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MATERIALI E METODI
3.1
Copolimeri a blocchi
I polimeri oggetto di studio sono stati sintetizzati dal gruppo di ricerca del Professor Giancarlo Galli del Dipartimento di Chimica e Chimica Industriale dell’Università di Pisa.
Partendo da monomeri e macroiniziatori grazie ad una polimerizzazione controllata a trasferimento di atomo sono stati preparati i copolimeri a blocchi che compongono i rivestimenti.
Il macroiniziatore
La sintesi del macroiniziatore polisilossanico bromo terminato è avvenuta a partire da 5,00 g di polidimetilisilossanomonocarbinol terminato che sono stati posti in un pallone di reazione a 2 colli sul quale è stato preventivamente montato un refrigerante a ricadere. Effettuati 3 cicli vuoto-azoto sono stati aggiunti 85 ml di tetraidrofurano anidro e 1,74 ml di trietilammina, in atmosfera di N2 e sotto agitazione. Sono stati
aggiunti lentamente, mediante un imbuto gocciolatore, 0,77 ml di α-bromoisobutirril bromuro sotto vigorosa agitazione. La reazione è portata avanti a temperatura ambientale (22 ± 2 °C) per 24 ore.
La soluzione è stata filtrata su buchner per separare i sali di bromo formatisi e il solvente di reazione è stato eliminato per evaporazione al rotavapor. Il prodotto di reazione è risultato essere una fase oleosa, la quale è stata disciolta in 25 ml di diclorometano e quindi lavata più volte in imbuto separatore prima con una soluzione satura di NaHCO3, poi con una di HCl al 2,5% ed infine con acqua distillata. La fase
organica isolata è stata disidratata su disolfato di magnesio per una notte, solo infine il solvente è stato eliminato sotto vuoto al fine di ottenere il prodotto puro di Si10-Br (resa 99%).
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Fig. 3.1 - Reazione di esterificazione per la produzione del macroiniziatore.
Il polimero AF
La preparazione dell’omopolimero p(AF)è avvenuta in un clarius di polimerizzazione da 100 ml, munito di ancoretta magnetica, in cui sono stati posti 0,505 g di monomero AF, 5 mg di iniziatore AIBN e 3 ml di TFT. La miscela è stata degassata mediante 3 cicli congelamento-scongelamento sotto vuoto. La polimerizzazione è stata condotta a una temperatura di 65°C in bagno ad olio per 48 ore. La miscela, dopo essere stata raffreddata a T ambiente, è stata precipitata per due volte in metanolo. Il polimero è stato portato a secco. Il prodotto finale p(AF) ha avuto una resa del 47% ed è stato caratterizzato mediante spettroscopia.
Fig. 3.2 - Formula dell’omopolimero p(AF)
Il polimero PEG
La preparazione dell’omopolimero p(PEG) è avvenuta in un clarius di polimerizzazione da 100 ml, munito di ancoretta magnetica, in cui sono stati introdotti 1,526 g di monomero PEG, 19 mg di iniziatore AIBN e 7 ml di diglima. La miscela è stata degassata mediante 3 cicli congelamento-scongelamento sotto vuoto mediante pompa
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meccanica. La polimerizzazione è stata condotta a una temperatura di 65°C in bagno ad olio per 48 ore. La miscela è stata portata a temperatura ambiente, diluita con cloroformio e precipitata 2 volte in etere etilico. Il polimero così ottenuto è stato portato a secco. Il prodotto finale p(PEG) ha avuto una resa del 54% ed è stato caratterizzato mediante spettroscopia.
Fig 3.3 - Formula dell’omopolimero p(PEG).
Sintesi dei copolimeri
La sintesi del copolimero p(Si10-AF50) (dove 10 e 50 identificano il grado di polimerizzazione del polimero) è avvenuta in un clarius in cui sono stati introdotti 0,240 g del macroiniziatore Si10-Br, 6,010 g di monomero AF, 55,1 mg di HMTETA e 13 ml di TFT. Effettuati quattro cicli di congelamento-decongelamento, al fine di degassare la soluzione, sono stati aggiunti 35 mg di CuBr sotto atmosfera di N2. Sono stati effettuati
tre ulteriori cicli di congelamento-decongelamento per assicurarsi di eliminare l’eventuale ossigeno accidentalmente entrato nel clarius. La reazione è stata condotta per 66 ore a 115°C.
Al termine della reazione la soluzione è stata raffreddata a temperatura ambiente (22 ± 2 °C) e portata a 25 ml mediante aggiunta di TFT, quindi lavata con porzioni da 50 ml di acqua distillata fino a scomparsa della caratteristica colorazione blu. Dopo lavaggio sono state eseguite due precipitazioni consecutive in metanolo, lasciando in agitazione per 12 ore.
Il prodotto è stato solubilizzato con 5 ml di TFT e portato a secco per evaporazione sotto vuoto. La resa è stata del 52%.
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Fig. 3.4 - Formula generale del copolimero a blocchi p(Six-AFy).
