperimentiniams ir kitiems mokslo tyrimams, laikymo, prieţiūros ir naudojimo reikalavimų patvirtinimo” („Valstybės ţinios”, 2009 sausio 22 d., Nr.8-287) bei laikantis EK direktyvos 86/609/EEC ir EK rekomendacijos 2007/526 EC “Gyvūnų naudojimas ir laikymas eksperimentiniais ir kitais tikslais”.

Tyrimo metu buvo paimti 88 mėginiai iš šunų ausų: 49 mėginiai iš kliniškai sveikų šunų ausų ir 39 mėginiai iš išoriniu ausies uţdegimu sergančių šunų ausų.

2.1. Įvairių veiksnių įtaka P. aeruginosa išskyrimui iš šunų ausų

Kliniškai sveikų ir sergančių šunų grupės buvo suskirstytos dar į 3 grupes: pagal lytį, amţių ir veislę. Pagal lytį − į 2 grupes (1 lentelė), pagal amţių – į 4 grupes (2 lentelė). Tyrime dalyvavo 24 skirtingos šunų veislės. Kliniškai sveikų šunų veislės pateiktos 3 lentelėje, kliniškai sergančių – 4 lentelėje.

1 lentelė. Šunų skirstymas pagal lytį

Kliniškai sveiki Kliniškai sergantys

Patelės Patinai Patelės Patinai

25 24 25 14

2 lentelė. Šunų skirstymas pagal amţių

Amţiaus grupė (0-3] (3-6] (6-9] (9-12]

Kliniškai sveiki 11 23 12 3

24 3 lentelė. Kliniškai sveikų šunų veislės

Veislė Šunų skaičius

Mišrūnas 14 Koker spanielis 10 Vokiečių aviganis 5 Pekinas 3 Staforšyro terjeras 3 Auksaspalvis retriveris 2 Labradoro retriveris 2 Rotveileris 2 Dobermanas 1 Kolis 1 Šetlando aviganis 1 Berno zenenhundas 1 Buldogas 1 Taksas 1 Anglų mastifas 1 Čiau−čiau 1

25 4 lentelė. Kliniškai sergančių šunų veislės

Veislė Šunų skaičius

Vokiečių aviganis 9

Koker spanielis 9

Mišrūnai 3

Staforšyro terjeras 2

Biglis 3

Vakarų Škotijos baltasis terjeras 3

Juodasis rusų terjeras 1

Bordo dogas 1 Mopsas 1 Pudelis 1 Pekinas 1 Berno zenenhundas 1 Kurtsharas 1 Labradoro retriveris 1 Auksaspalvis retriveris 1 Bokseris 1 2.2. P. aeruginosa identifikavimas

Mėginiai mikrobiologiniam tyrimui imti iš išorinės klausomosios landos į transportines terpes TRANSWAB® (Amies, Liofilchem, Italija). Mėginiai buvo imami iš vienos ausies landos atskirais steriliais vatos tamponėliais. Tyrimas buvo atliekamas kruopščiai, siekiant išvengti mėginių uţterštumo. Mėginiai iš išorinės klausomosios landos buvo imami įsitikinus, jog šunims nebuvo taikoma antibiotikų terapija ar naudojami vietiniai anestetikai dėl toksinio poveikio bakterijoms bei iškreiptų rezultatų parodymų.

Mėginiai buvo sėjami į Petri lėkšteles su krauju agaru (KA) (Oxoid, Anglija) ir selektyvinėmis mitybinėmis terpėmis. Uţsėtos Petri lėkštelės buvo kultivuojamos 24 – 48 val. aerobinėmis sąlygomis,

26 esant +37ºC temperatūrai. Po to buvo vertinamos mikroorganizmų kultūrinės, morfologinės ir biocheminės savybės. Mikroorganizmų morfologijai nustatyti buvo paruošti tepinėliai iš mikroorganizmų kultūrų bei daţyti Gramo metodu („Diagnostica Merck”, Vokietija) ir vertinta mikroskopu. Gramteigiami mikroorganizmai nusidaţo violetine spalva, gramneigiami – raudona spalva. P. aeruginosa bakterijos nusidaţo raudona spalva. Mikroskopuojant matomos gramneigiamos lazdelės (1 pav.).

