LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
Tomas Bukauskas
MOLEKULINIŲ ŽYMENŲ RAIŠKA
INFEKCINIO BEI ASEPTINIO
SISTEMINIO UŽDEGIMO METU IR
SĄSAJOS SU LIGOS YPATUMAIS
Daktaro disertacijaMedicinos ir sveikatos mokslai, medicina (M 001)
Disertacija rengta 2015–2020 metais Lietuvos sveikatos mokslų universitete, Anesteziologijos klinikoje.
Mokslinis vadovas
prof. dr. Andrius Macas (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, medici-nos ir sveikatos mokslai, medicina – M 001).
Konsultantas
prof. dr. Almantas Maleckas (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, me-dicinos ir sveikatos mokslai, medicina – M 001).
Disertacija ginama Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos mokslo krypties taryboje:
Pirmininkė
prof. dr. Brigita Šitkauskienė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, medicinos ir sveikatos mokslai, medicina – M 001).
Nariai:
prof. dr. Rasa Ugenskienė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, gam-tos mokslai, biologija– N 010);
prof. dr. Povilas Jakuška (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, medi-cinos ir sveikatos mokslai, medicina – M 001);
prof. dr. Pranas Šerpytis (Vilniaus universitetas, medicinos ir sveikatos mokslai, medicina – M 001);
prof. dr. Osvaldas Pranevičius (Niujorko presbiterionų ligoninė (JAV), medicinos ir sveikatos mokslai, medicina – M 001).
Disertacija ginama viešame Medicinos mokslo krypties tarybos posėdyje 2020 m. balandžio 20 d. 14 val. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Vaikų ligų klinikos 4004 auditorijoje.
Disertacijos gynimo vietos adresas: Eivenių g. 2, LT-50161, Kaunas, Lietuva.
LITHUANIAN UNIVERSITY OF HEALTH SCIENCES MEDICAL ACADEMY
Tomas Bukauskas
EXPRESSION OF MOLECULAR
BIOMARKERS IN INFECTIOUS OR
ASEPTIC SYSTEMIC INFLAMMATION
AND THEIR RELATION
TO THE DISEASE FEATURES
Doctoral Dissertation Medical and Health Sciences,
Medicine (M 001)
Dissertation has been prepared at the Department of Anesthesiology of Lithuanian University of Health Sciences during the period of the 2015–2020 year.
Scientific Supervisor
Prof. Dr. Andrius Macas (Lithuanian University of Health Sciences, Medi-cal and Health Sciences, Medicine – M 001).
Consultant
Prof. Dr. Almantas Maleckas (Lithuanian University of Health Sciences, Medical and Health Sciences, Medicine – M 001).
Dissertation is defended at the Medical Research Council of Lithuanian University of Health Sciences:
Chairman
Prof. Dr. Brigita Šitkauskienė (Lithuanian University of Health Sciences, Medical and Health Sciences, Medicine – M 001).
Members:
Prof. Dr. Rasa Ugenskienė (Lithuanian University of Health Sciences, Na-tural Sciences, Biology – N 010);
Prof. Dr. Povilas Jakuška (Lithuanian University of Health Sciences, Me-dical and Health Sciences, Medicine – M 001);
Prof. Dr. Pranas Šerpytis (Vilnius University, Medical and Health Scien-ces, Medicine – M 001);
Prof. Dr. Osvaldas Pranevičius (New York – Presbyterian Hospital (USA), Medical and Health Sciences, Medicine – M 001).
Dissertation will be defended at the open session of the Medical Research Council on the 20th of April 2020 at 2 p.m. in the auditorium 4004 of the Department of Pediatrics of Lithuanian University of Health Sciences.