La sintesi del copolimero a blocchi p(Si10-PEG44) (dove 10 e 44 identificano il grado di polimerizzazione del polimero) è avvenutain un clarius in cui sono stati introdotti 0,300 g di macroiniziatore Si10-Br, 2,714 g di PEG, 70,1 mg di HMTETA e 7 ml di anisolo. Effettuati quattro cicli di congelamento-decongelamento, al fine di degassare la soluzione, sono stati aggiunti 50 mg CuBr sotto atmosfera di N2. Si effettuano tre
ulteriori cicli di congelamento-decongelamento per assicurarsi di eliminare l'eventuale ossigeno accidentalmente entrato nel clarius. La reazione è stata condotta per 66 ore a 115°C.
Al termine della reazione la soluzione è stata raffreddata a temperatura ambiente (22 ± 2 °C) e portata a 25 ml mediante aggiunta di anisolo, quindi lavata con porzioni da 50 ml di acqua distillata fino a scomparsa della caratteristica colorazione blu. Dopo lavaggio sono state eseguite due precipitazioni consecutive in metanolo, lasciando in agitazione per 12 ore.
Il prodotto è stato solubilizzato con 5 ml di anisolo e portato a secco per evaporazione sotto vuoto. La resa è stata del 64.2%.
Il prodotto finale p(Si10-PEG44) è stato caratterizzato mediante spettroscopia.
Fig. 3.5 - Formula generale del copolimero a blocchi p(Six-PEGz)
Preparazione e deposizione dei film polimerici
I copolimeri sono stati depositati su vetrini portaoggetto con l’obiettivo di valutare la loro prestazione biologica. E’ stata progettata una geometria denominata a doppio strato (Fig. 3.6) in cui è stata utilizzato PDMS di-silanol terminato (OH-PDMS-OH) come
matrice silossanica, poli(dietossisilossano) come reticolante e bismuto neodecanoato (BiND) come catalizzatore in etil acetato.
Fig. 3.6 - Rappresentazione del film doppio
Per la preparazione di questi film polimerici sono stati utilizzati vetrini FORLAB da microscopio 76 x 26 mm preventivamente lavati con acetone e conseguentemente messi in stufa a 120°C per 20 minuti. Il primo strato è stato depositato mediante spray
usando una soluzione con la seguente composizione:
• 5 g di poli(dimetilsilossano) (OH
• 125 mg di poli(dietossisilossano) utilizzato come reticolante (ES40)
• 50 mg di bismuto ne
• 25 ml di acetato di etile
I vetrini, a questo punto, sono stati tenuti a temperatura ambiente per 12 ore dopo le quali sono stati messi in stufa sotto vuoto a 120°C per 12 ore.
Il secondo strato è stato depositato u
soluzione e lasciando i vetrini a temperatura ambiente per 24 ore e subito dopo in stufa sotto vuoto a 120°C per 12 ore.
L'ultimo strato è stato depositato tramite spray
utilizzata la stessa soluzione nella quale però sono state aggiunte percentuali in peso del 2% e del 10%, rispetto a OH
P(Si10-AF50). In questo caso i vetrini sono stati lasciati a temperatura ambiente pe ore ed in stufa sotto vuoto a 120°C per 12 ore.
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matrice silossanica, poli(dietossisilossano) come reticolante e bismuto neodecanoato atore in etil acetato.
Rappresentazione del film doppio-strato
Per la preparazione di questi film polimerici sono stati utilizzati vetrini FORLAB da preventivamente lavati con acetone e conseguentemente messi 0°C per 20 minuti. Il primo strato è stato depositato mediante spray
usando una soluzione con la seguente composizione:
5 g di poli(dimetilsilossano) (OH-PDMS-OH)
125 mg di poli(dietossisilossano) utilizzato come reticolante (ES40) neodecanoato come catalizzatore (BiND)
25 ml di acetato di etile
I vetrini, a questo punto, sono stati tenuti a temperatura ambiente per 12 ore dopo le quali sono stati messi in stufa sotto vuoto a 120°C per 12 ore.
Il secondo strato è stato depositato utilizzando un volume maggiore della medesima soluzione e lasciando i vetrini a temperatura ambiente per 24 ore e subito dopo in stufa sotto vuoto a 120°C per 12 ore.
L'ultimo strato è stato depositato tramite spray-coating ed, anche in questo caso, è stata utilizzata la stessa soluzione nella quale però sono state aggiunte percentuali in peso del 2% e del 10%, rispetto a OH-PDMS-OH, per i due copolimeri attivi p(Si10
AF50). In questo caso i vetrini sono stati lasciati a temperatura ambiente pe ore ed in stufa sotto vuoto a 120°C per 12 ore.