1 pav. P. aeruginosa daţyta Gramo metodu

P. aeruginosa bakterijos sėjamos ant KA norint nustatyti hemolizę. Šios bakterijos KA

suformuoja β hemolizę – aplink koloniją susidaro siaura, aiškiomis ribomis zona. KA galime stebėti dideles, lygiais kraštais, iškilusiu viduriu, matines P. aeruginosa kolonijas.

P. aeruginosa identifikuoti naudotas selektyvinis „Pseudomonas citramide agar Base” (Oxoid,

Anglija) agaras. P. aeruginosa bakterijos šioje terpėje yra geltonos − ţalios arba geltonos − rudos spalvos. P. aeruginosa šioje terpėje išskiria dviejų tipų pigmentus − piocianiną ir pioverdiną. Dėl fluorescuojančio pigmento pioverdino P. aeruginosa švyti ultravioletinėje šviesoje.

P. aeruginosa identifikuoti nuo Enterobacter spp. naudojamas oksidazės testas. Šios reakcijos

metu stebimas citochromo oksidazės aktyvumas − citochromo oksidazės gebėjimas prijungti deguonį. Atliekant oksidazės testą ant objektinio stiklelio uţlašinamas lašas 1% TPD tirpalo, plastmasine kilpele uţnešama tiriamosios bakterijų kultūros, švelniai sumaišoma. P. aeruginosa gamina fermentą oksidazę,

27 išryškėja purpurinė spalva – reakcija teigiama. Enterobacter spp. negamina oksidazės, purpurinė spalva nesusidaro − reakcija neigiama.

P. aeruginosa išskiria katalazę. Atliekant katalazės testą ant objektinio stiklelio uţlašinamas lašas

vandens, bakteriologine kilpele uţnešama tiriamosios bakterijų kultūros, sumaišoma. Uţlašinamas lašas 3% vandenilio peroksido (H2O2). Ši reakcija pagrįsta dujų susidarymu – jeigu mikroorganizmai išskiria

fermentą katalazę, vandenilio peroksidas skyla į vandenį ir deguonį, todėl galime stebėti dujų burbuliukų susidarymą. Mūsų atliktos rekcijos metu dujos susidarė − įsitikinome, kad P. aeruginosa išskiria fermentą katalazę.

P. aeruginosa biocheminėms savybėms nustatyti naudojamas diferencinis – diagnostinis

MacConkey agaras. Ši terpė padeda izoliuoti Gram− bakterijas ir diferencijuoti jas remiantis laktozės fermentacija. Kristal violetas ir tulţies druskos slopina Gram+ bakterijų augimą, o tai padeda lengviau identifikuoti Gram− mikroorganizmus. Lac+ bakterijos gamina rūgštį, todėl ant MacConkey agaro stebimos roţinės spalvos kolonijos, o dėl tulţies druskų susidarymo šios kolonijos tampa „bespalvės miglotos”, pH sumaţėja iki 6,8. Lac− mikroorganizmai neskaido laktozės, todėl šiai reakcijai panaudoja peptonus. Išsiskiria amoniakas, dėl kurio padidėja pH, ant MacConkey agaro stebimos bespalvės/baltos spalvos kolonijos. Stebint šią reakciją, ant MacConkey agaro susidarė baltos spalvos kolonijos – P. aeruginosa neskaido laktozės.

2.3. P. aeruginosa atsparumo antimikrobinėms medţiagoms nustatymas

Bakterijų atsparumas antimikrobinėms medţiagoms nustatomas Kirby − Bauer diskų difuzijos metodu. Bakterijos sėjamos į specialią „Muller Hinton II Agar” terpę (Oxoid, Anglija). Išaugę bakterijų kolonijos perkeliamos į mėgintuvėlį su fiziologiniu tirpalu. Jos turi atitikti standartą - 0,5 McFarlando vienetus. Sterilus tamponas įmerkiamas į tiriamąją suspensiją, bakterijos pasėjamos ant „Mueller − Hinton II Agar”. Ant agaro paviršiaus, 30 mm atstumu vienas nuo kito, dedami antimikrobinų medţiagų diskai. Tiriamieji mėginiai kultivuojami 24 valandas 37o_{C temperatūroje. Po to išmatuojamas}

diskų skersmuo (mm), kuriuose slopinamas bakterijų augimas. Šio tyrimo metu buvo ištirtas P.

