SĄNARIO KREMZLĖS REGENERACIJOS TYRIMAI PANAUDOJANT ALOGENINIO KREMZLĖS IR KAULO KOMPLEKSO TRANSPLANTACIJĄ EKSPERIMENTINIAME MODELYJE

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

Tomas Mickevičius

SĄNARIO KREMZLĖS REGENERACIJOS

TYRIMAI PANAUDOJANT ALOGENINIO

KREMZLĖS IR KAULO KOMPLEKSO

TRANSPLANTACIJĄ

EKSPERIMENTINIAME MODELYJE

Disertacija rengta 2013‒2018 metais Lietuvos sveikatos mokslų universitete Medicinos akademijos Fiziologijos ir farmakologijos institute.

Mokslinis vadovas

doc. dr. Arvydas Ūsas (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, biome-dicinos mokslai, medicina – 06B).

Disertacija ginama Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos medicinos mokslo krypties taryboje:

Pirmininkė

prof. dr. Ingrida Balnytė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, bio-medicinos mokslai, medicina – 06B).

Nariai:

prof. dr. Alfredas Smailys (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, biomedicinos mokslai, medicina – 06B);

prof. dr. Šarūnas Tarasevičius (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, biomedicinos mokslai, medicina – 06B);

prof. dr. Valentinas Uvarovas (Vilniaus universitetas, biomedicinos mokslai, medicina – 06B);

dr. Volker Betz, (Ulmo universitetas (Vokietija), biomedicinos mokslai, medicina – 06B).

Disertacija ginama viešame medicinos mokslo krypties tarybos posėdyje 2018 m. rugpjūčio 30 d. 13 val. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninės Kauno klinikų Didžiojoje auditorijoje.

LITHUANIAN UNIVERSITY OF HEALTH SCIENCES MEDICAL ACADEMY

T

omas Mickevičius

REGENERATION OF ARTICULAR

CARTILAGE AFTER ALOGENEIC

OSTEOCHONDRAL TRANSPLANTATION

IN EXPERIMENTAL ANIMAL

MODEL

Dissertation has been prepared at the Department of Physiology and Pharmacology of Medicine Academy of Lithuanian University of Health Sciences during the period of 2013–2018.

Scientific Supervisor

Assoc. Prof. Dr. Arvydas Ūsas (Lithuanian University of Health Scien-ces, Biomedical ScienScien-ces, Medicine – 06B).

Dissertation is defended at the Medical Research Council of the Medical Academy of Lithuanian University of Health Sciences:

Chairperson

Prof. Dr. Ingrida Balnytė (Lithuanian University of Health Sciences, Biomedical Sciences, Medicine – 06B).

Members:

Prof. Dr. Alfredas Smailys (Lithuanian University of Health Sciences, Biomedical Sciences, Medicine – 06B);

Prof. Dr. Šarūnas Tarasevičius (Lithuanian University of Health Scien-ces, Biomedical ScienScien-ces, Medicine – 06B);

Prof. Dr. Valentinas Uvarovas (Vilnius University, Biomedical Sciences, Medicine – 06B);

Dr. Volker Betz, (University of Ulm (Germany), Biomedical Sciences, Medicine – 06B).

Dissertation will be defended at the open session of the Medical Research Council of Lithuanian University of Health Sciences on the 30th of August, 2018 at 1 p.m. at the Great Auditorium of the Hospital of Lithuanian University of Health Sciences Kauno klinikos.

TURINYS

SANTRUMPOS ... 7

ĮVADAS... 8

1. DARBO TIKSLAS ... 11

1.1. Tyrimo hipotezė ... 11

1.2. Tyrimo tikslai ir uždaviniai ... 11

2. DARBO NAUJUMAS ... 13

3. LITERATŪROS APŽVALGA ... 15

3.1. Bendra literatūros apžvalga ... 15

4. METODIKA ... 19

4.1. In vitro eksperimento etapas... 19

4.1.1. Naudota įranga ... 19

4.1.2. Naudotos terpės ... 20

4.1.3. Tyrimo eiga ... 20

4.1.4. Elektromechaninių savybių vertinimas ... 22

4.1.5. Chondrocitų gyvybingumo vertinimas ... 23

4.1.6. Histologinis mėginių vertinimas ... 23

4.1.7. Apoptozės vertinimas ... 24

4.2. In vivo eksperimento etapas ... 25

4.2.1. Naudota įranga ... 25

4.2.2. Naudotos terpės ... 26

4.2.3. In vivo etapo tyrimo eiga ... 26

4.2.4. Trombocitais praturtintos plazmos paruošimas ir naudojimas ... 27

4.2.5. Makroskopinis mėginių vertinimas ... 28

4.2.6. Elektromechaninių savybių vertinimas ... 29

4.2.7. Histologinis vertinimas ... 29

4.3. Statistinė duomenų analizė ... 31

5. REZULTATAI ... 32

5.1. In vitro tyrimo rezultatai... 32

5.1.1. Elektromechaninės KKK savybės ... 32

5.1.2. Chondrocitų gyvybingumas ... 34

5.1.3. GAG pasiskirstymas KKK ... 36

5.1.4. Histologinis KKK vertinimas ... 38

5.1.5. Apoptozė KKK ... 40

5.1.6. Koreliacijos tarp vertinimo kriterijų ... 42

5.1.7. In vitro tyrimo rezultatų bendras aptarimas ... 43

5.2. In vivo tyrimų rezultatai ... 44

5.2.1. Makroskopinis vertinimas ... 44

5.2.2. Transplantuotų KKK elektromechaninės savybės ... 47 5

5.2.3. Transplantuotų KKK histologinis vertinimas ... 50

5.2.4. Transplantuotų KKK glikozaminoglikanų raiška ... 53

5.2.5. Transplantuotų KKK vertinimo kriterijų koreliacijos ... 55

6. DISKUSIJA ... 57

6.1. In vitro rezultatų aptarimas ... 57

6.2. In vivo rezultatų aptarimas ... 61

7. IŠVADOS ... 65

8. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 66

BIBLIOGRAFIJOS SĄRAŠAS ... 67

PASKELBTŲ PUBLIKACIJŲ SĄRAŠAS DISERTACIJOS TEMA ... 78

SUMMARY ... 80

GYVENIMO APRAŠYMAS ... 124

PADĖKA ... 126

SANTRUMPOS

AA ‒ L-askorbininės rūgšties tirpalas (angl. ascorbic accid) dGEMRI

C

– kremzlės magnetinio rezonanso tyrimas, naudojant padidintą gadolinio koncentraciją

DMEM ‒ mažos koncentracijos gliukozės tirpalas (angl. Low glucose

Dulbecco's Modified Eagle’s Medium)

DMMB – 1,9-dimetilmetileno mėlis DMSO – dimetilsulfoksido tirpalas ECM ‒ ekstraląstelinis tinklas

FBS ‒ jaučio embriono serumas (angl. Fetal bovine serum) GAG ‒ glikozaminoglikanai

ICRS – tarptautinis kremzlės atsistatymo draugijos vertinimo balas (angl. International Cartilage Rrepair Society score) IGF-1 ‒ insulino augimo faktorius (angl. insulin growth factor-1) KKK ‒ kremzlės kaulo kompleksas

LG ‒ L-glutamino tirpalas

MRT – magnetinio rezonanso tyrimas

NMEM ‒ nepagrindinių amino rūgščių tirpalas (angl. Non-essential

amino acids)

OA ‒ osteoartritas

OAS ‒ Oswestry artroskopinė vertinimo skalė OAT ‒ autologinė transplantacija

OATS ‒ KKK pernešimo sistema (angl. Osteochondral allograft

transfer system)

OCA ‒ alogeninė transplantacija

PBS ‒ fosfatinis buferinis tirpalas (angl. Phosphate-buffered saline) PRP ‒ trombocitais praturtinta plazma

PSF ‒ penicilino streptomicino fungizono tirpalas QP ‒ kiekybinis parametras

RSI ‒ raudonos spalvos intensyvumas

ĮVADAS

Osteoartritas (toliau ‒ OA) labiausiai paplitusi degeneracinio pobūdžio liga, pažeidžianti sąnarius. Apžvalginėje 2013 m. apžvalginėje publikacijoje apibendrinti OA epidemiologiniai duomenys [65]. Jau 2005 m. buvo pa-skelbta, kad daugiau nei 26 milijonai žmonių Jungtinėse Amerikos Vals-tijose serga tam tikra OA forma. Nyderlandų gyventojų populiacijoje daugiau nei 20 procentų OA diagnozuojamas vyresniems nei 55 metų am-žiaus vyrams bei vyresnėms nei 60 metų amam-žiaus moterims. OA sergančių moterų, vyresnių nei 50 metų, skaičius yra ženkliai didesnis nei vyrų. Masa-čiusetso universiteto tyrimų duomenimis, 240 iš 100 000 asmenų per metus nustatoma kelio sąnario OA. Nyderlandų instituto duomenimis, OA papli-timas 1000 asmenų per metus siekia nuo 0,9 procentų tarp vyrų bei atitin-kamai iki 1,6 procentų moterims.

OA pasireiškia dėl įvairių priežasčių. Pirminio OA priežastys dažniausiai susijusios su organizmo amžiniais pokyčiais [65]. Antrinis OA dažniausiai pasireiškia iki 40 metų amžiaus. Jo pagrindinė priežastis yra trauma [80].

Dažniausiai įvairūs kremzlės pažeidimai yra nustatomi artroskopijų metu. Didelių kremzlės pažeidimų gydymas yra rimtas iššūkis ortopedui trauma-tologui [45, 72], kadangi gydymo taktikos parinkimas sąlygoja išeitis. Pa-vyzdžiui, atliekant artroskopines priekinio kryžminio raiščio rekonstrukcijos operacijas akivaizdūs kremzlės pakenkimai gali būti nematomi, o pope-raciniai rezultatai visgi susiję su OA atsiradimu [56].

Tarp daugybės klinikinėje praktikoje taikomų gydymo būdų, autologinių kaulo kremzlės kompleksų (toliau ‒ KKK) transplantacija yra vienintelė, kuri gali anatomiškai ir funkciškai atstatyti pažeistą sąnario kremzlę. Auto-loginė KKK transplantacija yra vienas iš plačiausiai taikomų ir sėkmin-giausių gydymo būdų. Šios operacijos turi tam tikrų apribojimų, t. y. sveikos kremzlės trūkumas sąnaryje bei po operacijos pasireiškiančia donorinės KKK vietos atrofija [47, 60].