matrice silossanica, poli(dietossisilossano) come reticolante e bismuto neodecanoato
Per la preparazione di questi film polimerici sono stati utilizzati vetrini FORLAB da preventivamente lavati con acetone e conseguentemente messi 0°C per 20 minuti. Il primo strato è stato depositato mediante spray-coating
125 mg di poli(dietossisilossano) utilizzato come reticolante (ES40)
I vetrini, a questo punto, sono stati tenuti a temperatura ambiente per 12 ore dopo le
tilizzando un volume maggiore della medesima soluzione e lasciando i vetrini a temperatura ambiente per 24 ore e subito dopo in stufa
coating ed, anche in questo caso, è stata utilizzata la stessa soluzione nella quale però sono state aggiunte percentuali in peso del OH, per i due copolimeri attivi p(Si10-PEG44) AF50). In questo caso i vetrini sono stati lasciati a temperatura ambiente per 12
31 Polimero mg HO-PDMS-OH g ES40 mg BiND mg Acetato di etile ml p(Si10-PEG44)/2% 100 4,9 125 50 25 p(Si10-PEG44)/10% 500 4,5 125 50 25 p(Si10-AF50)/2% 100 4,9 125 50 25 p(Si10-AF50)/10% 500 4,5 125 50 25
Tab. 3.1 - Formulazione della soluzione di casting dello strato superiore dei film doppio-strato p(Si10-PEG44)/w% e p(Si10-AF50)/w%.
3.2 Saggi Biologici
I polimeri descritti precedentemente sono stati sottoposti ad una serie di valutazioni di carattere sia ecotossicologico, utilizzando lisciviati quale matrice di test, che di efficacia, impiegando saggi sia di laboratorio che test su campo. I protocolli che sono stati scelti sia per saggiare l’efficacia che la tossicità dei diversi campioni utilizzano organismi e metodiche ampiamente descritte in letteratura, ad eccezione del saggio di adesione con il polichete serpulide Ficopomatus enigmaticus, per il quale una metodica standard ancora non esiste.
3.3 Saggio di tossicità acuta con Vibrio fischeri: inibizione della
bioluminescenza batterica
3.3.1 Caratteristiche della specie test ed il sistema MICROTOX®
Vibrio fischeri è un batterio molto utilizzato come organismo-test per valutare la tossicità in differenti matrici acquose ambientali; è un batterio di forma bastoncellare flagellato, marino, con proprietà di bioluminescenza, largamente distribuito in tutte le acque del mondo, con una preferenza per le acque temperate e sub-tropicali. Può
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crescere in uno stato planctonico libero o vivere preferenzialmente in simbiosi con varie specie marine, in particolare con cefalopodi o pesci (Ruby e Nealson, 1976).
I test che impiegano Vibrio fischeri si basano sulla misura del decremento della luminescenza in presenza di xenobiotici (saggio di inibizione della bioluminescenza): la diminuzione della luminosità misurata è infatti correlata con un decremento della respirazione cellulare e può essere utilizzata come misura indiretta della tossicità del composto preso in esame. La risposta dei batteri bioluminescenti alle perturbazioni è stata dimostrata da molti studi su una grande varietà di culture di organismi bioluminescenti (Scheerer et al., 2006). Grazie alla sua rapidità ed economicità, questo metodo è molto utilizzato sia per testare la tossicità di sostanze pure, sia come monitor per determinare la qualità di acque marine e dolci (Onorati et al., 2004).
Il metodo consente di valutare la tossicità acuta di campioni o estratti provenienti da corpi idrici d’acqua dolce, marina o salmastra utilizzando come risposta l’inibizione della bioluminescenza naturalmente emessa dai batteri marini della specie Vibrio fischeri. La bioluminescenza emessa da una popolazione monospecifica di 106 cellule di batteri Gram-negativi appartenenti alla specie Vibrio fischeri, è stata utilizzata per un saggio del tipo “screening test” a 5 e 15 minuti per individuare la percentuale massima di effetto di un campione testato al 100% di concentrazione (senza diluizioni). Qualora la percentuale massima di effetto superi il 50%, si procede alla ricerca dei parametri ecotossicologici EC20/EC50 (Effective Concentration 20/50 %: concentrazione che
produce un effetto, nel caso specifico diminuzione della bioluminescenza, sul 20/50 % della popolazione di batteri utilizzata).
3.3.2 Preparazione delle matrici e lisciviazione dei coatings
Per la determinazione della tossicità acuta dei prodotti di rilascio dei coatings oggetto dello studio con V. fischeri è stato adottato un protocollo di lisciviazione seguendo la metodica ISO 15181-1, apportando alcune modifiche legate alle superfici di deposizione dei coatings. I coatings, deposti su vetrini della dimensione di 2x2.5 cm (superficie 5 cm2), sono stati immersi in un acquario della capacità di 80 litri riempito con acqua di mare sintetica (sali InstantOcean + acqua di rete) alla salinità del 34‰, pH compreso nel range 7.8-8, temperatura 21±1 °C. I campioni sono stati sospesi appena sotto la
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superficie dell’acqua in gabbiette di materiale plastico appositamente predisposte sotto un flusso costante di acqua di circa 3 litri/min, generato da una pompa sommergibile immersa in un comparto filtrante riempito con carbone attivo (Fig.3.7). L’acqua è stata rinnovata per 2/3 ogni 3 giorni.