5
TURINYS
SANTRUMPOS ... 8
SĄVOKOS ... 10
1. ĮVADAS ... 11
1.1. Tyrimo tikslas ir uždaviniai... 12
1.2. Tyrimo aktualumas ... 12
1.3. Tyrimo naujumas... 13
2. LITERATŪROS APŽVALGA ... 14
2.1. Infekcinio uždegimo keliami iššūkiai ... 14
2.2. Infekcijos sąlygotas imuninis atsakas ... 16
2.3. Infekcinio proceso poveikis hemodinamikai... 17
2.4. Gretutinių ligų įtaka infekcijos eigai ... 18
2.5. MiRNR ... 19
2.6. Infekcinis uždegimas ir miRNR ... 22
2.7. MIRNR ir širdies raumens bei kraujagyslių pažaida ... 23
2.8. MiRNR pritaikymas imunomoduliacijoje ir parinkimo tyrimui galimybės... 23
2.9. Biocheminių rodiklių pokyčiai sisteminio uždegimo metu... 24
3. TYRIMO METODIKA ... 26
3.1. Tyrimo organizavimas... 26
3.2. Tiriamųjų kontingentas ... 26
3.3. Asmenų pakvietimo dalyvauti tyrime procedūra ... 28
3.4. Duomenų rinkimas ... 28
3.4.1. Pradinis etapas... 29
3.4.2. Intraoperacinis etapas ... 34
3.4.3. Baigiamasis etapas ... 34
3.5. Tyrimo metodai ... 34
3.5.1. Imties tūrio įvertinimas ... 34
3.5.2. Kraujo mėginių paėmimas ... 35
3.5.3. Spektrofotometrinis tiriamosios medžiagos vertinimas ... 36
3.5.4. MiRNR biožymenų tyrimas ... 36
3.5.5. RNR molekulių išgryninimas... 38
3.5.6. Atvirkštinės transkripcijos reakcija ... 39
3.5.7. Kiekybinės polimerazės grandininės reakcijos atlikimas ... 41
3.6. Duomenų analizės metodai ... 42
3.6.1. Statistinė analizė ... 42
3.6.2. MiRNR raiškos įvertinimas reliatyviai kiekybiniu būdu ... 45
4. REZULTATAI ... 47
6
4.2. Peritonitu sergančių pacientų miRNR analizė ... 49 4.2.1. Peritonitu sergančių pacientų ir referentinės grupės ligonių kraujo serumo miR-30d-5p, miR-146a-5p ir miR-23a-3p raiškos palyginimas ... 49 4.2.2. Ryšio tarp kraujo serumo miR-30d-5p, miR-146a-5p,
miR-23a-3p raiškos ir ligos sunkumo nustatymas peritonito metu .. 50 4.2.3. Biožymenų miR-30d-5p, miR-146a-5p ir miR-23a-3p
raiškos pokytis, esant skirtingai peritonito simptomų trukmei ... 53 4.2.4. Demografinių, klinikinių, rutininių kraujo tyrimų įtakos
miRNR biožymenų verčių, mažesnių už atpažinimo atskirties
tašką, nustatymas peritonito metu ... 55 4.3. Demografinių, klinikinių, rutininių kraujo tyrimų rodiklių
palyginimas tarp grupių ... 55 4.3.1. Ryšio tarp demografinių, klinikinių, rutininių kraujo
tyrimų rodiklių ir ligos sunkumo nustatymas peritonito metu ... 55 4.3.2. Demografinių, klinikinių rodiklių, rutininių kraujo tyrimų įtaka pacientų, sergančių peritonitu, būklės sunkumui ... 60 4.3.3. Demografinių, klinikinių rodiklių, rutininių kraujo tyrimų prognozinė vertė, sergant peritonitu ... 60 4.3.4. Intraveninių skysčių ir vazopresorių skyrimas prieš ir
per operaciją, peritonitu sergantiems pacientams ... 61 4.4. Duomenų rezultatai, esant ST pakilimo ŪMI ... 62
4.4.1. Demografinių, klinikinių, rutininių kraujo tyrimų rodiklių charakteristika, esant ST pakilimo ŪMI ... 62 4.4.2. Kraujo serumo miR-30d-5p, miR-146a-5p ir miR-23a-3p raiška pacientų su ST pakilimo ŪMI ... 64 4.4.3. Ryšio tarp kraujo serumo miR-30d-5p, miR-146a-5p, ... 66 miR-23a-3p biožymenų raiškos ir ligos sunkumo bei mirštamumo rizikos nustatymas ŪMI su ST pakilimu metu ... 66 4.5. MiR-30d-5p, miR-146a-5p, miR-23a-3p savybės, diferencijuojant peritonitą nuo ST pakilimo ūminio miokardo infarkto ... 68
