riassunto
RIASSUNTO
Questa tesi sperimentale ha come argomento di ricerca lo studio dei meccanismi alla base dell’apprendimento e della memoria a lungo termine. Sono state utilizzate tecniche di biologia molecolare per individuare modificazioni dell’espressione genica alla base degli eventi di apprendimento e memoria nel sistema nervoso centrale di ratto.
Il lavoro sperimentale è stato suddiviso in due parti.
Nella prima parte sono stati studiati i meccanismi molecolari alla base della memoria indotta dall’apprendimento contestuale alla paura o contextual fear conditional (CFC) utilizzando tecniche di trascrittomica.
Ratti sottoposti a CFC mostrano freezing tutte le volte che sono reinseriti nell’apparato di condizionamento dal giorno del condizionamento e nei 28 giorni successivi. Esperimenti, effettuati su slices di ippocampo ottenute da animali sottoposti a CFC, hanno mostrato un aumento dell’eccitabilità nella regione CA1, a partire da 0 fino a 7 giorni dopo l’addestramento. Tali modificazioni comportamentali ed elettrofisiologiche persistenti nel tempo hanno suggerito una possibile modificazione dell’espressione genica. Per identificare i geni la cui espressione è modulata dopo 48h dal CFC, i cDNA ottenuti dalle regione mediotemporali dei cervelli di ratti sottoposti al condizionamento, sono stati comparati con i cDNA isolati dai cervelli di ratti di controllo (naϊve), mai entrati nell’apparato di condizionamento. È stata utilizzata la tecnica dell’ibridazione sottrattiva soppressiva (Suppression Subtractive Hybridisation, SSH). Questa tecnica permette l’isolamento di geni sia poco che molto espressi e si basa sulla costruzione di due librerie forward e reverse. Le librerie ottenute sono state clonate e sottoposte a screening. I cloni candidati ad
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essere differenzialmente espressi sono stati sequenziati e le sequenze ottenute sono state comparate con quelle depositate in GenBank, utilizzando software come BLAST e FASTA. L’analisi di espressione dei geni isolati è stata eseguita tramite RT real-time PCR.
Nella seconda parte del lavoro sono stati analizzati, in modo più completo rispetto ad esperimenti precedenti, gli effetti dell’applicazione di Acetil-L-Carnitina 2mM (ALC) sull’espressione genica nel cervello di ratto in seguito a trattamento cronico per 21 giorni. L’ALC è una sostanza naturale conosciuta per migliorare le performance cognitive e per avere azioni neuroprotettive.
Con l’utilizzo di tecniche di proteomica (western blot) sono stati confermati e quantificati i livelli di sintesi di proteine i cui geni sono risultati essere differenzialmente espressi in seguito a trattamento con ALC.
I due differenti approcci sperimentali utilizzati in questo lavoro di tesi hanno avuto il comune scopo di identificare target molecolari coinvolti nei processi di memoria e di neuroprotezione anche in seguito a
trattamento con ALC.