Klinikinėje praktikoje taikoma autologinės KKK transplantacijos alterna-tyva – alogeninė KKK transplantacijos operacijos. Šio tipo operacijos yra atliekamos, kai nėra galimybės atlikti autologinę KKK transplantacijos ope-raciją. Audinių bankai alogeninius KKK laiko skirtingomis sąlygomis. Pa-vyzdžiui, Lietuvoje praktikuojama alogeninius KKK šaldyti iki ‒80 °C, ki-tuose bankuose atsižvelgiama į individualius audinių banko protokolus. Literatūroje gausu informacijos apie autologinės kremzlės transplantatų pri-gijimo ir gerus integracijos į aplinkinį audinį rezultatus. Alogeninės trans-plantacijos atokieji rezultatai skelbiami literatūroje skiriasi. Potransplan-taciniams atokiesiems rezultatams įtakos turi ir alogeninių KKK laikymo sąlygos ir trukmė, chondrocitų gyvybingumas, operacijos metu naudota

operacinė technika bei po operacijos skirtas gydymas. Potransplantacinius alogeninės ir autologinės KKK transplantacijos rezultatus galima palyginti tarpusavyje, kai yra žinoma defekto lokalizacija, traumos etiologija bei nustatyta kelio patologija [38, 107].

Alogeninių KKK laikymo sąlygos bei laikas turi tiesioginę įtaką KKK kokybei [17]. Audinių bankai ir ortopedai traumatologai taip pat susiduria su kita, ne ką mažesne, problema – kaip tinkamai ir objektyviai nustatyti pradinius kremzlės pažeidimus, kurie objektyviai nėra matomi, simptomų nesukelia bei operacijos metu sunkiai arba visai nepastebimi [51, 99]. Net ir po chirurginiu požiūriu sėkmingai atliktų autologinių KKK transplantacijos operacijų, kurių metu naudojamos kokybiškos būklės KKK, praėjus 5 me-tams 37 procentams pacientų reikėjo operacijas pakartoti. Iš jų 87 procentai transplantuotų KKK buvo gyvybingi praėjus 5 metams po transplantacijos. Visgi 18 procentų pacientų autologinės KKK transplantacijos operacijos buvo nesėkmingos [34].

Sąnario kremzlė yra unikalus audinys, kuris atlaiko nuolatinį pasikar-tojantį mechaninį stresą. OA yra degeneracinio pobūdžio liga, susijusi su progresuojančiu kremzlės sudedamųjų dalių, dažniausiai glikozaminogli-kanų (toliau ‒ GAG), netekimu. Chondrocitų metabolinio aktyvumo su-mažėjimas ar apoptozė sąlygoja bei daro įtaką kremzlės audinio susidė-vėjimui. Traumos ar didelių jėgų neteisingas pasiskirstymas sąnaryje lo-kaliai pažeidžia kremzlę, o tai vėliau sąlygoja vis didesnio pažeistos kremz-lės ploto atsiradimą, kremzkremz-lės pažeidimą, o vėliau ir sąnario deformaciją.

Kremzlę sudaro ne tik kremzlės ląstelės chondrocitai, tačiau ir chond-rocitų formuojamas 3D tinklas, vadinamas ekstraląsteliniu matriksu (toliau – ECM). ECM apykaitoje dalyvauja tiek chondrocitai, tiek biologiškai ak-tyvios medžiagos. Sugebėjimas pasipriešinti gniuždymo jėgai, slydimas bei elastingumas ‒ pagrindinės kremzlės savybės, kurios yra užtikrinamos ECM apykaitoje vykstančiais procesais.

Neigiamą krūvį turinčios GAG molekulės pritraukia natrio jonus. Šie kremzlės audinyje sulaiko vandenį. Atsiradus kremzlės pažeidimams natrio jonai atsipalaiduoja nuo GAG ir tokiu būdu gali laisviau judėti ECM. Tei-giamo ir neiTei-giamo krūvio skirtumas lemia elektrinio potencialo atsiradimą.

Makroskopinės vertinimo skalės negali tiksliai parodyti tik prasidedantį kremzlės pažeidimą, histologiniai tyrimai reikalauja ilgo laiko ir yra inva-zyvūs. Tobulėjant technologijoms atsirado naujų galimybių objektyviai įver-tinti kremzlės būklę norimu metu. Viena iš tokių galimybių yra užregistruoti elektromechanines kremzlės savybes (toliau ‒ QP), kurios sąlygoja translia-cijos potencialą (angl. streaming potential), gali būti registruojamos nau-jausiu aparatu Arthro-BST™ (Biomomentum Inc., Lavalas, Kvebekas, Kanada). Šis tyrimo būdas leidžia objektyviai ir nedestruktyviai įvertinti

sąnario kremzlės elektromechanines savybes bei nustatyti pažeidimą [99]. Operacijos metu svarbiausia greitai ir kokybiškai nustatyti beprasidedantį kremzlės pažeidimą, įvertinti jo plotą ar net pakartotinių operacijų metu stebėti kremzlės pažeidimo ar regeneracijos dinamiką. Šis tyrimo būdas gali būti taikomas taip pat ir audinių bankuose, siekiant įvertinti alogeninės KKK kokybę prieš transplantacijos operaciją.

Dėl šios priežasties šiame moksliniame tyrime panaudotas naujausias Kanados mokslininkų grupės sukurtas aparatas siekiant įvertinti alogeninio KKK būklę išlaikius kremzlės kaulo kompleksus atitinkamomis sąlygomis bei po alogeninio KKK transplantacijos rezultatus, praėjus 3 ir 6 mėnesiams nuo transplantacijos operacijos.

1.

DARBO TIKSLAS

1.1. Tyrimo hipotezė

Mokslinėje literatūroje aprašytos kremzlės kaulo kompleksų laikymo sąlygos bei trukmė labai skiriasi. Transplantacijoms skirti alogeniniai kremzlės kaulo kompleksai laikomi skirtingų temperatūrų sąlygomis: nuo ‒80 °C iki 4 °C ir 37 °C, skirtingos sudėties terpėse, skirtingą laiką (nuo 14 iki 56 dienų) [4, 17, 85]. Autoriai sutaria, kad kremzlės gyvybingumas yra svarbiausias rodiklis siekiant gerų potransplantacinių rezultatų. Moksli-ninkai nuolat ieško geresnių alogeninio kremzlės kaulo kompleksų išsau-gojimo būdų ir priemonių gyvybingumui užtikrinti.

Šio tyrimo hipotezė ‒ laikymo terpės sudėtis, temperatūra ir laikymo trukmė keičia alogeninio kremzlės kaulo komplekso savybes, kurios įtakoja atokiuosius alogeninės KKK transplantacijos rezultatus.

1.2. Tyrimo tikslai ir uždaviniai

Šio tyrimo tikslas yra nustatyti optimalias alogeninio kremzlės kaulo komplekso laikymo sąlygas, kurioms esant kremzlės kaulo komplekso elect-romechaninės ir histologinės savybės, chondrocitų gyvybingumas, proteo-glikanų raiška ir apoptotinių ląstelių kiekis būtų artimos autologiniam KKK ir užtikrintų geriausius alogeninės transplantacijos rezultatus..

Uždaviniai:

1. Išmatuoti ir palyginti kremzlės kaulo kompleksų eksplantų, laikytų skirtingomis sąlygomis (‒70 °C, 4 °C ir 37 °C), skirtingos sudėties mai-tinamosiose (DMEM ir DMEM su IGF-1) terpėse skirtingą laiką (14 ir 28 dienas), elektromechanines savybes;

2. Nustatyti gyvybingų chondrocitų kiekį, morfologinius pokyčius, chond-rocitų apoptozę, proteoglikanų raišką kremzlės kaulo kompleksų eks-plantuose, laikytuose skirtingų temperatūrų (–70 °C, 4 °C ir 37 °C) sąlygomis, skirtingos sudėties maitinamosiose (DMEM ir DMEM su IGF-1) terpėse, skirtingą laiką (14 ir 28 dienas) bei palyginti gautus re-zultatus tarp grupių;

3. Įvertinti ir palyginti alogeninio ir autologinio kremzlės kaulo komplekso transplantacijos rezultatus (elektromechanines savybes, makroskopinius bei histologinius pokyčius, proteoglikanų raišką) po 3 ir 6 mėnesių, panaudojus gyvybiškiausią optimaliomis sąlygomis laikytą alogeninį

kremzlės kaulo komplekso transplantatą, bei nustatyti koreliacijas tarp skirtingų KKK savybių vertinimo parametrų.

4. Išanalizuoti ir palyginti trombocitais praturtintos plazmos poveikį alo-geninės ir autologinės KKK transplantacijos rezultatams.

2.

DARBO NAUJUMAS

Sąnario kremzlė yra unikalus audinys, kuris atlaiko nuolatinį pasikar-tojantį mechaninį stresą. Osteoartritas (OA) yra degeneracinio pobūdžio liga susijusi su progresuojančiu kremzlės sudedamųjų dalių, daugiausia proteo-glikanų, netekimu. Chondrocitų metabolinio aktyvumo sumažėjimas ar apoptozė sąlygoja kremzlės audinio susidėvėjimą. Traumos ar didelių jėgų neteisingas pasiskirstymas sąnaryje lokaliai pažeidžia kremzlę, o tai vėliau lemia vis didesnio pažeisto kremzlės ploto atsiradimą ir sąnario deformaciją. Duomenų bazėse yra gausu informacijos apie laboratorinėmis sąlygomis laikomus chondrocitus, kremzles ar 3D konstruktus. Tyrimuose ypač pabrė-žiama aplinkos temperatūros bei terpių sudedamųjų dalių kompozicijos svarba. Audinių bankai taip pat taiko moksliniais tyrimais įrodytas laikymo sąlygas: nuo ‒80 °C iki 4 °C ir 37 °C, skirtingos sudėties terpėse, skirtingą laiką (nuo 14 iki 56 dienų) [4, 17, 85]. Tačiau pasigendama objektyvios potransplantacinių rezultatų analizės, kokį poveikį laikymo sąlygos daro transplantuotos KKK kokybei. Šiame moksliniame tyrime taikytos skirtin-gos KKK laikymo sąlygos, nuo ‒80 °C iki 4 °C ir 37 °C, skirtingos sudėties terpėse, panaudojant IGF-1 arba be jo, skirtingą laiką – 14 ir 28 dienas. Po operacijos bei praėjus vienam ir dviem mėnesiams po transplantacijos, į kairės užpakalinės kojos kelio sąnarį buvo leista autologinė PRP, siekiant stimuliuoti KKK integracijos procesą.