4.5.1. Kraujo serumo miR-30d-5p, miR-146a-5p ir miR-23a-3p raiškų palyginimas tarp pacientų, sergančių peritonitu, ir pacientų, patyrusių ST pakilimo ŪMI ... 68 4.5.2. MiR-30d-5p, miR-146a-5p, miR-23a-3p diferencinės
savybės, esant infekciniam (peritonitas) ir aseptiniam (ST
pakilimo ūminis miokardo infarktas) sisteminiam atsakui ... 70 4.5.3. Prognozinė miR-30d-5, miR-146a-5pir miR-23a-3p
7
5. REZULTATŲ APTARIMAS ... 74
5.1. Kraujo serumo miR-30d-5p, miR-146a-5p ir miR-23a-3p raiškos pokytis infekcinio proceso metu ... 74
5.2. Demografinių, klinikinių rodiklių, rutininių kraujo tyrimų reikšmė peritonito ir ST pakilimo ŪMI metu vertinant ligos sunkumą ... 76
5.3. Klasifikacinis veiksmingumas ir prognozinė miR-30d-5, miR-146a-5p, miR-23a-3p vertė peritonito metu ... 78
5.4. Demografinių, klinikinių rodiklių, rutininių kraujo tyrimų prognozinė vertė, sergant peritonitu ... 79
5.5. Intraveninių skysčių skyrimas infekcijos metu ... 80
5.6. MiRNR raiška ST pakilimo ŪMI metu ... 81
5.7. Ligos simptomų trukmės poveikis miRNR raiškai ... 82
5.8. Klasifikacinis veiksmingumas ir prognozinė miR-30d-5p, miR-146a-5p, miR-23a-3p vertė ŪMI su ST pakilimu metu ... 84
5.9. Ryšio tarp kraujo serumo miR-30d-5p, miR-146a-5p, miR-23a-3p biožymenų raiškos ir ligos sunkumo vertinimas ... 84
6. TYRIMO TRŪKUMAI ... 86 IŠVADOS ... 87 PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 88 SUMMARY ... 89 BIBLIOGRAFIJO SĄRAŠAS ... 110 PUBLIKACIJŲ SĄRAŠAS ... 131 PUBLIKUOTI STRAIPSNIAI ... 132 PRIEDAI ... 148 CIRRICULUM VITAE... 153 PADĖKA ... 154
8
SANTRUMPOS
AKFi – angiotenziną konvertuojančio fermento inhibitoriai AKS – arterinis kraujo spaudimas
APACHE II – ūminių fiziologinių, amžiaus ir lėtinių ligų įvertinimo skalė (angl. Acute Physiology And Chronic Health Evaluation II) ARB – angiotenzino II receptorių blokatoriai
CRB – C reaktyvus baltymas CREA – kreatininas
cTnI – miokardo troponinas I
DATL – dalinis aktyvintas tromboplastino laikas DKS – diastolinis kraujo spaudimas
EKG – elektrokardiograma
GFG – glomerulų filtracijos greitis GKS – Glazgo komos skalė
GRACE – globalus ūmių koronarinių įvykių registras (angl. Global Registry of Acute Coronary Events)
HCT – hematokritas HGB – hemoglobinas
hs-cTnI – didelio jautrumo miokardo troponinas I IL-6 – interleukinas 6
INR – tarptautinis normalizuotas santykis (angl. international normalized ratio)
IŠL – išeminė širdies liga i/v – intraveniškai k/min. – kartai per minutę K+ – kalis
KILLIP – širdies nepakankamumo įverčio klasifikatorius ŪMI metu, skirtas prognozuoti neigiamas išeitis
KITS – kardiologijos intensyvios terapijos skyrius KMI – kūno masės indeksas
kPGR – metodas, leidžiantis padauginti DNR in vitro ir stebėti amplifikuojamo produkto kiekį kiekvienoje reakcijoje LEU – leukocitai
LIL – lėtinė inkstų liga
LOPL – lėtinė obstrukcinė plaučių liga LPS – lipopolisacharidai
LSMUL KK – Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninė Kauno klinikos
9 miRNR – mikro-ribonukleorūgštis ml/min – mililitrai per minutę mmol/l – milimoliai litre
MnSOD – magnio superoksido dismutazė μmol/l – mikromoliai litre