aeruginosa atsparumas 16 antimikrobinių medţiagų (5 lentelė). Atsparumas antimikrobinėms

28 5 lentelė. P. aeruginosa atsparumui nustatyti naudotos antimikrobinės medţiagos, mm (Antimicrobial Susceptibility Testing, 2014 (http://bsac.org.uk. Prieiga per internetą 2014 11 15))

Antimikrobinės medţiagos

Jautru

Vid. jautru Atsparu

≥ ≤

Amoksicilinas (AML) 21 14-20 14

Ampicilinas (AMP) 17 (Enterobact.) 14-16 13

29 (Staph.) − 28 Tylosinas (TY) 20 11-15 10 Cefaleksinas (CL) 18 15-17 14 Cefovecinas (CVN) 18 15-17 14 Enrofloksacinas (ENF) 17 13-16 12 Fuzidino rūgštis (FC) 23 15-22 14 Gentamicinas (CN) 15 13-14 12 Linkomicinas (CN) 21 15-20 14 Neomicinas (N) 17 13-16 12 Oksitetraciklinas (OT) 19 15-18 14 Penicilinas G (P) 17 (Enterococci.) 14-16 13 29 (Staph.) - 28 Polimiksinas B (PO) 12 9-11 8 Amoksicilinas su klavulano rūgštimi (AMC) 18 (Enterobact.) 14-17 13 20 (Staph.) - 19 Tetraciklinas (T) 19 15-18 14 Trimetoprimas (SXT) 16 11-15 10

29

2.4. Statistinių duomenų analizė

Tyrimo analizė atlikta naudojant „Microsoft Excel’2007” skaičiuoklę bei statistinių duomenų paketą SPSS 20.0. P. aeruginosa priklausomybė nuo veislės, amţiaus bei lyties išreikšta procentais. Rezultatai patikimi, kai p<0,05, p<0,01, p<0,001, nepatikimi, kai p>0,05.

30

3. REZULTATAI

3.1. Mikroorganizmų išskyrimas iš kliniškai sveikų šunų ausų

Iš 49 mėginių, paimtų iš kliniškai sveikų šunų ausų, mikroorganizmai buvo išskirti iš 31 (63,27 proc.) mėginio ir iš 18 (36,73 proc.) mėginių mikroorganizmai nebuvo išskirti. Vienos rūšies mikroorganizmai (monoinfekcija) išskirti iš 28 (90,32 proc.) mėginių, dviejų rūšių mikroorganizmai (poliinfekcija) išskirti iš 3 (9,68 proc.) mėginių.

Daugiausia buvo išskirta P. aeruginosa − iš 14 (41,18 proc.) mėginių, Bacillus spp. buvo išskirta iš 6 (17,65 proc.) mėginių, E. coli iš 4 (11,77 proc.) mėginių, Malassesia spp. iš 2 (5,88 proc.) mėginių, Enterobacter spp. iš 2 (5,88 proc.) mėginių, Staphylococcus spp. iš 1 (2,94 proc.) mėginio, S.

aureus iš 1 (2,94 proc.) mėginio, S. pseudointermedius iš 1 (2,94 proc.) mėginio, hemoliziniai

stafilokokai iš 1 (2,94 proc.) mėginio, Streptococcus spp. iš 1 (2,94 proc.) mėginio, Proteus spp. iš 1 (2,94 proc.) mėginio (2 pav.).

2 pav. Mikroorganizmų išskyrimas iš kliniškai sveikų šunų ausų

41,18 17,65 11,77 5,88 5,88 2,94 2,94 2,94 2,94 2,94 2,94 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Pr o ce n tai, % P. aeruginosa Bacillus spp. E. coli Malasssesia spp. Enterobacter spp. Staphylococcus spp. S. aureus S. pseudointermedius hemoliziniai stafilokokai Streptococcus spp. Proteus spp.

31 Mišrių infekcijų atvejais P. aeruginosa buvo išskirta kartu su Bacillus spp.

3.2. Įvairių veiksnių įtaka P. aeruginosa išskyrimui iš kliniškai sveikų šunų ausų

Tyrimo metu buvo nustatyta ar lytis, amţius bei veislė turėjo įtakos P. aeruginosa išskyrimo daţnumui.