Kremzlę sudaro ne tik kremzlės ląstelės chondrocitai, tačiau ir chondro-citų formuojamas 3D tinklas, ekstraląstelinis matriksas ‒ ECM. ECM apykaitoje dalyvauja tiek chondrocitai, tiek biologiškai aktyvios medžiagos. Sugebėjimas pasipriešinti gniuždymo jėgai, slydimas bei elastingumas ‒ pagrindinės kremzlės savybės, kurios yra užtikrinamos ECM apykaitoje vykstančiais procesais. Šiuolaikinės diagnostinės technologijos leidžia tiek tiesiogiai, tiek netiesiogiai įvertinti ECM būklę. Naujausiais gydymo meto-dais siekiama kremzlės audinį regeneruoti ląsteliniame lygmenyje, taip pat pasitelkus genų inžineriją ar slopinant kremzlėje vykstančius procesus užtikrinti kuo ilgesnį audinio gyvybingumą.

ECM būklę galima įvertinti invaziniais ir neinvaziniais nedestrukciniais būdais. Viskas priklauso nuo tikslo, ką norima ištyrinėti. Nesant galimybių tyrimus atlikti laboratorinėmis sąlygomis galima stebėti šeimas, turinčias jungiamojo audinio patologiją (genetinis sutrikimas) [87] arba operacijų metu naudoti makroskopinio vertinimo skales (pvz., Oswestry arba vąšelio mėginį artroskopijos metu) [15].

Tiksliausias ir pats efektyviausias būdas nustatyti konkretų kremzlės pa-žeidimą ar pažeidimo mechanizmą yra įvairių histologinių ir imunohisto-cheminių tyrimų atlikimas. Tyrimuose labai svarbi dalis tenka pačių chond-rocitų gyvybingumui ir apoptozei ar apoptozės mechanizmui nustatyti,

kadangi šios ląstelės ir gamina ECM struktūras. Negalima pamiršti ir imu-nofluorescensinių metodų, taikomų genų ekspresijos tyrimuose.

Siekiant įvertinti paties ECM struktūrą, būtina kremzlėje pasitelkti ir kolageno raišką, kuri gali išryškinti pagrindinius audinio struktūros trūku-mus. Proteoglikanų raiška įvertinama histologinio tyrimo metu (pvz., o-sa-franino, mėlynojo toluidino dažymas) bei vertinant įvairiomis histologinio vertinimo skalėmis (pvz., O‘Driscoll). Proteoglikanų netiesioginio kiekio tyrimams galima pasitelkti ir kompiuterines programas, kai matuojamas raudonos spalvos intensyvumas, kuris atvaizduoja proteoglikanų raišką [68] arba naudojant spektroskopinius metodus (pvz., DMMB).

Praktikiniame darbe nustatant kremzlės pažeidimą kartais reikalingas daug greitesnis ir ne toks invazyvus kremzlės būklės vertinimas, apimantis ne tik chondrocitų gyvybingumą, tačiau ir ekstraląstelinio matrikso būklę. Elektromechaninių savybių įvertinimas čia ir dabar būtų privalumas, nau-dojant jį operacijų metu. Tokiu tikslu Kanados mokslininkų grupė sukūrė specialų prietaisą Arthro-BST™, skirtą kremzlės elektromechaninės būklės įvertinimui. Kompresijos metu iš kremzlės intersticinis skystis stumia laisvus teigiamus jonus prie neigiamai įkrautų proteoglikanų, kurie yra ko-lageno tinkle. Tai ir formuoja tėkmės potencialą (angl. streaming potential), kurį ir išmatuoja prietaisas. Kuo aukštesnis QP, tuo labiau yra pažeistas kremzlės ekstraląstelinis matriksas, tuo labiau išreikšta artrozė [98]. Prie-taisas apskaičiuoja kiekybinį elektrinio potencialo parametrą (QP), kai prietaiso matavimo daviklyje esantys mikroelektrodai liečiasi su kremzlės paviršiumi ir transliacijos potencialo suma pasiekia 100 mV.

Be to, kremzlės ekstraląstelinio matrikso būklės blogėjimas yra tiesiogiai susijęs su chondrocitų gyvybingumu ir jų atliekama regeneracine funkcija. Dėl to QP iš dalies parodo ir chondrocitų būklę, jų galimybę regeneruoti su-žalotą audinį.

Be tradicinių metodų, naudojamų KKK kokybei nustatyti, šiame moks-liniame tyrime buvo panaudotas naujas, klinikinėje praktikoje dar nenau-dotas, kremzlės elektromechaninių savybių registracijos aparatas. Šio prie-taiso pagalba nedestrukciniu būdu buvo įvertinta skirtingomis sąlygomis ir skirtingą laiką laikytų alogeninių KKK kokybė ne tik prieš transplantaciją, tačiau ir po jos [83].

In vitro tyrimo etape taip pat įvertintas gyvybingų chondrocitų kiekis,

apoptozė, mėginių histologiniai vaizdai, proteoglikanų raiška. In vivo etapo metu vertinti makroskopiniai transplantuotų KKK vaizdai, tirtos elektro-mechaninės savybės, vertinti histologiniai pjūviai, įvertinta proteoglikanų raiška. Tyrimų gausa leido objektyviai įvertinti kremzlės būklę iki trans-plantacijos ir po jos, taip pat nustatyti ryšį tarp skirtingų KKK savybių vertinimo parametrų.

3.

LITERATŪROS APŽVALGA

3.1. Bendra literatūros apžvalga

Sąnario kremzlė dengia kaulų sąnarinius paviršius, neturi kraujagyslių ir nervų šaknelių tinklo. Pagrindinė sąnario kremzlės funkcija ‒ amortizuoti sąnariuose mechaninį krūvį. Kietas ir elastines kremzlės savybes užtiktina ląstelės chondrocitai. Jie gamina ECM, kuris sudarytas iš vandens, agrekanų ir daugiausia II tipo kolageno. Neigiamą krūvį turinčios GAG molekulės pritraukia natrio jonus. Šie kremzlės audinyje sulaiko vandenį. Dėl savitos sąnario struktūros, kremzlė yra priskiriama prie mažai imunogeniškų audinių grupės. Taip yra dėl to, kad kremzlėje nėra kraujagyslių tinklo. Dėl žemo imunogeniškumo sąnario kremzlė yra patraukli alogeninei transplant-tacijai [31,74,91].

Autologinės KKK transplantacijos efektyvumas yra įrodytas [4, 8, 43, 46, 70, 78, 111]. Didesnė problema susijusi su alogenine transplantacija, kur audinių bankai KKK saugo įvairiausiomis sąlygomis: nuo šaldymo iki –80 °C temperatūros iki laikymo įvairiose maitinamosiose terpėse skirtingų temperatūrų sąlygomis (4 °C ir 37 °C). Negana to, audinių bankai privalo tokio tipo transplantatus ištirti dėl įvairių infekcinių susirgimų, patikrinti jų sterilumą, dėl to mėginius laiko karantino sąlygomis pagal reglamentuotus protokolus [4, 85]. Kremzlės saugojimo trukmė bei aplinka sąlygoja kremz-lės ląstelių ‒ chondrocitų gyvybingumą [31]. Chondrocitų gyvybingumas yra pats svarbiausias, norint kad implantuota kremzlė prigytų, o ir jos gy-vavimo laikas būtų galimai ilgesnis. Chondrocitų gyvybingumo išsaugoji-mas yra nuolatinis tyrimų objektas [4, 66]. Tyrimai, kurių metu kremzlė buvo užšaldoma arba šaldoma kriogeniniu būdu, parodė, kad gyvų ląstelių kiekis kremzlėje ženkliai sumažėja [1, 18, 75], o jos laikymas hipotermijos sąlygomis 4 °C temperatūroje gali išsaugoti chondrocitų gyvybingumą ir matrikso integraciją [84, 101, 110]. Yra tyrimų, kuriose kremzlė laikyta ir 37 °C temperatūroje. Šių tyrimų rezultatai atskleidė, kad gyvybingų ląstelių kiekis buvo didesnis laikant kremzlę 37 °C temperatūroje, nei šaldant [37, 75].

Chondrocitų gyvybingumas priklauso ir nuo terpės sudėties. Geri rezulta-tai stebėti tada, kai kremzlė buvo laikoma terpėje be serumo [8, 26, 37], terpėje su jaučio serumu [75, 79], deksametazonu [13], etanerceptu [64] ar trombocitais praturtinta plazma [81, 95, 114]. Kremzlės chondrocitų gyvy-bingumui turi įtakos ir hormoniniai priedai, pvz. insulino augimo faktorius (IGF-1). Jis naudojamas ir gydant kremzlės pažeidimą. Šis faktorius veikia chondrocitų proliferaciją, dėl ko stimuliuojama kremzlės matrikso gamyba [95, 103]. Literatūroje pavyko rasti tik kelias studijas, kur į maitinamąją

terpę buvo įdėtas 5 ng/ml IGF-1 [90], 5 ng/ml IL-1α [63] arba FGF-2 [41, 80]. IGF-1 taip pat veikia kaip kremzlę atstatantis preparatas. Tokio fak-toriaus naudojimas studijose yra žinomas, tačiau jo dozuotė ir poveikis chondrocitų metabolizmui nėra iki galo išaiškintas.

Atlikta nemažai tyrimų ir su ląstelių apoptoze arba programine chond-rocitų žūtimi. Šių ląstelių žūtis kremzlėje yra susijusi su matrikso degene-racija ir OA pradžia [105, 106]. Buvo išanalizuotas tiesioginis ryšys tarp ląs-telių apoptozės ir chondrocitų gyvybingumo, mėginius laikant hipotermijos sąlygomis [59]. Tyrimai parodė, kad apoptozę slopinant per signalinius apoptozės kelius, būtų užtikrintas chondrocitų gyvybingumas ir dėl to gerėtų atokieji transplantacijos rezultatai. Robertson’as ir bendraautoriai analizavo apoptotinių genų ekspresiją ir nustatė, kad tokių genų daugėja kremzlę lai-kant ilgesnį laiką (iki 35 dienų) [88].

