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II. Materiali e metodi
II.1
Trattamento degli animali
Per gli esperimenti sono stati utilizzati topi transgenici CRE-LacZ adulti, di età superiore a P70 e topi wt adulti e nel periodo critico. I topi transgenici fondatori della colonia vengono incrociati con topi wt e il transgene si mantiene così nei topi eterozigoti il cui genotipo viene evidenziato mediante PCR. Tutti gli animali sono apparsi sani e privi di alcun tipo di anomalia degli occhi e sono stati trattati secondo un protocollo sperimentale approvato dal Ministero Italiano della Sanità. Gli animali sono allevati in uno stabulario organizzato con un normale ciclo luce-buio.
II.2 Impianto della minipompa
Si prepara una soluzione di tricostatina A (TSA, inibitore dell'istone deacetilasi) e fisiologica (NaCl 0,9%) in rapporto 1:1000. Tale soluzione viene iniettata intracorticalmente mediante l'utilizzo di una minipompa. La minipompa è costituita da un serbatoio e da una cannula.
Il serbatoio è rivestito da un membrana impermeabile non rigida. Tra questa membrana e la parete semipermeabile della minipompa è presente del materiale che assorbe liquido per osmosi dalla parete . L’assorbimento causa un aumento del volume che si riflette in una diminuzione del volume del serbatoio e nella fuoriuscita del contenuto.
La cannula è costituita da un corto tubicino di plastica e metallo che pesca nel serbatoio e dalla punta di un ago ritorta a 90° rispetto al tubicino, che viene introdotta nella corteccia; la lunghezza della componente ricurva è di 1,6 mm, sufficiente a superare lo spessore delle meningi e a penetrare nei primi strati della corteccia.
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viene lasciata riposare una notte o, alternativamente, posta per 2h in una stufa a 37°, per permettere alle membrane di assorbire in maniera ottimale il liquido contenuto nel serbatoio. Trascorso il tempo necessario le minipompe sono pronte per essere innestate nella corteccia. L'intero contenuto di ciascuna minipompa viene riversato in corteccia in una settimana.
I topi CRELacZ vengono anestetizzati con una dose di avertina adeguata (1ml/50gr), una volta anestetizzati si procede incidendo la cute cranica in modo da portare alla vista la superficie ossea e successivamente si pratica un foro, con un ago del diametro della cannula, in una sola delle ossa parietali, nel punto in cui verrà innestata la minipompa.
Il sito d'innesto viene preso in coordinate stereotassiche, a partire dalla sutura lamba 3mm rostralmente e 4mm lateralmente.
La minipompa impiantata nella corteccia viene infine bloccata con del cemento per dentisti (Formatray) che assicura la permanenza della stessa nel sito d'innesto per l'intera durata dell'esperimento.
A questo punto i topi vengono sottoposti ad un periodo di buoi assoluto della durata di 2 giorni e mezzo al termine del quale vengono esposti alla luce per 12h. Questo stesso protocollo sperimentale è già stato utilizzato in esperimenti volti ad individuare i livelli di attivazioni di CREB in seguito ad esperienza visiva (Cancedda et al 2003).
Al termine del ciclo buio-luce gli animali vengono uccisi e i cervelli, immediatamente asportati, subiscono un trattamento specifico per individuare l'eventuale presenza della β-galattosidasi prodotta dal gene LacZ. La regione più rostrale dei cervelli, a partire da un mm oltre il sito d'innesto della minipompa, viene asportata e utilizzata per il western blot (vedi oltre); i cervelli così squadrati vengono lasciati immersi in una soluzione di fissativo (parafolmaldeide 3% in PB 0,1M) in ghiaccio per 2h, trascorse le quali sono sottoposti a due lavaggi consecutivi, della durata di 30 minuti ciascuno, in soluzione A (2mM MgCl2 in 10 mM PBS ) e, successivamente, ad un singolo lavaggio, sempre della durata di 30 minuti, in soluzione B (MgCl2 2mM, Igepal CA630 0,02%, sodium deoxycholate 0,01% in PB 0,1M), il tutto sempre a temperatura ambiente. Al termine del lavaggio in soluzione B i cervelli trascorrono una notte a 37° immersi in un ml di soluzione C contenente la soluzione B, K3Fe(CN)6 5mM, K4Fe(CN)6 5mM e 0,6 mg/ml 5-bromo-4-cloro-3-indolyl-β−D−galactopyranoside (Xgal; Sigma).
La soluzione C contiene Xgal, l'agente che reagisce con la β-galattosidasi dando luogo ad una reazione istochimica che culmina con la colorazione della cellula in blu. Se vi è stata espressione del gene questa appare macroscopicamente nella colorazione della corteccia.
Al termine di questo procedimento i cervelli vengono conservati a 4°C in una soluzione di saccarosio 30% in PBSe sodio azide (0.05 %) fino a quando non vengono tagliati al microtomo congelatore per ottenere
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delle sezioni coronali di 50 micron.