Na+ – natris
NF-κB – branduolio transkripcijos veiksnys kapa B
PaCO2 – dalinis anglies dvideginio slėgis arteriniame kraujyje
PaO2 – dalinis deguonies slėgis arteriniame kraujyje
PCT – prokalcitoninas
PI – pasikliautinasis intervalas PLT – trombocitai
RNR – ribonukleorūgštis
SKS – sistolinis kraujo spaudimas
SOFA – nuoseklaus organų nepakankamumo įvertinimo skalė (angl. The sequential organ failure assessment score)
SpO2 – hemoglobino įsotinimas deguonimi, vertinant pulsine oksimetrija
ŠSD – širdies susitraukimų dažnis STEMI – ST pakilimo miokardo infarktas SUA – sisteminis uždegiminis atsakas
SYNTAX – angiografijos duomenų skalė kompleksiniam išeminės širdies ligos sunkumo vertinimui
TLR – transmembraninis atpažinimo receptorius (angl. Toll-like receptor) TNF-α – naviko nekrozės faktorius α
ŪMI – ūminis miokardo infarktas VAS – vidutinis arterinis spaudimas
10
SĄVOKOS
Antrinis peritonitas – pilvaplėvės uždegimas, kurį sukelia mikroorganiz-mai, patenkantys į pilvaplėvės ertmę esant virškinamojo trakto žaizdai, pažei-dimui, nekrotizuojančiam segmentui [1].
Deoksirobonukleorūgštis (DNR) – ribonleorūgštis, kuri yra eukariotinėse ląstelėse, daugiausia jų branduoliuose. DNR azotinių bazių sekoje yra užko-duota genetinė informacija, kuri dalijimosi metu perduodama naujoms ląste-lėms arba per lytines ląsteles – individo palikuonims.
In vitro – lotyniškas posakis, reškiantis medicininį tyrimą, atliekamą arba stebimą dirbtinai sukurtoje aplinkoje.
In vivo – lotyniškas posakis, reškiantis medicininį tyrimą, atliekamą arba stebimą gyvame organizme.
Informacinė ribonukleorūgštis (iRNR) – ribonukleorūgštis, kurioje yra užkoduota pirminė baltymo struktūra. IRNR saugo ir perkelia genetinę informaciją iš ląstelės branduolio DNR į ląstelės baltymų sintezės vietą – ribosomas.
Intraabdominalinė infekcija – plačiai apibrėžiama kaip mikroorganizmų sukelti uždegiminiai procesai pilvo ertmėje [2].
Intraabdominalinis sepsis – pilvo ertmės infekcija, pasireiškianti sepsiu [3].
Peritonitas – pilvaplėvės, kuri apgaubia pilvo ertmę su organais, uždegi-mas [4].
Pirminis peritonitas – spontaninis bakterinis pilvaplėvės uždegimas. Jį su-kelia bakterijų translokacija per nepažeistą žarnyno sieną [5]. Šios infekcijos dažniausiai yra monomikrobinės. Diagnozei būtinas peritoninio skysčio mėginys.
Tretinis peritonitas – infekcinis procesas, kuris persistuoja arba pasikartoja praėjus bent 48 val. po tinkamo pirminio ar antrinio peritonito gydymo. Dėl prasto organizmo imuninio atsako tretinis peritonitas taip pat dažnai siejamas su mažiau virulentiškais mikroorganizmais [6].
Ūminis miokardo infarktas – miokardo ląstelių žūtis dėl ūžsitęsusios mio-kardo išemijos [7].
11
1. ĮVADAS
Infekcija, sepsis vis dar išlieka iššūkiais šiuolaikinėje medicininėje prakti-koje. Tvarios ekonomikos šalyse registruojama 100 sepsio atvejų 100 000 gyventojų [8]. Nepaisant įrodymais pagrįstų gydymo rekomendacijų, mumas sergant sepsiu siekia nuo 7 iki 50 proc. [9]. Taip pat didelis miršta-mumas –Europoje siekia 4,5–15,4 proc. – ankstyvuoju gydymo laikotarpiu stebimas ir tarp susirgusiųjų ūminiu miokardo infarktu (ŪMI) [10].