Nuo 2011 metų yra pasiūlytas naujas elektromechaninių kremzlės savy-bių tyrimo būdas, kuris parodo ir kremzlės kokybę. Kanados mokslininkų grupė sukūrė artroskopinį nedestrukcinį prietaisą Arthro-BST™. Šio aparato veikimo principas yra susijęs su jonų judėjimo metu generuojamų poten-cialų registracija ir pavertimu skaitmenine išraiška. Labai tikėtina, kad tai gali būti ateityje naudojama technologija nustatant KKK kokybę prieš transplantaciją audinių bankuose ir operacijos metu.

Iki šiol yra atlikti tyrimai tik in vitro su jaučio [22, 63, 90], arklio [20], šaldytais kadaverinių donorų žmogaus [2, 51, 98, 99] sąnario kremzlės mė-giniais. Naujausiame 2016 metais Schagemann′o ir bendraautorių atliktame tyrime naudotas kremzlės biodegraduojantis konstruktas, kurio metu dvi-sluoksnė chondrocitais pripildyta membrana buvo sodinama avims į kelio sąnarius [94].

Legare [63] ir Changoor [22] mėginius laikė ‒20 °C temperatūroje. Sim [98] mėginius saugojo ‒70 °C skirtingą laiką. Changoor [21,22] mėginius saugojo 4 °C maitinamojoje terpėje, Legare [63] KKK laikė 37 °C tempe-ratūroje.

Elektromechaninės kremzlės savybės buvo vertinamos skirtingais laiko intervalais: po 0 dienų [2, 63], 1 dienos [22, 63] , 4 dienų [63], 5 dienų [21], 6 dienų [22], 7 dienų [22, 63], 11 dienų [63], 12 dienų [22], 14 dienų [63]. Schagemann studijoje vertintos kremzlės elektromechaninės savybės po 19 mėnesių nuo konstrukto su chondrocitais implantacijos avims [94].

Legare [63] nustatė, kad ‒20 °C 2 savaites šaldytuose mėginiuose sukel-tasis elektrinis potencialas labiau priklausė nuo paspaudimo ir amplitudės. Tai rodo netiesinę sukelto elektrinio potencialo priklausomybę nuo ampli-tudės. Be to, buvo nustatyta, kad IL-1α sumažino sukelto elektrinio po-tencialo amplitudę ir gradientą lyginant šviežios kremzlės rezultatus ir praė-jus 11 dienų.

Changoor [22] nustatė pablogėjusias kremzlės elektromechanines savy-bes iki ‒20 °C užšaldytuose mėginiuose tarp pirmos ir 12 laikymo dienos. Praėjus 6 dienoms nuo užšaldymo kremzlės elektromechaninės savybės buvo nepakitusios. Autorė taip pat nustatė, kad palaipsnis audinio nykimas (degradacija) atsirado tarp 6 ir 12 užšaldymo dienos. Vėlesni tyrimai pa-rodė, kad QP įtaką daro struktūriniai kremzlės pokyčiai [20].

S. Sim [98] mėginius užšaldė iki ‒80 °C, vėliau juos atšildė iki 4 °C bei nustatė, kad aukštesnės QP reikšmės koreliavo su hidraulinio spaudimo sąlygotu pralaidumu. Tai patvirtino ir Abedian’as [2], kuris nustatė silpną koreliaciją tarp hidraulinio spaudimo ir QP potencialo.

Tų pačių tyrimu metu buvo stebėta proteoglikanų sumažėjimas mėgi-niuose, dažytuose safranino O dažais [22]. Naudojant indišką rašalą (angl.

Indian ink) buvo nustatyti platūs paviršiaus įplyšimai ir maži plyšiai,

besidriekiantys už paviršinės kremzlės zonos. Safranino O dažymo raiška buvo silpnesnė mėginius išlaikius 4 ° C temperatūroje 12 dienų [22]. Sim [98] nustatė elektromechaninių kremzlės savybių koreliaciją su histologiniu kremzlės įvertinimu. Abedian [2] patvirtino, kad Mankin’o skalės vertinimo balai ir ICRS vertinimo skalės rezultatai taip pat koreliuoja su elektrome-chaninėmis kremzlės savybėmis.

Proteoglikanų raiškai kremzlėje taip pat įtakos turi ne tik laikymo sąlygos [90], bet ir įvairūs uždegimą skatinantys faktoriai (IL-1α, IL-1ß, chondroi-tinazė ABC ir kiti) bei veiksniai [63]. Sim su bendraautoriais nustatė, kad elektromechaninės savybės koreliuoja su kremzlėje nustatytu proteoglikanų kiekiu [98], o Legare su bendraautoriais – kad kolageno tinklas yra jautrus saugojimo trukmei [63]. Mokslininkai nustatė, kad elektromechaninės kremzlės savybės koreliuoja tiek su histologinio vertinimo rezultatais, tiek su biomechaniniais parametrais [98].

Kremzlės ir kaulo autologinė transplantacija yra gerai žinoma ir nau-dojama gydant kremzlės pažeidimus. Deja, donorinės vietos atrofija arba sveikos donorinės kremzlės stoka riboja tokio gydymo metodo taikymą. Tokių situacijų alternatyva ‒ alogeninė KKK transplantacija priklausomai nuo traumos, etiologijos ar nustatytos patologijos. Alogeninės transplant-tacijos rezultatai yra tyrinėjami, tačiau tuo pačiu ir labai skiriasi [77, 96].

Atokiesiems rezultatams įtakos turi alograftų laikymo sąlygos, kuomet užšaldymas lemia chondrocitų mirtį [82]. Glen ir bendraautoriai [38] parodė, kad šviežias kremzlės ir kaulo kompleksas išlaiko savo histologines savybes tiek in vivo, tiek in vitro. Alogeninės kremzlės gyvybingumo išsaugojimas užtikrina KKK transplantato integraciją į aplinkinius audinius, o tai yra labai svarbu atokiesiems potransplantaciniams rezultatams. Kelios studijos parodė, kad transplantuoto KKK kaulas integruoja į aplinkinį kaulą geriau nei kremzlė, o kremzlė gali ir nesuaugti [30]. Kitų studijų rezultatai rodo,

kad kremzlės integracijai labai svarbus yra subchondrinio kaulo stabilumas po transplantacijos [16, 86].

KKK transplantato integraciją į sveiką audinį taip pat gali paskatinti po operacijos į kelio sąnarį leidžiama autologinė trombocitais praturtinta plazma [108]. Ikiklinikiniuose tyrimuose toks gydymo būdas atskleidė gerus rezultatus, tačiau klinikinių tyrimų rezultatai nebuvo vienareikšmiai [108]. Carneiro su bendraautoriais nustatė, kad injekuojant PRP į sąnarį su pažeista kremzle, fibrozinė kremzlė pasižymi geresnėmis histologinėmis savybėmis [19]. Görmeli su bendraautoriais atliko hialurono rūgšties ir PRP leidimo į sąnarį palyginamąjį tyrimą. Tyrimas parodė, kad PRP leidimas į sąnarį pradinėse OA stadijose teigiamai veikė sąnario regeneraciją, tuo tarpu vė-lesnėse OA stadijose leisti abu preparatai gijimui įtakos neturėjo [42]. Altan ir bendraautoriai parodė, kad PRP leidimas į kelio sąnarį po OAT operacijos sąlygoja greitesnį gijimą ir geresnes histologines kremzlės savybes [5]. Apžvelgus literatūrą lieka neatsakyta į klausimą, ar PRP leidimas į sąnarį po OCA operacijos kremzlės regeneraciją veikia taip pat, kaip ir gydant OA ar po OAT operacijos.

Pooperaciniu periodu įvertinti kremzlės būklę galima tik atlikus radiolo-ginius tyrimus (pvz., magnetinio rezonanso) arba atliekant pakartotinę diagnostinę artroskopiją. Tikslesnis kremzlės pažeidimo įvertinimas būtų privalumas ypač ilgalaikiam pacientų stebėjimui. Idealiu vertinimo būdu būtų histologinis kremzlės tyrimas, tačiau jis yra invazyvus ir kremzlę žalojantis. Makroskopinio vertinimo skalės neužtikrina tinkamo kremzlės pažeidimo ploto ir gylio įvertinimo.

Analizuojant literatūroje skelbiamus tyrimų rezultatus, pastebėta, kad išplėstinio alogeninio KKK tyrimo, kuris apimtų jo laikymo sąlygas ir sąlygų įtaką potransplantaciniame periode, nėra. Alogeninio KKK ir alo-geninės transplantacijos rezultatai išlaikius mėginius atitinkamomis sąlygo-mis literatūroje dažniausiai analizuojami tik atskirais aspektais.

Moksliniame tyrime atsižvelgta į literatūroje pateikiamas nagrinėtas KKK laikymo sąlygas, gautas išvadas, bei potransplantaciniame periode nustatytus rezultatus.

4.

METODIKA

Mokslinio tyrimo metu vykdyti eksperimentai atlikti vadovaujantis Valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos leidimo atlikti bandymus su gyvūnais procedūrų projektu, išduotu 2014 m. kovo 5 d. Nr. 8, griežtai vykdant leidime nustatytus reikalavimus.

Pagal keliamus reikalavimus buvo užtikrinta visapusiška ir nepriekaiš-tinga eksperimentinių gyvūnų priežiūra bei gerovė iki eksperimento, jo vyk-dymo metu ir po eksperimento, taikytas tinkamas gyvūnų nuskausminimas.

Tyrimas buvo atliktas dviem etapais. Pirmasis eksperimentinio tyrimo etapas vykdytas laboratorinėmis sąlygomis in vitro. Šio etapo eiga aprašyta skyriuje „4.1. In vitro eksperimento etapas“. Antrasis tyrimo etapas atliktas

in vivo, atsižvelgiant į pirmojo etapo metu gautus rezultatus. Šis etapas

aprašytas skyriuje „4.2. In vivo eksperimento etapas“.

Pagal kiekvieno etapo aprašytas metodikas gauti eksperimentų duomenys ir rezultatai buvo registruojami, sisteminami, analizuojami ir aptariami, da-romos išvados. Atliktų eksperimentų rezultatai aptarti skyriuje „5. Rezul-tatai“ ir pateiktos išvados skyriuje „7. Išvados“.