Il lisciviato dei campioni è stato ottenuto prelevando i vetrini e ponendoli singolarmente in provette Falcon da 50 ml per 24 h contenenti acqua di mare naturale (salinità del 34‰, pH compreso nel range 7.8-8) sotto vigorosa agitazione su un agitatore orbitale. Al termine delle 24 h il campione di acqua è stato prelevato e immediatamente congelato a -20 °C fino all’esecuzione delle analisi; i vetrini sono stati invece immediatamente riposizionati nell’acquario fino alla successiva procedura di lisciviazione. L’acqua di mare naturale è stata utilizzata come controllo durante l’esecuzione del saggio biologico con V. fischeri. I coatings sono stati lisciviati dopo 1, 3, 7, 14, 21, 28 giorni, rispettivamente.
Fig. 3.7 – Alloggio in plastica dei vetrini, a sinistra, è stato posizionato nell’ acquario per la lisciviazione dei campioni (a destra).
Strumentazione
• Congelatore per la conservazione delle colture batteriche a -20°C;
• Termostato per mantenere le cuvette del saggio a 15±1°C;
• Luminometro in grado di leggere a 490 nm di lunghezza d’onda con una cella di misura termostatata a 15±1°C (figura 3.8);
34 Fig. 3.8 – Luminometro Microtox®
• pH-metro;
• Software MicrotoxOmni; • Salinometro (Atago, S/Mill-E);
• Micropipettea volume variabile da 10 a 200 mL e da 200 a 5000 mL con adeguati puntali.
Tutti gli accessori destinati a venire in contatto con la sospensione batterica sono stati trattati in maniera da non rilasciare sostanze tossiche.
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3.3.3 Allestimento del saggio
3.3.3.1 Reagenti e materiali
Organismo test
Per il saggio è stato utilizzato il ceppo NRRL-B-11177 della specie Vibrio fischeri. Sono stati utilizzati per tutte le prove batteri di provenienza commerciale liofilizzati (EcotoxSrL) ed appartenenti allo stesso lotto.
Soluzione diluente (soluzione standard)
Come diluente è stata utilizzata acqua di mare naturale. Il pH è stato aggiustato a 7 ± 0,2 con sodio idrossido (NaOH) 1 M o con acido cloridrico (HCl) 1 M. Questa soluzione può essere conservata per settimane a 4° C ma il pH della soluzione deve essere sempre controllato e, se necessario, aggiustato ogni giorno al momento d’uso.
Soluzione ricostituente
E’ stata utilizzata una soluzione di provenienza commerciale (EcotoxSrL), composta da:
• 8 g di D(+)glucosio monoidrato (C6H12O6·H2O); • 20 g di NaCl;
• 2,035 g di magnesio cloruro esaidrato (MgCl2·6H2O); • 0,30 g di potassio cloruro (KCl);
in 1 litro di acqua distillata e portata a pH 7±0,2, concentrazione salina finale=2%.
3.3.3.2 Procedure
Riattivazione dei batteri
I batteri disidratati (EcotoxSrL) sono stati riattivati prima dell’uso, aggiungendo la soluzione ricostituente. La quantità da aggiungere può variare in considerazione della procedura del saggio, tenendo presente che la quantità di batteri nella cuvetta finale del saggio non deve comunque essere inferiore a 106 cellule per cuvetta. Nel nostro caso sono state seguite le indicazioni e le istruzioni del produttore. Si ricostituisce 1 fiala di sospensione batterica liofilizzata in 1 mL di soluzione ricostituente (Microtox). Poiché
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la sospensione batterica liofilizzata non deve essere messa a contatto con i puntali delle micropipette si procede come segue:
• Si pone 1 mL di soluzione ricostituente in una cuvetta e si lascia termostatare per 15 minuti ad una temperatura di +4 °C
• Si apre una fiala di sospensione batterica liofilizzata
• Si rovescia il liquido ricostituente dalla cuvetta nella fiala, si agita cercando di sciogliere tutti i batteri
• Si rovescia rapidamente la sospensione dalla fiala nella cuvetta cercando di perderne il meno possibile
• Si lascia termostatare la cuvetta nella apposita cella a 5 °C per almeno 30 minuti.
La sospensione batterica può essere utilizzata nelle 3-4 ore successive alla riattivazione.
Preparazione del reagente diluito Il reagente viene diluito come segue:
F5= 150 µL reagente (batteri ricostituiti) + 1350 µL diluente (acqua di mare filtrata a 0.45 µm).
Con questa diluizione il rapporto tra i volumi del reagente e del diluente è di 1:10 (volume:volume).
37 Allestimento delle cuvette
Le cuvette sono state allestite come riportato di seguito.
Il reagente diluito viene distribuito nelle cuvette da B1-B4 e da C1-C4
Lettura delle cuvette
Si procede inserendo la cuvetta posizionata in B1 in cella di lettura, e si esegue la lettura Io corrispondente all’intensità luminosa iniziale, in seguito si procede alle letture delle file B e C come indicato dal software.
Si trasferiscono 900 µL da A1 in B1 e poi altri 900 µL in C1.
Si ripete l’operazione anche per A2-B2 e C2; per A3-B3 e C3; per A4 in B4 e C4.