3.2.1. Lyties įtaka P. aeruginosa išskyrimui iš kliniškai sveikų šunų ausų

Tyrimo metu buvo paimti 25 mėginiai iš kliniškai sveikų patelių ir 24 mėginiai iš kliniškai sveikų patinų ausų.

P. aeruginosa išskirta iš 10 (32,26 proc.) kliniškai sveikų patelių ir iš 4 (12,91 proc.) kliniškai

sveikų patinų ausų. Nustatyta, kad iš kliniškai sveikų patelių ausų išskirta 19,35 proc. daugiau P.

aeruginosa nei iš kliniškai sveikų patinų ausų (3 pav.).

Atlikus statistinę duomenų analizę nustatyta, kad kliniškai sveikų šunų lytis turėjo įtakos P.

aeruginosa išskyrimui (p<0,05).

3 pav. P. aeruginosa išskyrimas priklausomai nuo lyties

32,26% 12,91% 0 5 10 15 20 25 30 35 Patelės Patinai

32

3.2.2. Amţiaus įtaka P. aeruginosa išskyrimui iš kliniškai sveikų šunų ausų

Ištyrus 49 kliniškai sveikus šunis, P. aeruginosa buvo išskirta iš 14 (28,57 proc.) mėginių. Visi 14 šunų, iš kurių ausų buvo išskirta P. aeruginosa, suskirstyti 4 grupes pagal amţių.

Ištyrus 14 kliniškai sveikų šunų, P. aeruginosa buvo išskirta 7 (50,0 proc.) šunims (6-9] metų grupėje, 4 (28,57 proc.) šunims (0-3] metų grupėje, 3 (21,43 proc.) šunims (3-6] metų grupėje ir nei viena P. aeruginosa nebuvo išskirta (9-12] metų amţiaus grupėje (4 pav.).

Atlikus duomenų analizę nustatyta, kad kliniškai sveikų šunų amţius neturėjo įtakos P.

aeruginosa išskyrimui (p>0,05).

4. pav. P. aeruginosa išskyrimas pagal amţių

3.2.3. Veislės įtaka P. aeruginosa išskyrimui iš kliniškai sveikų šunų ausų

Ištyrus kliniškai sveikus šunis, P. aeruginosa buvo išskirta iš 7 skirtingų šunų veislių. Gauti tokie tyrimo rezultatai: daugiausia P. aeruginosa buvo išskirta iš 6 (42,86 proc.) koker spanielių ir 3 (21,44 proc.) mišrūnų ausų. Po vieną (7,14 proc.) P. aeruginosa buvo išskirta iš vokiečių aviganio, dobermano, šetlando aviganio, staforšyro terjero bei jorkšyro terjero (5 pav.).

28,57% 21,43% 50,0% (0-3] (3-6] (6-9]

33 5 pav. P. aeruginosa išskyrimas pagal veislę

Atlikus statistinę duomenų analizę nustatyta, kad kliniškai sveikų šunų veislė neturėjo įtakos P.

aeruginosa išskyrimui (p>0,05).

42,86%

21,44%

7,14% 7,14% 7,14% 7,14% 7,14%

Koker spanielis Mišrūnas Vokiečių aviganis Dobermanas Šetlando aviganis Staforšyro terjeras Jorkšyro terjeras

34

3.3. Mikroorganizmų išskyrimas iš kliniškai sergančių šunų ausų

Iš 39 mėginių, paimtų iš kliniškai sergančių šunų ausų, mikroorganizmų buvo išskirta iš 35 (89,74 proc.) mėginių ir iš 4 (10,26 proc.) mėginių mikroorganizmų nebuvo išskirta. Vienos rūšies mikroorganizmai (monoinfekcija) išskirti iš 25 (71,43 proc.) mėginių, dviejų rūšių mikroorganizmai (poliinfekcija) išskirti iš 9 (25,71proc.) mėginių ir 1 iš (2,86 proc.) mėginio išskirti trijų rūšių mikroorganizmai.