Le fettine di corteccia visiva così ottenute vengono colorate con il rosso neutro al fine di ottenere un maggior contrasto fra le cellule marcate e lo sfondo; precedentemente montate su vetrino gelatinato, vengono fatte asciugare e successivamente disidratate in alcool etilico 95% per 15 minuti. Immediatamente dopo i vetrini passano in acqua per pochi secondi e poi nel rosso neutro per circa 3 minuti; seguono lavaggi in alcool a 85%, 95% e 100% per ripulire i vetrini del colore in eccesso.
Infine i vetrini puliti vengono immersi in Xilolo e successivamente chiusi con montante pronti per essere guardati.
I vetrini così colorati vengono osservati al microscopio al fine di valutare l'entità dell'espressione del gene LacZ quantitativamente e qualitativamente ovvero in termini di numero e distribuzione corticale delle cellule marcate.
La conta delle cellule è stata effettuata manualmente con l'ausilio di un software (Neurolucida) che delimita, già nell'immagine del microscopio, un campo (800 micron x 800 micron) all'interno del quale è possibile contare le cellule. Le regioni della corteccia osservate sono la corteccia visiva e una regione posta ad un quadrante (800 micron) di distanza dal sito d'innesto della minipompa; l'obiettivo utilizzato il 10X.
II.3 Tecnica del western blotting
Il protocollo sperimentale del western blotting è stato utilizzato sulle cortecce di animaliadulti e all'interno del periodo critico (P26-28) non trattati con TSA; in quest'ultimo caso i topi sono stati divisi in tre gruppi, dark reared (dr), 40 minuti e 90 minuti, a seconda dei tempi d'esposizione alla luce successivi ai 2 giorni e mezzo di buio. Nell’esperimento in cui è previsto l’utilizzo dell’inibitore SL237 questo è stato iniettato negli animali intraperitonealmente prima del ciclo buio-luce.
Gli animali vengono decapitati e le cortecce visive rapidamente prelevate, pesate e raccolte in apposite provette. Ogni operazione viene eseguita in ghiaccio. A tutti i campioni viene aggiunto un volume, pari a 3 volte il proprio peso, del tampone di lisi (10mM TRIS HCl ph7,4; 1mM EDTA, 2,5 mM sodiopirofosfato, 1mM beta-glicerofosfato, 1mM sodiortovanadato, 1mM PMSF, 10mM aprotinina, 10mM leupetina, 1% Igepal CA 630).
Successivamente il tessuto viene omogeneizzato con il trituratore meccanico e dopo circa mezz’ora, attraverso varie centrifugazioni, si passa all’estrazione delle proteine istoniche. Dalla prima centrifugazione
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(18000 Cg, 15min, a 4°C) si ottiene un pellet; gli istoni vengono estratti dal pellet nucleare per mezzo di 5 volumi di 0,2M HCl e 10% glicerolo, e centrifugati a 18000 Cg, per 30minuti a 4°C.
A questo punto gli istoni si trovano nel surnatante e vengono fatti precipitare mediante l'aggiunta di 10 volumi di acetone e successiva centrifugazione di 30min a 18000 Cg, a 4°C. Il pellet ottenuto viene risospeso in una soluzione di urea 9M.
In seguito si passa alla misurazione delle concentrazioni in microgrammi di proteine con il metodo di Bradford. I campioni vengono preparati per la corsa sul gel di acrilammide (12%) mediante aggiunta di un agente riducente e di un loading buffer e sottoposti a bollitura prima del caricamento. La corsa sul gel viene effettuata a 200V per 45 minuti, mentre il trasferimento delle proteine sul filtro di nitrocellulosa avviene in 30 minuti a 100V.
I filtri, a questo punto, vengono immersi in una soluzione bloccante costituita da BSA 4% o MILK 4% e contenente Tween-20 allo 0,2%, per circa due ore. Successivamente si passa all’incubazione dei filtri con i rispettivi anticorpi primari contro l’istone H3 mouse 1:500, Upstate) e contro l’acetil istone H3 (anti-rabbit, 1:500 Upstate), per 12 ore a 4 °C.
Dopo tale periodo i filtri vengono sottoposti a tre lavaggi, due in TBS (Tris HCl a PH 7,4 50 mM e NaCl 150 mM) e uno in TTBS (Tween-20 allo 0,1% in TBS) e incubati con un anticorpo secondario coniugato alla perossidasi di rafano per due ore a temperatura ambiente.
Dopo i tre lavaggi sopra descritti si passa alla rilevazione con reagenti ECL e all’esposizione alla lastra. Le bande, rivelate dallo sviluppo della lastra, sono dapprima acquisite al computer mediante uno scanner di immagini e successivamente ne viene analizzata la densità ottica con un software di analisi.