4.1. In vitro eksperimento etapas 4.1.1. Naudota įranga

Kremzlės kaulo kompleksai paimti steriliomis sąlygomis naudojant standartinius instrumentus (angl. osteochondral allograft transfer system (toliau ‒ OATS), Arthrex Inc, JAV). Viena mėginių grupė laikyta IL Shin šaldiklyje (ilShin Biobase Europe), šaldant juos iki –70 °C temperatūros, antra inkubatoriuje 37 °C su 5 proc. CO2, trečia šaldytuve 4 °C,

atmos-feriniame ore. Elektromechaninėms kremzlės savybėms tirti buvo naudotas prietaisas Arthro-BST™ (Biomomentum Inc., Lavalas, Kanada).

Histologiniam gyvų chondrocitų nustatymui naudotas konfokalinis mik-roskopas LSM 700 Axio Observer Z.1 (Carl Zeiss, Vokietija). Histolo-giniams vaizdams vertinti naudotas šviesinis mikroskopas Olympus BX63 („Olympus“, Japonija) su įmontuotu Olympus DP72 CCD fotoaparatu ir panaudojant „CellSens Dimension“ vizualizavimo programą („Olympus“, Japonija). Šiuo mikroskopu nufotografuotose nuotraukose vertinta mėginių histologinė struktūra naudojant Mankin’o skalę, chondrocitų apoptozė ir raudonos spalvos intensyvumas (proteoglikanų raiška).

Skaičiavimo programa „Image J“, versija 1.47q (Nacionalinis sveikatos institutas, JAV) naudota gyvų ir mirusių bei apoptotinių ląstelių kiekiui skaičiuoti ir GAG įvertinti.

4.1.2. Naudotos terpės

Šviežiai paimti KKK mėginiai buvo transportuoti į laboratoriją fosfati-niame buferifosfati-niame tirpale (PBS, Sigma) su 100 U/mL penicilino, 100 μg/ml streptomicino ir 0,25 μg/mL fungizono (PSF, Sigma) priedais. Laboratori-joje mėginiai buvo laikomi 4 °C ir 37 °C temperatūros mažos koncentracijos gliukozės kiekio (DMEM, Sigma) tirpale, kuriame buvo pridėta 10 proc. jaučio embriono serumo (FBS, Sigma), 1 proc. PSF, 2 mM L-glutamino tirpalo (LG, Sigma), 25 μg/mL L-askorbininės rūgšties (AA, Sigma) ir 0,1 mM nepagrindinių amino rūgščių (NMEM, Sigma) su 100 ng/mL insu-lino augimo faktoriumi (angl. insulin growth factor, IGF-1, Sigma) arba be jo.

4.1.3. Tyrimo eiga

Eksperimento schema pavaizduota 4.1.3.1 paveiksle.

4.1.3.1 pav. In vitro eksperimento schema

IGF-1 – insulino augimo faktorius (angl. insulin growth factor-1); QP – kiekybinis potencialas; GAG – glikozaminoglikanai.

Iš 5‒6 mėnesių amžiaus Saanen’o veislės vyriškos lyties 6 ožiukų abiejų užpakalinių kojų kelio sąnarių vidinių šlaunikaulių krumplių steriliomis sąlygomis buvo paimti 5 mm diametro KKK, naudojant OATS.

Visi paimti KKK buvo suskirstyti į dvi grupes pagal laikymo trukmę. Pirmoje grupėje KKK mėginiai buvo laikomi 14 dienų, o antrojoje ‒ 28 dienas. Kiekviena KKK grupė papildomai buvo suskirstyta į tris atskirus pogrupius, kuriuose mėginiai laikyti atitinkamai ‒70 °C, 4 °C ir 37 °C temperatūrose.

Straipsniuose [95, 103] analizuojama augimo faktorių įtaka kremzlės lai-kymui bei vertinimo rezultatams. Dėl teigiamo efekto chondrocitų išgyvena-mumui buvo pasirinkta papildomai suformuoti tiriamas KKK grupes, į kurių terpę buvo įdėta 100 ng/ml IGF-1. Mėginių kiekis, laikymo sąlygos bei truk-mė parodyti 4.1.3.1 lentelėje.

4.1.3.1 lentelė. Mėginių kiekis, laikymo sąlygos bei trukmė grupėse

DMEM be IGF-1 DMEM su IGF-1

Laikymo sąlygos / dienos 14 d. 28 d. 14 d. 28 d.

–70 °C n = 6 n = 6 n = 6 n = 6

4 °C n = 6 n = 6 n = 6 n = 6

37 °C n = 6 n = 6 n = 6 n = 6

DMEM – mažos koncentracijos gliukozės tirpalas; IGF-1 – insulino augimo faktorius.

Šviežiai paimti KKK mėginiai buvo laikyti PBS su 100 U/mL penicilino, 100 μg/mL streptomicino ir 0,25 μg/mL fungizono (PSF) (Sigma) priedais. Laboratorijoje šie mėginiai suskirstyti po 6 KKK į keturias grupes:

1) kontrolinė ‒ ką tik paimta, 2) šaldyta − –70 °C (–70 °C),

3) atšaldyta iki 4 °C su 100 proc. atmosferos oru (4°C),

4) laikyta inkubatoriuje 37 °C su santykiniu 95 proc. oro drėgnumu bei 5 proc. CO2) (37 °C).

4° C ir 37 °C grupių mėginiai buvo įdėti į 24 šulinėlių plokšteles, kurių šulinėliai užpildyti DMEM su 10 proc. FBS, 1 proc. PSF, 2 mM LG, 25 AA ir 0,1 mM NMEM su ar be 100 ng/mL IGF-1.

Praėjus 14 ir 28 dienų nuo patalpinimo į atitinkamas sąlygas bei terpes, kiekvienos grupės KKK buvo įvertinti pagal nustatytą tvarką. Pirmiausiai buvo atliktas šių KKK elektromechaninių savybių vertinimas. Po elektro-mechaninių savybių vertinimo KKK perpjauti pusiau skalpeliu. Viena pusė panaudota chondrocitų gyvybingumo nustatymo tyrimams, dažant juos LIVE/DEAD® dažais (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Kita pusė buvo naudojama įvertinti chondrocitų apoptozei, GAG pasiskirstymui ir mėginiams Mankin′o histologinio vertinimo skale įvertinti.

Šviežiai surinktų mėginių (kontrolinė) grupė buvo analizuota ir įvertinta tą pačią mėginių paėmimo dieną pagal aukščiau minėtą metodiką.

4.1.4. Elektromechaninių savybių vertinimas

Elektromechaninės kremzlės savybės kiekvienoje KKK mėginių grupėje buvo įvertintos Arthro-BST™ (Biomomentum Inc., Laval, QC, Kanada) prietaiso pagalba kaip pavaizduota 4.1.4.1 paveiksle.

A B

4.1.4.1 pav. KKK elektromechaninių savybių vertinimas

A – naudojamos įrangos vaizdas; B – vertinimo proceso momentas.

Arthro-BST™ sąlyginai naujas – medicininis įtaisas, kuris nedestrukciniu

kontaktiniu būdu matuoja elektromechanines sąnario kremzlės savybes. Šio prietaiso veikimo principas toks: pusiau sferinis daviklis savo galvutėje turi 37 auksinius mikroelektrodus (5 mikroelektrodai/mm2

), kurie registruoja elektrinį kremzlės potencialą, atsirandantį švelniai paspaudus daviklį į kremzlės paviršių. Spaudimo metu teigiami kremzlės intersticinio audinio jonai atsipalaiduoja nuo neigiamai įkrautų proteoglikanų grandinių, taip sukurdami elektros srovę, kuri registruojama kaip kiekybinis parametras QP (angl. quantitative parameter). Jei kremzlė yra sveika, tokiu atveju sveikas kolageno tinklas neleidžia teigiamiems jonams judėti kremzlės tarpląsteli-niame matrikse, dėl to sukuriama silpna srovė. Elektros srovė skaičiuojama tik tokiu atveju, kai ji pasiekia 100mV įtampą. Kompiuterinė programa automatiškai perskaičiuoja QP ir parodo rezultatą kompiuterio ekrane skaitmenine išraiška. Kuo didesnė QP rezultato skaitmeninė išraiška, tuo elektromechaninės kremzlės savybės blogesnės [98].

Prieš KKK mėginių elektromechaninių savybių vertinimą mėginiai buvo palaikyti PBS tirpale 20 minučių. Prietaisu Arthro-BST™ kiekvienos grupės visų mėginių elektromechaninės kremzlės savybės buvo įvertintos po 5 kartus, kad būtų galima tiksliau nustatyti QP vidurkį.

4.1.5. Chondrocitų gyvybingumo vertinimas

Po elektromechaninių savybių įvertinimo KKK skalpeliu buvo padalyti pusiau. Viena KKK pusė buvo panaudota chondrocitų gyvybingumui įvertinti.

Mėginiai buvo nudažyti imunohistocheminiais LIVE/DEAD® rinkinio dažais (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Rinkinys sudarytas iš 1 μM kalceino AM (angl. calcein AM) ir 2 μM etidium homodimero-1 (angl.

Ethi-dium homodimer-1). Kalceinas AM jungdamasis prie ląstelės membranos

atpalaiduoja žalią dažą, taip pažymėdamas gyvas ląsteles. Etidium homo-dimero-1 dažas jungiasi su endoplazminiu ląstelės tinklu ir taip negyvas ląsteles nudažo raudona spalva. Dažymas atliktas mėginius 40 min. laikant inkubatoriuje, 37 °C temperatūroje. Po to KKK tris kartus po 10 min. buvo plauti PBS tirpale.

Po dažymo etapo mėginiai buvo supjaustyti 200 μm storio sluoksniais. Konfokaliniu mikroskopu LSM 700 Axio Observer Z.1 atpjauti mėginių gabaliukai buvo apšviesti poliarizuota šviesa ir nufotografuoti. Konfokalinio mikroskopo giluminiai pjūviai tarp sluoksnių buvo 0,74 μm. Kiekvieno sluoksnio mikroskopinis vaizdas buvo fotografuojamas. Iš šių sluoksninių nuotraukų buvo sudaromos bendros (suminės) nuotraukos. Gyvybingų chondrocitų kiekis buvo apskaičiuojamas kiekvienoje nuotraukoje pasi-renkant du 200 × 400 μm kremzlės plotus. Gauti rezultatai skaičiuoti Image

J versijos 1.47q programa. Chondrocitų gyvybingumas išreikštas procentais

nuo visų kremzlėje rastų chondrocitų. Šviežiai paimtų kremzlės mėginių rezultatai buvo naudojami kaip kontroliniai pakitimams įvertinti.