1 2 3 4 5 A 2.5 mL diluente 2.5 mL camp. 1 2.5 mL camp. 2 2.5 mL camp. 3 B C D E F r.d. 1 2 3 4 5 A 2.5 mL diluente 2.5 mL camp. 1 2.5 mL camp. 2 2.5 mL camp. 3 B 100 µL r.d. 100 µL r.d. 100 µL r.d. 100 µL r.d. C 100 µL r.d. 100 µL r.d. 100 µL r.d. 100 µL r.d. D E F r.d.
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Un timer programmato consente di effettuare una prima lettura a 5 minuti e una successiva a 15 minuti. In questo test si effettuano due repliche B e C per ogni campione con due bianchi (fig. 3.9).
Fig. 3.9 - Disposizione cuvette nel luminometro
Il software (MicrotoxOmni) fornisce automaticamente un valore di inibizione percentuale della bioluminescenza rispetto al controllo. Se tale valore supera il valore soglia del 20% (I%>20%) per uno o più campioni, si procede all’analisi del o dei campioni “positivi” mediante un test completo, alla ricerca del parametro ecotossicologico EC20/50.
Tossico di riferimento
Per il controllo della qualità del lotto batterico è stato utilizzato come tossico di riferimento il fenolo (C6H5OH) (Sigma). All’interno di ogni cuvetta si è mantenuta una
concentrazione nominale di 100 mg/L proseguendo con successive diluzioni scalari (1:2) fino ad ottenere almeno 10 diluizioni. Il lotto è stato considerato valido verificando che, per il fenolo, la EC50 a 30 min di incubazione fosse inferiore a 6 mg/L,
come da indicazioni del costruttore (SDS Diagnostic). La risposta dello stock al tossico deve essere lineare, la retta dose-risposta deve avere pendenza attorno ad 1 e l’R2 deve essere > 0.9.
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3.4 Test di valutazione della biomassa totale: dosaggio delle proteine
totali con il metodo di Lowry
La presente metodica è stata allestita ai fini della valutazione quantitativa della biomassa totale del biofilm colonizzante i coatings oggetto dello studio in ambiente naturale.
In questo caso è stata valutata la quantità totale di proteina distaccabile attraverso procedure meccaniche da vetrini ricoperti con i coatings oggetto di studio.
3.4.1 Allestimento del saggio
Sono stati allestiti box porta-vetrini di plexiglas trasparente (Fig. 3.10), modificati apportando aperture al fine di permettere la massima circolazione di acqua possibile all’interno dei box stessi. Ogni singolo box veniva caricato con un numero di 8 vetrini con o senza coating della dimensione di 7,6 x 2,6 cm (superficie 19.76 cm2). I vetrini, al fine di valutare la colonizzazione di una singola faccia, sono stati preventivamente coperti su una faccia con nastro telato 3M. I box venivano successivamente sospesi all’interno del porto di Viareggio ad una profondità di circa 50 cm sotto la superficie dell’acqua ed ivi mantenuti per 96 h. La temperatura e la salinità dell’acqua durante la prova si sono mantenute attorno ai valori di 23 °C e 28‰, rispettivamente.
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Al termine del periodo di incubazione i vetrini, privati del nastro protettivo su una faccia, sono stati posti in provette Falcon da 50 ml contenenti tampone fosfato 100 mM. Ogni vetrino è stato spezzato al fine di mantenere tutto il coating immerso nel tampone. Una volta raggiunto il laboratorio i vetrini sono stati sottoposti alla seguente procedura:
• il campione è stato sottoposto a 2 cicli di sonicazione di 30 secondi intervallati da un minuto di pausa in un sonicatore a bagno,
• ogni Falcon è stata sottoposta a un ciclo di vortex di 5 minuti alla massima velocità (3000 cicli/min, vortex IKA, MS2 minishaker),
• sono stati estratti dalla Falcon tutti i residui di vetro precedentemente spezzati,
• il campione è stato sottoposto ad omogeneizzazione con Potter Elvejem,
• il campione è stato sottoposto a 2 cicli di sonicazione di 30 secondi intervallati da un minuto di pausa in un sonicatore a bagno,
• il campione è stato nuovamente omogeneizzato ed, alla fine, mantenuto a -20 °C fino all’esecuzione delle analisi.
La quantità di proteine presente in ogni campione è stata misurata mediante il metodo colorimetrico di Lowry (Lowry et al., 1951).Tale metodo ad alta sensibilità si basa sulla capacità degli ioni rameici (Cu++) presenti nel reattivo di legarsi in ambiente basico con i gruppi CO-NH2 delle proteine determinando un viraggio di colore della soluzione a
violetto. La reazione è specifica per i polipeptidi e non avviene con i singoli amminoacidi in quanto richiede la presenza di almeno due gruppi CO-NH2.
Reagenti
• NaOH 0,5 M preparato e conservato a 4° C;
• Reattivo rameico preparato e conservato a 4° C:
• CuSO4 0,01% 100 mg
• Tartrato di Na e K 0,02% 200 mg;
• Na2CO3 2% 20 gr
• Reattivo di Folin diluito 1:1,5 con ∆H2O.