Daugiausia buvo išskirta P. aeruginosa − iš 20 (43,47 proc.) mėginių, Malassesia spp. iš 6 (13,04 proc.) mėginių, S. aureus iš 4 (8,7 proc.) mėginių, hemoliziniai stafilokokai iš 4 (8,7 proc.) mėginių, Enterobacter spp. iš 4 (8,7 proc.) mėginių, Staphylococcus spp. iš 2 (4,35 proc.) mėginių,

Streptococcus spp. iš 1 mėginio (2,17 proc.), E. coli iš 1 (2,17 proc.) mėginio, S. intermedius iš 1 (2,17

proc.) mėginio, S. pseudointermedius iš 1 (2,17 proc.) mėginio, Proteus spp. iš 1 (2,17 proc.) mėginio, mielės taip pat iš 1 (2,17 proc.) mėginio (6 pav.).

6 pav. Mikroorganizmų išskyrimas iš kliniškai sergančių šunų ausų

43,47 13,04 8,7 8,7 8,7 4,35 2,17 2,17 2,17 2,17 2,17 2,17 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Pr o ce n tai, % P. aeruginosa Malassesia spp. S. aureus hemoliziniai stafilokokai Enterobacter spp. Staphylococcus spp. Streptococcus spp. E. coli S. intermedius S. pseudointermedius Proteus spp. Mielės

35 Mišrių infekcijų atvejais P. aeruginosa išskirta kartu su E. coli, Enterobacter spp.

Staphylococcus spp. bei mielėmis.

3.4. Įvairių veiksnių įtaka P. aeruginosa išskyrimui iš kliniškai sergančių šunų ausų

Kaip ir kliniškai sveikų šunų grupėje, buvo nustatyta ar lytis, amţius bei veislė turėjo įtakos P.

aeruginosa išskyrimo daţnumui.

3.4.1. Lyties įtaka P. aeruginosa išskyrimui iš kliniškai sergančių šunų ausų

Tyrimo metu buvo paimti 25 mėginiai iš kliniškai sergančių patelių ir 14 mėginių iš kliniškai sergančių patinų ausų.

P. aeruginosa buvo išskirta iš 13 (37,14 proc.) kliniškai sergančių patelių ir 7 (20,0 proc.)

kliniškai sergančių patinų ausų. Nustatyta, kad iš kliniškai sergančių patelių ausų išskirta 7,14 proc. daugiau P. aeruginosa nei iš kliniškai sergančių patinų ausų (7 pav.).

Atlikus statistinę duomenų analizę nustatyta, kad kliniškai sergančių šunų lytis neturėjo įtakos

P. aeruginosa išskyrimui (p>0,05).

7 pav. P. aeruginosa išskyrimas priklausomai nuo lyties

37,14% 20,0% 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Patelės Patinai

36

3.4.2. Amţiaus įtaka P. aeruginosa išskyrimui iš kliniškai sergančių šunų ausų

Iš 39 kliniškai sergančių šunų, P. aeruginosa išskirta iš 20 (51,28 proc.) mėginių. Visi 20 kliniškai sergančių šunų, kuriems buvo išskirta P. aeruginosa, suskirtyti į tas pačias 4 grupes pagal amţių.

Nustatyta, kad iš 20 kliniškai sergančių šunų, P. aeruginosa išskirta net 9 (45,0 proc.) šunims (3-6] metų grupėje. P. aeruginosa išskirta 6 (30,0 proc.) šunims (0-3] metų grupėje, 4 (20,0 proc.) šunims (6-9] metų grupėje ir 1 šuniui (5,0 proc.) (9-12] metų grupėje (8 pav.).

Atlikus duomenų analizę nustatyta, kad kliniškai sergančių šunų amţius neturėjo įtakos P.

aeruginosa išskyrimui (p>0,05).

8 pav. P. aeruginosa išskyrimas pagal amţių

3.4.3. Veislės įtaka P. aeruginosa išskyrimui iš kliniškai sergančių šunų ausų

Ištyrus kliniškai sergančius šunis, P. aeruginosa buvo išskirta iš 10 skirtingų veislių šunų. P.

aeruginosa buvo išskirta iš 5 (25,0 proc.) vokiečių aviganių ausų, iš 5 (25,0 proc.) koker spanielių ausų

bei iš 3 (15,0 proc.) mišrūnų ausų. Po vieną (5,0 proc.) P. aeruginosa buvo išskirta iš mopso, biglio, Vakarų Škotijos baltojo terjero, juodojo rusų terjero, bordo dogo, staforšyro terjero ir pudelio (9 pav.).

30,0% 45,0% 20,0% 5,0% (0-3] (3-6] (6-9] (9-12]