Introduzione
L’elettronica, nell’ultimo secolo, ha dato impulso a molteplici sviluppi, sia in campo scientifico che tecnologico, in settori anche molto diversi fra loro. L’uso della tecnologia dei semiconduttori ha avuto un grandissimo impatto sulla vita di tutti i giorni, fornendo i dispositivi elettronici più svariati; la combinazione di funzioni dei vari dispositivi (circuiti elettronici) per la realizzazione delle più diverse apparecchiature di uso corrente è di immediata percezione.
I confini delle applicazioni dell’elettronica si stanno ancora allargando e, negli ultimi anni, sempre più frequentemente, se ne hanno utilizzazioni in settori tradizionalmente riservati ad altre discipline scientifiche, come per esempio la biochimica e la medicina.
L’interazione fra campi di ricerca spesso molto distanti fra loro impone una maggiore ecletticità da parte di coloro che si avvicinano a studi interdisciplinari, in cui ciascuno porta le proprie conoscenze, ma deve essere in grado di recepire ed usare anche competenze che provengono da aree culturali talvolta molto diverse tra loro.
In particolare, l’integrazione tra discipline elettroniche e discipline biochimiche o biomediche è particolarmente complessa, in quanto tutti gli
II elementi che sono necessari per realizzarla sono in sé complessi; nello stesso tempo essa è una sfida affascinante e la grande quantità di studi cui ha dato origine ne è una testimonianza.
In questo lavoro di tesi viene preso in esame il DNA, che, storicamente, è stato oggetto di molti studi da parte di biologi e biochimici, ma che, negli ultimi decenni, ha interessato sempre più anche altri campi di ricerca e svariati settori applicativi (come per esempio il campo della medicina forense, della medicina legale, dell’agricoltura, delle malattie dovute a inquinamento ambientale, nello studio degli effetti delle radiazioni sugli organismi viventi…).
La molecola del DNA (acido desossiribonucleico) è depositaria dell’informazione genetica: essa contiene infatti tutti quegli elementi ereditari (i geni) che determinano le proprietà innate e la specificità di ciascun organismo vivente. Il DNA è costituito da una sequenza di basi (adenina, citosina, guanina e timina) il cui ordine determina le caratteristiche di un individuo di una certa specie; molte delle malattie dell’uomo derivano da difetti o mutazioni nella sequenza delle basi.
Partendo da considerazioni sulle caratteristiche biologiche del DNA è stato possibile identificare errori nella sequenza usando frammenti di DNA sintetico detti sonde oligonucleotidiche. Queste sonde sono in grado di legarsi in modo altamente specifico e selettivo al DNA da esaminare, qualora sia presente in esso una sequenza complementare alla sonda stessa (ibridazione). Sonde marcate con “etichette” facilmente rilevabili possono essere impiegate per stabilire se il campione di DNA in esame contiene una data sequenza di basi, identificando eventuali mutazioni. Di qui l’importanza che questi studi hanno nello studio di malattie genetiche, del cancro e della sindrome da immunodeficienza acquisita (HIV).
Il numero di basi che compongono la macromolecola del DNA è enorme e l’estrapolazione del genoma umano richiede oltre 50 milioni di operazioni di sequenziamento, ovvero analisi complesse che permettono di
III ricostruire la sequenza delle basi. La strumentazione usata per queste analisi è piuttosto complessa, ingombrante, costosa, lenta e fortemente dipendente dall’intervento umano.
Le tecnologie usate in microelettronica possono essere impiegate per la realizzazione di microsistemi che automatizzano i processi di analisi e in cui le varie parti (o almeno alcune parti) del complesso sistema di sequenziamento avvengano su un singolo chip.
L’obiettivo finale è la realizzazione di un “Lab on Chip”, cioè la realizzazione di un unico dispositivo integrato che, in maniera autonoma, riesca a realizzare le procedure biochimiche necessarie per l’analisi del DNA. La miniaturizzazione consente un aumento di velocità nell’esecuzione dei test ed una riduzione dei costi, grazie alla possibilità di produzione in serie e alla riduzione del volume dei reagenti impiegati.
Inoltre l’automazione delle procedure riduce il rischio di errori da contaminazione e permette di eseguire test in parallelo, abbattendo i tempi di analisi.
Attualmente la miniaturizzazione riguarda principalmente sottosistemi di analisi e l’integrazione su un unico chip è parziale; nonostante ciò, i risultati ottenuto sono stati di ottimo livello.
Questa tesi ha come obiettivo l’introduzione nel mondo del DNA, considerando sia gli aspetti biologici che quelli di analisi, intesa come capacità di sequenziamento, del DNA stesso.
È stata data importanza all’aspetto biologico, partendo dal presupposto che una sua conoscenza possa essere essenziale per comprendere l’importanza che la molecola del DNA ha per gli organismi viventi. Nel primo capitolo viene quindi descritta la struttura del DNA e come, a partire dalla sequenza di basi contenuta nel DNA, avviene la sintesi delle proteine (parte essenziale di tutte le cellule, animali e vegetali) e l’influenza di eventuali mutazioni su tale sintesi.
IV Nel secondo capitolo vengono descritti i passi necessari per effettuare una analisi del DNA, dando particolare importanza all’amplificazione dei campioni tramite la PCR, la loro separazione per mezzo dell’elettroforesi e all’introduzione delle metodologie di sequenziamento (tecniche che permettono la determinazione delle basi di un frammento di DNA sotto analisi). La PCR è una tecnica che consente di produrre un quantitativo enorme di copie del DNA da esaminare in modo da avere materiale sufficiente per effettuare una analisi completa. Con l’elettroforesi si ottiene la separazione di molecole di dimensioni diverse, consentendo l’applicazione delle tecniche di sequenziamento.
Nel terzo capitolo viene riportata la descrizione di strumentazioni microfabbricate che usano sia la metodologia dell’ibridazione (sono presentate realizzazioni di microarray che sfruttano tale principio di analisi) che di sequenziamento per l’analisi del DNA. Le tecniche di fabbricazione dei microdispositivi sono simili a quelle usate nell’industria dei semiconduttori. In questo momento i risultati migliori di sequenziamento si hanno usando dispositivi microfabbricati su vetro, che permettono sequenziamenti in parallelo e usano la tecnica di rivelazione LIF (“Laser Induced Fluorescence”). Infine sono presentate alcune realizzazioni di microdispositivi su silicio. In particolare, viene analizzato un sistema per elettroforesi capillare, con sistema di rivelazione integrato realizzato con fotodiodi, e un prototipo di “Lab on Chip” monolitico, che integra sullo stesso substrato l’operazione di amplificazione, mediante PCR, con la rivelazione, mediante ibridazione.