Strumentazione
41 Procedure
Per la determinazione delle proteine sono stati preparati 1 ml di campione tal quale in doppia serie. Oltre al campione sono stati allestiti in doppia serie un bianco, necessario per la calibrazione dello strumento di lettura, rappresentato da acqua deionizzata, ed uno standard rappresentato da 1 ml di albumina bovina (100 µg/ml).
Miscela di reazione:
- 1 ml ∆H2O per il bianco, 1 ml standard o 1 ml campione;
- Vengono aggiunti 0,5 ml NaOH 0,5 M in ogni provetta;
- Dopo 25 minuti di attesa si aggiungono 2,5 ml di reattivo rameico; - Dopo 10 minuti si uniscono 0,25 ml di reattivo di Folin;
- dopo 30 minuti viene effettuata la lettura dell’assorbanza allo spettrofotometro (Ȟ= 750 nm).
Le densità ottiche medie del campione e dello standard, la concentrazione proteica del campione è stata calcolata mediante la seguente proporzione:
∆ Ac : ∆ As =X : Y
X = ∆ Ac/ ∆ As x 100 Dove:
- ∆ Ac (∆ Assorbanza campione) = ∆ Ac - ∆ Ab (∆ Assorbanza bianco);
- ∆ As (∆ Assorbanza standard) = ∆ As - ∆ Ab (∆ Assorbanza bianco);
- X = concentrazione proteica del campione;
- Y = concentrazione proteica dello standard (100 µg/ml).
3.5 Test di rimozione con Navicula salinicola
Per testare l’efficacia delle proprietà anfifiliche dei rivestimenti è stata utilizzata come organismo modello la diatomea Navicula salinicola, in quanto le diatomee
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rappresentano uno fra i taxa più diffusa nelle comunità del fouling. Dopo un periodo di incubazione di 2 ore, che ha permesso l’adesione delle diatomee ai rivestimenti, limitandone allo stesso tempo l’aggregazione in clusters, i diversi provini sono stati sottoposti ad un flusso turbolento (sforzo di taglio ≈ 28Pa) generato in un canale appositamente assemblato per il test.
L’esperimento è stato condotto utilizzando la diatomea appartenente alla specie Navicula salinicola Hustedt 1939 [sinonimo eterotipico Navicula incerta Grunow in Van Heurk, 1880], ceppo CCAP 1050/10 proveniente dal centro Culture Collection of Algae and Protozoa (SAMS - Scottish Marine Institute, Oban, Argyll, Scotland, UK). La coltura è stata mantenuta in medium f/2 + Si Guillard’s, costituito da acqua di mare naturale (salinità 34 ‰) filtrata su membrane Millipore con porosità di 0.2 µ, sali minerali, mix di vitamine (B1, B12, biotina) e sodio meta silicato.
Le condizioni colturali sono state garantite da un termostato dotato di illuminazione con neon a luce bianca:
• temperatura: 15-20 °C
• illuminazione: circa 3000 lux, con fotoperiodo di 12 ore
• volume beute: 50 ml
• intervallo di inoculo: ogni 4 settimane
Per l’esperimento sono state allestite colture algali di 3 giorni. Il terreno di coltura e le cellule in sospensione sono state rimosse, mentre il deposito sul fondo è stato risospeso in poco volume dello stesso medium di coltura mediante l’utilizzo di uno spatola in plastica, al fine di ottenere una sospensione di cellule verosimilmente tutte in grado di aderire correttamente ad una superficie. La conta cellulare è avvenuta tramite una camera contacellule di tipo Burker, ottenendo una concentrazione algale di circa 196.000 cell/ml. Ulteriori diluizioni sono state effettuate con il medium di coltura al fine di ottenere una concentrazione algale di circa 30.000 cell/ml, ottimale per una conta efficace.
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3.5.1 Adesione delle cellule ai coatings: conta e valutazione
Ogni polimero deposto su vetrini 7.6 cm x 2.6 cm è stato testato in triplicato, con l’aggiunta di 3 repliche di vetrini con il solo PDMS. Dopo essere stati reidratati con acqua di mare per almeno 48 ore, in modo da riattivare le proprietà della superficie dei polimeri, i singoli vetrini sono stati posti in piastre Quadriperm®, ricoperti con 15 ml di sospensione algale e lasciati incubare per 2 ore a luce naturale e a temperatura ambiente (22± 2 °C). In seguito i vetrini sono stati sciacquati delicatamente con acqua di mare per rimuove le cellule non adese. Su ogni vetrino sono stati fotografati 25 campi random (ampiezza del campo = 0.8 mm2) utilizzando un microscopio ottico modello Olympus CH2 equipaggiato con fotocamera digitale “PHOTO-BIO” (Fig. 3.11). Dalle foto ottenute si è eseguita una conta che determinasse la quantità di cellulle presenti sui rivestimenti. La conta è stata effettuata tramite il software open source ImageJ 1.45S. Utilizzando questo programma le cellule vengono contate manualmente utilizzando il plug-in CellCounter che permette di indicare, numerandoli, con un contatore tutti gli oggetti che si vogliono contare all’interno dell’immagine.