Medicininėje praktikoje kyla iššūkių atskiriant infekcinės kilmės sisteminį uždegiminį atsaką (SUA) nuo aspetinio proceso, taip pat stimuliuojančio už-degiminių rodiklių kitimą. Urgentinėje situacijoje gali būti sudėtinga diferen-cijuoti šių biožymenų pokyčio priežastį, įvykus ŪMI: uždegiminis atsakas gali būti sukeltas aseptinio išeminio audinių pažeidimo arba lygiagrečiai progresuojančio infekcinio proceso.
Infekcinio ir aseptinio SUA procesų imunopatologijos supratimas yra gy-vybiškai svarbus naujų diagnostikos, gydymo metodų paieškai, antibiotikų taikymo racionalizavimui, naujų imunoterapinių gydymo galimybių įvertini-mui. Šiuo metu vis dar trūksta informacijos apie priešuždegiminius, regulia-cinius procesus, veikiančius SUA metu. Minėti procesai gali slopinti ir stab-dyti uždegiminius mechanizmus organizmui sveikstant ir priešingai – akty-vinti imunosupresiją.
Įrodyta, kad uždegimo reguliaciniuose mechanizmuose svarbią vietą uži-ma mikro-ribonukleorūgšties (miRNR) sekos [11]. Suskaičiuojauži-ma daugiau nei 2000 miRNR molekulių [12]. Visų jų poveikis fiziologiniams bei pato-fiziologiniams procesams nėra pakankamai ištirtas. Tačiau in vitro jau pa-stebėta, kad miR-146a molekulės padeda koordinuoti atsaką į bakterijų lipo-polisacharadų (LPS) poveikį žmogaus ląstelėms [13]. Manoma, kad miR-23a gali kontroliuoti makrofagų aktyvumą, esant bakterinei infekcijai [14]. Taip pat pastebėta, kad miR-30d molekulės dalyvauja endocitozės, signalinių kelių valdyme [15]. Paminėtos miRNR yra įtrauktos ir į širdies bei kraujagyslių pažeidimo, neovaskuliarizacijos, apoptozės mechanizmus [16]. Vis dėlto būtina detaliau išnagrinėti šių miRNR raiškų nustatymo naudą ligų, susijusių su SUA, įvertinimui, diagnozavimui, diferencijavimui, gydymo taktikos pa-rinkimui.
Mokslinėse studijose jau yra aprašytos potencialios prognozinės ir diag-nostinės miRNR savybės kitų ligų metu [17, 18]. Per pastarąjį dešimtmetį buvo įrodyta, kad kraujo miRNR molekulių raiškos pokyčiai gali būti objek-tyviai vertinami prognozuojant įvairių ligų išeitis [19]. Sepsio, kitų SUA re-guliacinių veiksnių pažinimas gali tapti proveržiu, siekiant rasti naujų užde-giminių biožymenų, pagerinti esamą ar sukurti novatorišką gydymą.
12
Tyrimo tikslas ir uždaviniai Biomedicininio tyrimo tikslas:
Nustatyti molekulinių žymenų raišką infekcinio bei aseptinio sisteminio uždegimo metu ir įvertinti šių žymenų sąsajas su ligos ypatumais.
Pagrindiniai tyrimo uždaviniai:
1. Įvertinti miR-30d-5p, miR-146a-5p, miR-23a-3p raiškas, esant infek-cinio pobūdžio sisteminiam uždegimui (peritonitui).
2. Įvertinti sąsajas tarp miR-30d-5p, miR-146a-5p, miR-23a-3p žymenų, veiksnių galinčių įtakoti peritonito eigą (demografinių, klinikinių, bio-cheminių, ligos sunkumo, hemodinamikos valdymo).