4.1.6. Histologinis mėginių vertinimas

Kita perpjautų KKK pusė buvo panaudota histologiniam kremzlės iš-tyrimui, vertinant chondrocitų apoptozę, GAG pasiskirstymą bei morfolo-ginius pokyčius naudojant Mankino histologinio vertinimo skalę [67].

KKK buvo fiksuoti 10 proc. neutraliame buferiniame formalino tirpale. Dekalcifikacija atlikta naudojant Shandon TBD-2 Decalcifier (TBD; „Ther-mo Scientific“, JAV) tirpalą, mėginius laikant 3 savaites, vėliau juos fiksuo-jant parafino bloke. Paruošti 5 μm storio kremzlės pjūviai buvo nudažyti safranino O fast green dažais. Safranino O dažai nudažė hialininės kremzlės

matriksą raudonai taip išryškindami glikozaminoglikanus (GAG) [55]. Nudažyti mėginiai buvo nufotografuoti, naudojant šviesinį mikroskopą

Olympus BX63 su įmontuotu Olympus DP72 CCD fotoaparatu bei naudojant

„CellSens Dimension“ vizualizavimo programą. Tyrimo mikroskopu metu visi KKK mėginių vaizdai padidinti 4 kartus. Norint įvertinti GAG raišką, nufotografuoti mėginiai išanalizuoti Image J programa, kaip yra apibūdinta moksliniame tyrime [68], vertintas kiekvienas mėginys, nustatant šviesos komponenčių santykį tarp raudonos, žalios ir mėlynos spalvos. Tyrimo metu gauti vaizdai naudojant programą buvo paversti į 256 baltos ir juodos spalvų paletę. Raudonos spalvos intensyvumas išreikštas procentais nuo visų spalvų komponenčių sumos.

Mėginių histologinė struktūra taip pat papildomai buvo įvertinta Man-kin’o histologinio vertinimo skale [67], kurios kriterijai parodyti 4.1.6.1 lentelėje.

4.1.6.1 lentelė. Mankin’o vertinimo kriterijai

Mankin’o histologinio vertinimo skalė Struktūra

Sveikas paviršius 0

Paviršiniai įtrūkimai 1

Įtrūkimai siekiantys kremzlės vidurį 2

Įtrūkimai siekiantys kaulą 3

Visiškas kremzlės nebuvimas 4

Ląstelės

Normalios 0

Sugrupuotos/ besidauginančios 1

Pavienės padidinto skaičiaus ląstelių zonos 2

Zonos be ląstelių 3

Dažų pasiskirstymas mėginiuose, dažant hematoksilinu ir eozinu su Safranino O

Normalus 0 Nedidelis sumažėjimas 1 Vidutinis sumažėjimas 2 Didelis sumažėjimas 3 Mėginys nenusidažė 4 Maksimalus balas 11

Pagal šią skalę sveika kremzlė vertinama 0 balų, o kremzlės pažeidimą rodo didesnis balų skaičius.

4.1.7. Apoptozės vertinimas

KKK chondrocitų apoptozė buvo įvertinta, mėginius nudažius TUNEL rinkiniu (ApopTag® Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit; Millipore, USA). Dažant mėginius buvo laikomasi gamintojo nurodymų.

nizuoti pjūviai laikyti 20 μg/mL Proteinazės K (Ambion) tirpale, kambario temperatūroje 15 min. Endogeninė chondrocitų peroksidazė inaktyvuota pa-naudojus 3 proc. vandenilio peroksido tirpalą, laikant mėginius 5 min. Po to visi mėginiai laikyti inkubatoriuje 60 min. 37 °C temperatūroje. Vėliau histologiniai pjūviai laikyti 30 min. antidigoksigenino tirpale su antikūnais tam, kad peroksidazė prisijungtų laisvas molekules. Imunohistocheminiai antikūnai fiksuoti naudojant chromogeninį DAB substratą (Sigma) 10 min. Mėginiai dažyti metilo žaliojo (Sigma) tirpale 5 min., vėliau praplauti dis-tiliuotu vandeniu, išdžiovinti alkoholio tirpale, išvalyti ir padengti dengia-muoju stikleliu.

Histologinio vaizdo analizei mėginių vaizdas padidintas 200 kartų nau-dojant Olympus BX63 mikroskopą. Apoptotinių ląstelių kiekis (rudai juodų) ir gyvų (žalių) buvo suskaičiuotas 200 × 400 μm plotuose kiekvieno KKK mėginio kiekviename pjūvyje. Gauti rezultatai rodo procentinį apoptotinių ląstelių kiekį matuotame plote nuo bendro ląstelių kiekio.

4.2. In vivo eksperimento etapas 4.2.1. Naudota įranga

Kremzlės kaulo kompleksai transplantuoti steriliomis sąlygomis nau-dojant standartinius OATS instrumentus. Alogeniniai KKK laikyti šaldytuve 4 °C, atmosferiniame ore, nes in vitro eksperimento etapo metu buvo išsi-aiškinta, kad gyvybingiausia kremzlė išlieka KKK mėginius laikant DMEM terpėje be IGF-1 4 °C temperatūroje ne ilgiau nei 14 dienų (žr. „5.1.7. In

vitro tyrimų rezultatų bendras aptarimas“).

Autologinės PRP paruošimui naudota centrifuga „Rotofix“, plazmai at-skirti naudojant dvigubą Arthrex ABS-10010 švirkštą.

Elektromechaninėms kremzlės savybėms tirti naudotas prietaisas

Arthro-BST™.

Histologiniams vaizdams vertinti naudotas šviesinis mikroskopas

Olym-pus BX63 su įmontuotu Olympus DP72 CCD fotoaparatu bei naudojant

„CellSens Dimension“ vizualizavimo programą. Šiuo mikroskopu nufoto-grafuotų mėginių nuotraukose buvo vertintas GAG pasiskirstymas skaičia-vimo programa Image J versija 1.47q.

4.2.2. Naudotos terpės

Naudota maitinamoji terpė: DMEM tirpalas su 10 proc. FBS, 1 proc. PSF, 2 mM LG, 25 μg/mL AA ir 0,1 mM NMEM be IGF-1. (žr. skyrių „4.1.2. Naudotos terpės“).

4.2.3. In vivo etapo tyrimo eiga

Eksperimentiniame tyrime panaudoti dvidešimt šeši 5–6 mėnesių vy-riškos lyties Saaneno veislės ožiukai, sveriantys 15‒25 kg. In vivo ekspe-rimento etapas buvo išskirtas į dvi dalis. In vivo tyrimo schema parodyta 4.2.3.1 paveiksle.

4.2.3.1 pav. In vivo tyrimo schema

QP – kiekybinis potencialas; OAS – Oswestry makroskopinio vertinimo skalė; GAG – glikozaminoglikanai.

Pirmame in vivo tyrimo etape iš keturių 5‒6 mėnesių amžiaus Saaneno veislės vyriškos lyties ožiukų užpakalinių kojų kelio sąnarių vidinių šlau-nikaulio krumplių atraminių paviršių buvo paimti 6 mm diametro × 8 mm aukščio KKK (n = 13), naudojant OATS. Paimti mėginiai buvo laikomi 4 °C temperatūroje DMEM terpėje be IGF-1 14 dienų (žr. skyrių „4.1.2. Naudotos terpės“).

Antrosios in vivo tyrimo etapo dalies metu likusiems dvidešimt dviem vyriškos lyties 5‒6 mėnesių amžiaus Saaneno veislės ožiukams bendrinėje nejautroje buvo atliktos užpakalinių kojų abiejų (kairio ir dešinio) kelių

operacijos steriliomis sąlygomis, sąnarius atveriant vidiniu parapateliariniu pjūviu. Operacijų metu abiejų užpakalinių kojų kelio sąnarių vidinių šlau-nikaulio krumplių atraminiuose paviršiuose padaryti defektai, naudojant OATS.

Kontrolinėje ožiukų grupėje defektai buvo užpildyti autologiniu KKK transplantatu. Ši grupė pavadinta autologine OAT grupe (n = 9). Šioje grupėje kairės kojos kelio sąnario vidinio šlaunikaulio krumplio defektas buvo užpildytas iš to paties ožiuko dešinės kojos kelio sąnario išimtu autologiniu šviežiu KKK, o dešinės kojos kelio sąnario vidinio šlaunikaulio krumplio defektas buvo užpildytas iš to paties ožiuko kairės kojos kelio sąnario išimtu autologiniu šviežiu KKK. Tuoj po operacijos tik į kairės kojos kelio sąnarį buvo suleista autologinė PRP. Injekcijos kartotos praėjus 1 ir 2 mėnesiams po autologinės transplantacijos operacijos.

Tiriamojoje ožiukų grupėje abiejų užpakalinių kojų (dešinės ir kairės) sukurti vidinių šlaunikaulio krumplių defektai buvo užpildyti alogeniniais KKK, kurie buvo laikyti in vitro etape nustatytomis sąlygomis DMEM ter-pėje be IGF-1, 4 °C temperatūroje, 14 dienų. Ši grupė pavadinta alogenine OCA grupe (n = 13). Analogiškai po operacijos tik į kairės kojos kelio sąnarį buvo leista autologinė PRP, kurios injekcijos kartotos praėjus 1 ir 2 mėnesiams po alogeninės transplantacijos operacijos.

Ožiukų dešinės užpakalinės kojos kelio sąnarys tiek OAT, tiek OCA gru-pėse buvo palikti gyti klinikinėje praktikoje taikomu įprastu būdu, nelei-džiant PRP. Siekiant stimuliuoti alogeninio KKK regeneracijos ir integra-cijos procesą tiek OAT, tiek OCA grupėse į kairį ožiukų užpakalinės kojos kelio sąnarį buvo leista PRP tuojau pat po transplantacijos bei praėjus vie-nam ir dviem mėnesiams po jos.

Operacijos žaizda buvo susiūta pasluoksniui, patikrinti kelio sąnario judesiai, girnelės stabilumas. Po operacijų ožiukams buvo skirti vaistai nuo skausmo ir antibiotikai, skirta judėjimo terapija. Ožiukai buvo stebimi atitinkamai 3 bei 6 mėnesius po transplantacijos operacijos.