Fig.3.11 - Esempio di campi microscopici per conta diatomee.
3.5.2 Il Canale a Flusso Turbolento
Per l’esperimento è stato utilizzato un apposito strumento progettato e realizzato utilizzando come riferimento il modello descritto da Schultz (Schultz et al., 2000). Si è potuto così valutare la forza di adesione e la percentuale di rimozione di Navicula salinicola.
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Fig. 3.12 – Rappresentazione schematica del canale a flusso turbolento descritto da Schultz (2000). Il sistema comprende: una pompa centrifuga, un flussometro, una camera di stabilizzazione del flusso, una sezione di scorrimento, un sistema di assemblaggio per i vetrini, un manometro digitale, un serbatoio di scarico e tubature.
L’utilizzo di questo tipo di strumento ha permesso di riprodurre il più verosimilmente possibile le condizioni che si presentano nella realtà: infatti, gli strati limite di fluido che interessano gli scafi delle imbarcazioni sono di tipo turbolento. Inoltre, un flusso d’acqua che scorre all’interno di un canale consente di effettuare un accurata determinazione dello sforzo di taglio alla parete tramite una misurazione del gradiente di pressione e la sezione rettangolare del canale ha facilitato il montaggio dei vetrini all’interno della camera di prova. Il canale a flusso turbolento comprende una pompa centrifuga in ghisa. Il motore monofase opera a 220V. La portata viene monitorata tramite un flussimetro ad ultrasuoni (Ultrasonic Flow Transmitter DW-S) provvisto di due sensori in acciaio inossidabile 1.4571 che funzionano alternativamente da trasmettitore e ricevitore, inviando un segnale nel senso della corrente e successivamente in senso inverso in modo tale che la differenza tra le due velocità ultrasoniche sia proporzionale alla velocità media del flusso.
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Fig. 3.12 – Il canale a flusso turbolento realizzato per il presente studio. Sono visibili: la sezione di scorrimento, la camera di prova, la tanica di raccolta, la pompa centrifuga edil misuratore di portata.
La precisione del flussimetro è ± 2% del valore di misura. La portata può essere regolata per mezzo di due valvole a sfera situate sul lato d’uscita della pompa e nell’anello di ricircolo. Il flusso decorre in un condotto in PVC (Ø esterno: 2 pollici) al termine del quale è situato un ugello convergente (rapporto di compressione 3.5:1) che consente un’accelerazione del flusso ed una riduzione della turbolenza di background. La sezione di scorrimento, costruita in plexiglass, presenta le seguenti misure: 7.2 mm in altezza, 104 mm in larghezza e 1050 mm in lunghezza. Per un flusso turbolento la zona d’ingresso è approssimativamente pari a 60H dall’inizio del canale, dove H indica l’altezza della sezione di scorrimento (Durst et al., 1998). Lungo la sezione sono situati quattro punti di misura a cui si raccorda un manometro differenziale a colonna che consente di misurare la differenza di pressione del flusso tra due punti della sezione stessa; in un flusso completamente sviluppato, lo sforzo di taglio alla parete è
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proporzionale alla caduta di pressione in base all’equazione (1) (Hussain e Reynolds, 1975):
τw=
−
(1)dove τw rappresenta lo sforzo di taglio alla parete, legato direttamente alla viscosità e
alle forze di taglio nel fluido e responsabile del valore delle perdite di carico lungo il condotto; H rappresenta l’altezza della sezione e dp/dx il gradiente di pressione o cadente piezometrica.
Nella parte terminale della sezione di scorrimento è collocata la camera di prova, costituita da due elementi smontabili in plexiglass in cui vengono alloggiati i vetrini con la biomassa adesa e fissati con del nastro biadesivo; ciascuna metà presenta un meccanismo di regolazione della quota che permette che i vetrini rimangano a filo con la parete del canale.
Fig. 3.13 – Particolare della camera di prova. A sinistra i due elementi smontati: sono visibili gli alloggi dei vetrini ed il sistema di regolazione che consente loro di rimanere a filo con la parete interna del canale. A destra la camera montata sulla sezione di scorrimento.
Dalla camera di prova il flusso viene convogliato in un tubo diffusore in PVC per essere infine scaricato in una tanica di raccolta da 200 litri di volume che consente di incrementare il tempo richiesto dall’intera massa di liquido contenuta al suo interno per compiere un circuito completo (e quindi di ridurre le variazioni di temperatura); le notevoli dimensioni del serbatoio consentono inoltre al flusso in ingresso di raggiungere una condizione di riposo prima di essere rimesso in moto.
In corrispondenza delle due giunture plexiglass-PVC, l’apertura della sezione è circondata da o-ring che fungono da guarnizione.