3. Įvertinti miR-30d-5p, miR-146a-5p, miR-23a-3p raiškas, esant asep-tinio pobūdžio sisteminiam uždegimui (ūminiam miokardo infarktui su ST pakilimu) bei sąsajas su ligos sunkumu, uždegimo rodikliais. 4. Nustatyti miR-30d-5p, miR-146a-5p, miR-23a-3p diferencines,
prog-nozines savybes, esant infekcinio (peritonitas) ir aseptinio (ST pakilimo ūminis miokardo infarktas) pobūdžio sisteminiam uždegimui.
Tyrimo aktualumas
Medicinėje praktikoje išlieka situacijų, kai sudėtinga atskirti, ar SUA yra sukeltas infekcinio sukėlėjo, ar tai aseptinis uždegimas, sąlygotas ŪMI, ka-dangi aktyvinami uždegiminio atsako keliai persidengia tarpusavyje, o infek-cinio sukėlėjo įtarimas ypatingai svarbūs ankstyvai gydymo pradžiai.
40 proc. širdies sustojimo atvejų perioperaciniu laikotarpiu yra susiję su sepsiu, šių pacientų mirštamumas siekia 77 proc. [20]. Kiekvieno paciento sisteminis uždegiminis atsakas, kardiovaskulinė reakcija yra individualūs, gali skirtis uždegimą skatinančių ir slopinančių rodiklių išreikštumas, todėl ankstyvas, objektyvus ligos vertinimas gali būti neįmanomas. Tai didina gydymo išlaidas bei pacientų mirštamumą. Dėl šių priežasčių detaliau turėtų būti nagrinėjamos alternatyvios vertinimo, diagnostikos galimybės. Anks-tyvas infekcinio proceso, ŪMI atpažinimas ir gydymas gali pagerinti pacientų išeitis. Ieškant įrankių, padėsiančių personalizuoti paciento gydymą, atkreip-tinas dėmesys į miRNR molekules, kurių raiška kinta įvairių ligų metu [21]. Didžioji dalis ankstesnių tyrimų buvo atlikta su gyvūnais, todėl nėra gerai išaiškinta minėtų miRNR molekulių vertė ir pritaikymas žmonių gydymo praktikoje.
13
Tyrimo naujumas
Anksčiau jau buvo atlikti tyrimai, lyginantys sepsiu ir kitomis ligomis sergančių, sunkios būklės pacientų miRNR raiškas. Tačiau nebuvo atkreiptas dėmesys į kraujo serumo miR-30d-5p, miR-146a-5p ir miR-23a-3p raiškas, lyginant sergančiuosius peritonitu, ST pakilimo ŪMI ir neturinčiuosius ži-nomo infekcinio židinio ar IŠL. Lietuvoje miRNR biožymenų raiška anksčiau nebuvo tirta infekcinių ligų, ūminio koronarinio sindromo (ŪKS) metu. Rokas Navickas su bendraautoriais 2016m. publikavo straipsnį [22], kuriame apžvelgti diagnostinį ir prognozinį potencialą turintys miRNR biožymenys, sergant ateroskleroze, širdies kraujagyslių ligomis. Yra būtini tyrimai, kurie padėtų įvertinti naujų molekulinių žymenų reikšmę ir klinikinį pritaikomumą kasdienėje praktikoje. Turint patikimus ir informatyvius paciento būklės prognozavimo metodus galima būtų laiku imtis priemonių, apsaugančių pa-cientą nuo gyvybei pavojingų komplikacijų. Kadangi miRNR reguliuoja baltymų sintezę, manoma, kad miRNR turi ne tik diagnostinį ar prognozinį potencialą, bet gali būti efektyvūs ir moduliuojant tikslinę terapiją [23]. Šiuo metu tiriamos miRNR raiškos kontrolės terapinės galimybės [24].