Praėjus 3 ir 6 mėnesiams po transplantacijos ožiukai buvo užmigdyti. Atvėrus operuotus kelio sąnarius, transplantuoti KKK buvo vertinti makro-skopinio vertinimo OAS skale, išmatuoti transplantų QP. Pašalinus vidinius šlaunikaulio krumplius, įvertintos mėginių histologinės savybės naudojant

O’Driscoll skalę. Taip pat įvertinta ir GAG raiška. Šie metodai aptariami

toliau esančiuose skyriuose.

4.2.4. Trombocitais praturtintos plazmos paruošimas ir naudojimas Autologinė PRP – trombocitais praturtinta plazma – buvo paruošiama iš ožiuko veninio kraujo. Procedūros metu naudojant dvigubą švirkštą (Arthrex

ABS-10010), iš jungo venos buvo paimta 10 ml veninio kraujo.

Tromboci-tais praturtinta plazma atskirta dvigubą švirkštą su ožiuko krauju centri-fuguojant 20 min. 2000G jėga Rotofix 32A centrifuga. Po centrifugavimo vidinio švirkšto pagalba, nusiurbta 2ml autologinės PRP, kuri buvo suleista į ožiuko kairės kojos kelio sąnarį tuoj po transplantacijos operacijos, praėjus 1 ir 2 mėnesiams po operacijos.

4.2.5. Makroskopinis mėginių vertinimas 4.2.5 lentelė. Modifikuota Oswestry skalė

Modifikuota Oswestry artroskopinio vertinimo skalė Transplantato lygis lyginant su aplinkine kremzle

Tame pačiame lygyje 2

Pakilęs aukščiau 1

Nusileidęs žemiau 0

Integracija į aplinkinę kremzlę

Visiška integracija 2

Maži plotai be integracijos (< 25 proc. ploto) 1 Dideli plotai be integracijos (_25 proc. ploto) 0 Paviršiaus išvaizda

Lygus paviršius 2

Pavieniai netolygumai 1

Dauginiai netolygumai 0

Transplantato spalva

Hialininė perlo spalva 2

Balta 1

Geltona, matomas kaulas 0

Maksimalus balas 8

Vertinimo kriterijai pavaizduoti 4.2.5 lentelėje, kurioje transplantatų išvaizda buvo vertinta naudojant modifikuotą Oswestry artroskopinę verti-nimo skalę (OAS) [15]. Lentelėje maksimali balų suma gali būti 8, kas rodo gerą kremzlės būklę. Ši skalė modifikuota, neįtraukiant vertinimo artro-skopiniu kabliuku, kuris naudojamas norint įvertinti kremzlės kietumą. Šioje modifikuotoje OAS skalėje kremzlės kietumas nematuotas, kadangi šis kriterijus buvo įvertintas, išmatuojant QP Arthro-BSTTM

aparatu.

4.2.6. Elektromechaninių savybių vertinimas

In vivo eksperimento etape praėjus 3 ir 6 mėnesiams po transplantacijos

operacijos elektromechaninės KKK savybės buvo vertintos tokiu pat būdu kaip ir in vitro etape, naudojant aparatą Arthro-BSTTM. Kiekvieno mėginio matavimas atliktas 5 kartus siekiant kuo tiksliau įvertinti QP vidurkį. Atsi-žvelgiant į transplantacijos pobūdį buvo sudarytos atitinkamos kontrolinės grupės.

Mėginių, išlaikytų 4 °C temperatūros DMEM terpėje be IGF-1 14 dienų, QP matavimo duomenys buvo laikomi kontroliniais tiriamosios OCA gru-pės matavimo rezultatams įvertinti praėjus 3 ir 6 mėnesiams po transplan-tacijos. Šviežiai paimtų autologinių KKK QP matavimo duomenys buvo kontroliniai OAT grupės rezultatams įvertinti praėjus 3 ir 6 mėnesiams po transplantacijos.

4.2.7. Histologinis vertinimas

Makroskopiškai įvertinus vidinių šlaunikaulių krumplių, transplantuotų KKK būklę ir išmatavus QP po transplantacijos, šlaunikaulio vidiniai krumpliai buvo fiksuoti parafininiuose blokuose pagal tokią pačią metodiką kaip ir in vitro etape. Mėginiai perpjauti pusiau, atlikti 5 µm storio pjūviai nuo KKK centro ir nudažyti safraninu O fast green pagal tokią pat meto-diką, kaip ir in vitro etapo metu. Histologinei struktūrai vertini buvo naudotas tas pats mikroskopas kaip ir in vitro etapo metu, nekeičiant sąlygų.

Nuotraukos darytos taip pat su tokia pačia fotokamera kaip ir in vitro etapo metu. Histologiniams pjūviams vertinti buvo naudota O’Driscoll skalė [73]. O’Driscoll skalės vertinimo kriterijai parodyti 4.2.7 lentelėje.

Pagal šią skalę, kuo didesnis balų įvertinimas, tuo geresnės kremzlės histologinės savybės. Maksimali balų suma gali būti 24.

GAG raiškos įvertinimas buvo atliktas kaip nurodyta metodikoje (žr. „4.1.6. Histologinis mėginių vertinimas“).

4.2.7 lentelė. O’Driscoll histologinio vertinimo skalė

O’Driscoll histologinio vertinimo skalė 1. Ląstelių morfologija

Hialininė kremzlė 4

Nepakankamai diferencijuotos mezenchiminės ląstelės 2

Fibrozinis audinys ar kaulas 0

2. Dažymas safraninu O

Normalus ar beveik normalaus 3

Vidutinis 2

Silpnas 1

Nėra 0

3. Paviršiaus lygumas

Lygus nepažeistas 3

Paviršinio sluoksnio sluoksniuotumas 2

Įtrūkimai nuo 25 iki 100 proc. storio 1

Gilūs įtrūkimai ar fibriliacijos 0

4. Integracija

Normali 2

Pavieniai įtrūkimai, cistos 1

Gilūs įtrūkimai 0

5. Kremzlės storis

100 proc. normali kremzlė 2

50–100 proc. nuo viso kremzlės storio 1

0–50 proc. nuo viso kremzlės storio 0

6. Integracijos nebuvimas

Abiejuose transplanto galuose 2

Viename pilnai, arba dalinai abiejuose 1

Nei viename 0

7. Ląstelių sumažėjimas

Normalus kiekis ląstelių 3

Nedidelis sumažėjimas 2

Didelis sumažėjimas 1

Pavienės ląstelės 0

8. Chondrocitų sankaupos (klasteriai)

Nėra sankaupų 2

< 25 proc. ląstelių 1

25–100 proc. ląstelių 0

9. Aplinkinio audinio pakitimai

Normalus ląstelių kiekis, be sankaupų, normalus nusidažymas 3 Normalus ląstelių kiekis, pavienės sankaupos, įvairus nusidažymas 2 Lengvas ar vidutinis ląstelių kiekio sumažėjimas, silpnas nusidažymas 1 Mažas ląstelių kiekis, blogas arba visiškas nenusidažymas 0 Maksimalus balas 24

4.3. Statistinė duomenų analizė

Abiejų mokslinio tyrimo etapų duomenys analizuoti „SPSS v.19“ („IBM“) programiniu paketu. Duomenys yra išreikšti kaip vidurkis ± stan-dartinė deviacija.

In vitro etape statistinė analizė tarp grupių atlikta naudojant vienakryptę

pasikartojančių bandymų analizę (ANOVA), naudojant neparametrinį dau-giafaktorinį Bonferoni post hoc kriterijų. Ryšys tarp QP, chondrocitų gy-vybingumo, apoptotinių ląstelių kiekio, GAG pasiskirstymo bei histologinio vertinimo skalės rezultatų įvertintas neparametriniu Spearmano koreliacijos koeficientu.

In vivo etapo metu atskirų kriterijų rezultatai vertinti neparametriniu

Mann-Whitney′aus-Wilcoxon’o kriterijumi. Skirtumas tarp eksperimentinių grupių vertintas, naudojant nepriklausomų imčių t-testą. Ryšys tarp QP, histologinio vertinimo skalės, makroskopinio įvertinimo bei raudonos spal-vos intensyvumo nustatytas naudojant dvinarį Pearson’o koreliacijos koe-ficientą.

Imties galia apskaičiuota naudojant GPower 3.1 programa (Franz Faul universitetas, Kylis, Vokietija).

Duomenys skyrėsi statistiškai reikšmingai, kai p < 0,05.

5.

REZULTATAI

Gautų rezultatų analizė šiame skyriuje aprašyta tokia pačia chronologine tvarka, kokia buvo vykdomas šis mokslinis tyrimas. Visų grupių jėga buvo > 0,9.

5.1. In vitro tyrimo rezultatai 5.1.1. Elektromechaninės KKK savybės

In vitro eksperimentinio tyrimo etape iš ožiukų vidinių šlaunikaulių

gumburų buvo paimti KKK mėginiai, kurie pagal tyrimo planą 4.1.3.1 buvo laikomi skirtingose temperatūrose, skirtingose terpėse ir skirtingą laiką. Elektromechaninės kremzlės savybės buvo įvertintos Arthro-BST™ aparatu trimis etapais: 1) tuojau pat po operacijos; 2) po 14 dienų; 3) po 28 dienų.

Atlikus matavimus šviežių KKK grupėje nustatytas kontrolinis QP vidurkis, kuris buvo lygus 4 ± 0,23.

Mėginių, išlaikytų 14 dienų −70 °C temperatūroje, vidutinis QP užre-gistruotas 5,6 ± 0,49. Mėginių, išlaikytų 14 dienų DMEM terpėje be IGF-1 4 °C temperatūroje vidutinis QP buvo 4,43 ± 0,15, o 37 °C temperatūroje – 5,57 ± 0,43. Ženklus QP padidėjimas buvo stebėtas KKK mėginiuose, lai-kytuose 14 dienų −70 °C temperatūroje bei 37 °C temperatūros terpėje be IGF-1. Palyginus tarpusavyje gautus rezultatus, statistiškai reikšmingas QP skirtumas buvo tarp KKK mėginių, išlaikytų 14 dienų −70 °C ir terpėje be IGF-1 4 °C (p < 0,001). Toks pats QP vidurkių skirtumas nustatytas KKK, laikytuose terpėje be IGF-1 4 °C ir 37 °C (p < 0,001) temperatūrose. Tokiu būdu KKK mėginių, 14 dienų laikytų terpėje be IGF-1 4°C temperatūroje, išmatuotas QP vidurkis buvo mažiausias lyginant su −70 °C ir terpėje be IGF-1 37 °C temperatūroje laikytų mėginių QP vidurkiu (p < 0,001).