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3.5.3 Test di rimozione delle cellule algali
Il test di rimozione prevede che i vetrini siano alloggiati nella camera di test, tre sul lato superiore e tre su quello inferiore, a riformare le pareti superiore e inferiore della camera. Il test consiste nel passaggio di acqua all’interno del canale per un tempo di tre minuti con una pressione di 150 l/min, corrispondente a circa 28/30 Pascal, successivamente i vetrini vengono fotografati nuovamente con il microscopio modello ottico Olympus CH2 (obiettivo 10X) equipaggiato con fotocamera “PHOTO-BIO” con software di acquisizione fotografica ottenendo 30 campi random su cui saranno contate la cellule ancora adese. Per la conta cellulare è stato impiegato il software ImageJ 1.45S, mediante il plug-in CellCounter. I risultati ottenuti sono stati utilizzati per il calcolo delle diverse percentuali di rimozione medie rispetto ai valori di adesione precedentemente calcolati, per ogni coating. I risultati sono stati analizzati mediante un test ANOVA seguito da un test di Dunnett per il confronto dei diversi campioni con il controllo, rappresentato in questo caso dal PDMS.
3.6 Saggio di settlement con il polichete serpulide Ficopomatus
enigmaticus
Organismi adulti di F. enigmaticus sono stati prelevati, mediante raschiamento, dalla banchina principale del porto turistico di Viareggio (Lucca, Italia). Gli organismi sono stati raccolti in barattoli di plastica HDPE assieme ad un’ aliquota di acqua prelevata nello stesso punto di campionamento. Completata la procedura di raccolta dei policheti serpulidi, gli stessi sono stati trasferiti nel minor tempo possibile in laboratorio, dove sono stati risciacquati con acqua marina filtrata (0.45 µm) e posti in acquari (capacità 15 L) in circa 10 l di acqua marina filtrata (0.45 µm) ad una salinità di circa 30‰, con l’aggiunta di aliquote di sospensioni algali (Isochrysis galbanae Tetraselmis suecica) quali fonti di cibo. Dopo almeno 4 giorni di acclimatazione gli organismi adulti sono stati utilizzati per la raccolta di gameti.
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I gameti sono stati raccolti utilizzando il metodo distruttivo (Hadfield et al.1994; Nedved e Hadfield, 2009) che consiste nella rimozione delicata del tubo calcareo dei singoli organismi che sono stati poi posizionati singolarmente nei pozzetti di piastre sterili a 96 pozzetti. In seguito a tale procedura si ottiene in breve tempo (10-15 minuti) l’emissione dei gameti, che vengono poi identificati mediante stereomicroscopio.
Gli spermatozoidi di 4 maschi e le uova di circa 20 femmine sono stati raccolti e posti assieme in circa 150 ml di acqua marina filtrate (0.45 µm) per circa 1 ora in blanda agitazione orbitale.
Passato il tempo di fecondazione (circa 1 ora) l’intera sospensione è stata filtrata una prima volta con un setaccio a maglie di 300 µm, al fine di eliminare eventuali detriti calcarei dovuti alla rottura dei tubi, e successivamente con un setaccio a maglie di 30 µm, al fine di eliminare l’eccesso di spermatozoidi e le uova non fecondate. Le uova fecondate sono state risospese in circa 600 ml di acqua marina filtrata (0.45 µm) e poste al buio con leggera aerazione. Dopo 24 ore dalla fecondazione dalle uova schiudono trocofore planctoniche e planctotrofiche, pertanto alla coltura sono state aggiunte quotidianamente aliquote di sospensione algale (Isochrysis galbanae Tetraselmis suecica) quali fonti di cibo. Dopo circa 11-12 giorni dalla fecondazione le larve si trovano nella cosiddetta fase di “larva competente”, ossia capace di aderire ad una superficie e di compiere metamorfosi.
Una volta raggiunto lo stadio di larva competente l’intera sospensione è stata filtrata più volte con setacci a maglie di 30 µme 41µm, al fine di eliminare quante più alghe possibili, le quali possono rendere difficoltosa la raccolta degli organismi. Le larve competenti sono state in seguito risospese in poco volume (circa 10 ml) e poste a una temperatura di circa 4 °C per almeno 2 ore, al fine di rallentarne il movimento.
Precedentemente al giorno del test (almeno 24 ore prima) i vetrini con i diversi coatings da analizzare sono stati reidratati con acqua marina filtrata. Al momento del saggio i vetrini reidratati sono stati risciacquati con acqua deionizzata e posti in piastre Quadriperm®. Su ogni vetrino è stata posta una goccia di circa 1 ml di acqua marina filtrata. In ogni goccia sono state pipettate 20 larve competenti, le diverse piastre sono state poi mantenute per 48 ore al buio, ad una temperatura di 20 ± 2 °C, coperte con panni di carta umidi per evitare la disidratazione delle gocce.
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La percentuale di larve adese è stata calcolata a 24 e 48 ore dall’inizio del test. L’esperimento è stato eseguito in 3 repliche. Vetrini porta oggetto (76 x 26 mm) puliti con alcool ed asciugati sono stati utilizzati come controllo. Per l’analisi statistica è stato utilizzato un metodo non parametrico (Kruskal-Wallis) seguito dal test di Dunn per la comparazione tra campioni.