Mėginių, laikytų 14 dienų terpėje su IGF-1, vidutinis QP 4°C tempe-ratūroje buvo 4,53 ± 0,27, o 37 °C tempetempe-ratūroje ‒ 4,77 ± 0,32. Statistiškai reikšmingo skirtumo tarp šių KKK QP vidurkių nestebėta.

Lyginant rezultatus, tarp mėginių, laikytų 14 dienų terpėje su IGF-1 ir be IGF-1, statistiškai reikšmingas skirtumas rastas tik 37 °C temperatūros (p < 0,005) KKK laikymo sąlygomis.

Mėginių, išlaikytų 28 dienas –70 °C temperatūroje, vidutinis QP užregis-truotas 5,93 ± 0,33. Mėginių, išlaikytų 28 dienas terpėje be IGF-1, 4 °C tem-peratūroje vidutinis QP buvo 5,17 ± 0,34, o 37 °C temtem-peratūroje ‒ 6,63 ± 0,34. Lyginant rezultatus, statistiškai reikšmingas QP vidurkių skirtumas buvo tarp KKK mėginių, išlaikytų 28 dienas terpėje be IGF-1 4 °C ir 37 °C temperatūrose (p < 0,001).

Naudojant neparametrinį daugiafaktorinį Bonferoni post hoc kriterijų reikšmingo skirtumo nestebėta lyginant rezultatus tarp –70 °C ir 4 °C tem-peratūrų mėginių grupių. Taip pat reikšmingo skirtumo nestebėta lyginant rezultatus tarp –70 °C ir 37 °C temperatūrų mėginių grupių (p > 0,05).

Mėginių, laikytų 28 dienas terpėje su IGF-1, 4 °C temperatūroje vidutinis QP buvo 5,23 ± 0,60, o 37 °C – 6,87 ± 0,53. Lyginant šiuos rezultatus, tarp mėginių laikytų 28 dienas terpėje su IGF-1, statistiškai reikšmingo skirtumo nestebėta.

Arthro-BST™ aparatu nustatyti skirtingomis sąlygomis ir skirtingą laiką

laikytų KKK elektromechaninių savybių rezultatai pateikti 5.1.1.1 paveiks-le. Šiame paveiksle grafiškai pavaizduota QP priklausomybė nuo mėginių laikymo sąlygų ir laikymo trukmės.

5.1.1.1 pav.Elektromechaninių KKK savybių matavimo rezultatai laikytų

skirtingomis in vitro sąlygomis mėginių grupėse

QP – elektromechaninės kremzlės savybės.

Reikšmingumo lygmuo tarp grupių: *p < 0,001; **p < 0,001; # p < 0,05. Visų grupių QP rezultatai skyrėsi nuo kontrolinės (šviežios) grupės QP rezultatų (*).

Aukščiau išnagrinėti matavimų rezultatai akivaizdžiai parodė, kad išma-tuoti QP vidurkiai statistiškai reikšmingai skyrėsi nuo kontrolinių šviežios kremzlės duomenų (p < 0,001) visose KKK grupėse, nepriklausomai nuo to ar 14, ar 28 dienas jie buvo išlaikyti atitinkamose temperatūrų ir terpių sąlygose.

Gautų matavimų analizė parodė, kad šviežiai kremzlei artimiausios elektromechaninės savybės buvo nustatytos mėginiuose, laikytuose 14 dienų terpėje be IGF-1 4 °C temperatūroje. Nors terpėje su IGF-1 QP 37 °C tem-peratūroje po 14 dienų sumažėjo, tačiau skaitine išraiška vis tiek QP buvo didesnis nei KKK mėginių, laikytų 14 dienų terpėje be IGF-1 4 °C tempe-ratūroje.

5.1.2. Chondrocitų gyvybingumas

LIVE/DEAD® dažais nudažytų kremzlės pjūvių vaizdai parodyti 5.1.2.1 paveiksle.

5.1.2.1 pav. Chondrocitų gyvybingumas skirtingose sąlygose laikytų

mėginių grupėse (Live/Dead dažymas)

Chondrocitų gyvybingumo matavimai atlikti kaip aprašyta metodikoje. Tuoj po operacijos buvo nustatytas šviežių KKK gyvybingų kremzlės chondrocitų skaičius, t.y. 83,3 ± 2,98 proc. Šie rezultatai buvo naudoti kaip kontroliniai duomenys pakitimams nustatyti.

Po 14 dienų mažiausias gyvybingų chondrocitų kiekis buvo stebėtas KKK mėginiuose, laikytuose −70 °C temperatūroje, kur gyvybingų ląstelių buvo 35,2 ± 6,9 proc. Mėginiuose laikytuose 14 dienų DMEM terpėje be IGF-1 4 °C temperatūroje gyvybingų ląstelių buvo rasta 58,22 ± 4,07 proc., o 37 °C temperatūroje gyvybingų chondrocitų buvo 44,87 ± 4,53 proc. Analizuojant gautus rezultatus tarp KKK mėginių grupių be IGF-1, išlaikytų 14 dienų, nustatyta, kad mažiausiai gyvybingų ląstelių buvo rasta KKK mėginiuose, laikant juos −70 °C temperatūros sąlygomis. Šios grupės rezul-tatai statistiškai reikšmingai skyrėsi tik nuo KKK, laikytų 4 °C temperatūros terpėje be IGF-1 (**p < 0,001). Daugiausiai gyvybingų ląstelių po 14 dienų rasta 4 °C temperatūros DMEM terpėje be IGF-1, lyginant su 37 °C

temperatūros terpėje be IGF-1 laikytais KKK, kur stebėtas statistiškai reikš-mingas skirtumas (p = 0,003).

Mėginių, laikytų 14 dienų 4 °C temperatūros terpėje su IGF-1, gyvybingų chondrocitų kiekis buvo 53,89 ±6,48 proc., o 37 °C su IGF-1 ‒ 49,22 ± 7,35 proc. Lyginant gyvybingų chondrocitų kiekio rezultatus statistiškai reikšmingo skirtumo tarp KKK grupių, laikytų 14 dienų terpėje su IGF-1, nestebėta (p > 0,05).

Pažymėtina, kad po 14 dienų IGF-1 įtakojo KKK gyvybingų chondrocitų kiekio padidėjimą tik 37 °C grupėje, tačiau lyginant su 37 °C be IGF-1 gru-pės rezultatais, statistiškai reikšmingo skirtumo nestebėta.

Po 28 dienų −70 °C temperatūroje laikytuose KKK, gyvybingi chondro-citai sudarė tik 35,46 ± 4,36 proc. Mėginių laikytų DMEM terpėje be IGF-1 4 °C temperatūroje gyvybingų chondrocitų išliko 57,80 ± 2,71 proc., o 37 °C ‒52,02 ± 5,97 proc.. Palyginus šių grupių rezultatus, statistiškai reikš-mingo skirtumo tarp jų nerasta.

KKK, laikytų 28 dienas terpėje su IGF-1 4 °C temperatūroje, gyvybingų chondrocitų buvo 53,81 ± 4,90 proc., o 37 °C temperatūroje- 49,93 ± 4,96 proc. Lyginant KKK išlaikytų 28 dienas terpėse su IGF-1 rezultatus tarp 4 °C ir 37 °C temperatūrų grupių, reikšmingo gyvybingų chondrocitų kiekio skirtumo nestebėta (p > 0,05).

KKK mėginius, laikant −70 °C temperatūros sąlygomis 28 dienas ir ly-ginant su kitomis grupėmis, išlaikytomis tiek pat laiko, gyvybingų ląstelių kiekis buvo mažiausias ir rezultatas statistiškai reikšmingai skyrėsi (p ≤ 0,001).

Apibendrinti gyvybingų chondrocitų rezultatai parodyti 5.1.2.2 paveiksle pagal kiekvieną KKK grupę. Duomenys pateikiami procentine išraiška. Pa-žymėtina, kad po 14 ir 28 dienų visose KKK tiriamosiose grupėse chond-rocitų kiekis sumažėjo.

Apibendrinant gautus rezultatus, gyvybingų chondrocitų kiekio vidurkis statistiškai reikšmingai skyrėsi nuo kontrolinių duomenų tiek po 14, tiek po 28 dienų laikymo skirtingų temperatūrų sąlygomis visose grupėse (p ≤ 0,001). Apskaičiuotas gyvybingų chondrocitų kiekis parodė, kad gyvybin-giausia kremzlė išliko KKK mėginius laikant DMEM terpėje, 4 °C tem-peratūros, 14 dienų, lyginant juos su šaldytų mėginių grupe ir mėginiais, kurie laikyti terpėje, inkubuojant juos 37 °C temperatūroje. Nors terpėje su IGF-1 gyvybingų chondrocitų kiekis 37 °C temperatūroje po 14 dienų pa-didėjo, tačiau skaitine išraiška vis tiek buvo mažesnis nei KKK mėginiuose, laikytuose terpėje be IGF-1 4 °C temperatūroje po 14 dienų.

5.1.2.2 pav.Gyvybingų chondrocitų kiekis procentais skirtingomis

sąlygomis laikytų mėginių grupėse

Reikšmingumo lygmuo tarp grupių: *p ≤ 0,001; **p < 0,001; ***p < 0,003; # p ≤ 0,001. Visų grupių rezultatai skyrėsi nuo kontrolinės (šviežios) grupės rezultatų (*). Po 28 dienų −70 °C grupės rezultatai skyrėsi nuo visų grupių rezultatų po 28 dienų (#).

5.1.3. GAG pasiskirstymas KKK

Mėginius nudažius safranino O fast green dažais buvo padarytos nuo-traukos, kaip nurodyta metodikoje. Kremzlėje GAG pasiskirstymas paro-dytas 5.1.3.1 paveiksle pagal grupes ir laikymo trukmę.

5.1.3.1 pav.Histologiniai pjūviai nudažyti safraninu O skirtingomis

sąlygomis laikytų mėginių grupės