14
2. LITERATŪROS APŽVALGA
2.1. Infekcinio uždegimo keliami iššūkiai
Pacientų, sergančių infekcine liga, mirties riziką didina ne visada greitas infekcinio proceso atpažinimas, diferencijavimas nuo kitų ligų, kurių metu gali kisti uždegiminių rodiklių rezultatai. Viena iš dažniausių ir pavojin-giausių ligų, reikalaujančių urgentinio chirurginio gydymo, yra peritonitas. Tai visos arba dalies pilvaplėvės uždegimas, kuris dažniausiai įvyksta dėl virškinamojo trakto perforacijos, traumos, jatrogeninės komplikacijos ar pankreatito. Dažniausios perforacijų lokalizacijos yra skrandžio, dvylika-pirštės žarnos opose, kirmėlinėse ataugoje, tulžies pūslėje ar divertikuluose [25]. Dažniausi peritonito sukėlėjai, įvykus perforacijai, yra gram-neigiamos (pvz.: Escherichia coli) bakterijos (apie 40 proc. atvejų), jos daug dažniau būna ir septinio šoko sukėlėjomis (iki 60 proc. atvejų), lyginant su gry-belinėmis ar gram-teigiamomis bakterijomis (apie 5–10 proc. atvejų) [26]. Pilvaplėvės infekcija dažnai siejama su sunkia ligos eiga, dideliu mirštamu-mu, nepageidaujamomis pasekmėmis ir yra antra dažniausia sepsio priežastis tarp pacientų ITS [25]. Šių pacientų išeitis dažnai blogina ir nuo pačių ligonių priklausantys veiksniai, tokie kaip vyresnis amžius, gretutinių ligų kiekis, prasta fizinė būklė. Ypatingai mirštamumo riziką didina hospitalinės kilmės infekcijos dėl mikroorganizmų, atsparių daugeliui antibiotikų [27]. Abdomi-nalinės infekcijos atveju, židinio sanacija atliekama skubiai, neretai su in-fekcijos sąlygotais homeostazės pakitimais.
Ligonio hemodinamikos stabilumo išsaugojimas, audinių ir organų adek-vačios perfuzijos išsaugojimas gali tapti iššūkiu operacinės medikų koman-dai. Medicininėje literatūroje galima rasti gairių [9], apžvelgiančių septinių pacientų gydymą ITS, vidaus ligų skyriuose, tačiau nėra pakankamai ana-lizuojama anesteziologinė taktika šių pacientų gydyme operacinėje [28]. Aiš-kių gairių bei rekomendacijų trūkumas mokslinėje literatūroje priverčia rizi-kuoti medikų komandas septinių pacientų, operuojamų skubos tvarka, išei-timis.
Remiantis 2016 m. atnaujintu apibrėžimu, sepsis įvardijamas kaip gyvybei pavojingas organų veiklos sutrikimas, sukeltas neadekvataus organizmo atsako į infekciją [29]. Vadovaujantis atnaujintomis gairėmis, sepsio diagno-zės patvirtinimui būtinas objektyvus septinio proceso sukeltas organų dis-funkcijos įrodymas, todėl buvo pasiūlyta naudoti SOFA įverčių skalė [29]. Šios skalės įverčiai turėtų būti ≥ 2 balais aukštesni nei prieš susergant sepsiu. Vienas iš reikšmingiausių atnaujintų apibrėžimų pakitimų tai, kad sepsio diagnostikoje nebeįtraukti sisteminio uždegiminio atsako sindromo (SUAS)
15
kriterijai. SUAS apibūdinanamas kaip uždegiminio proceso apimta orga-nizmo būklė, kuriai apibūdinti naudojami toliau minimi kriterijai. Iki 2016 m. sepsis buvo diagnozuojamas nustačius ≥ 2 SUAS kriterijus ir įtarus ar pa-tvirtinus infekciją [30].Pagrindiniams SUAS kriterijams priklauso [30]:
• kvėpavimo dažnis (KD) ≥ 20 k/min arba PaCO2 < 32 mm Hg; • širdies susitraukimų dažnis (ŠSD) ≥ 90 k/min;
• šerdinė kūno temperatūra ≤ 36,0 °C arba ≥ 38 °C;
• leukocitų koncentracija kraujyje ≥ 12 × 109/l arba ≤ 4 × 109/l.
Akivaizdu, kad šio sindromo kriterijai tiesiogiai neatspindi pagrindinių pa-togeninių fazių, kurios yra kritinės būklės formavimosi pagrindas. Atliktuose tyrimuose matoma, kad SUAS kriterijai yra jautrūs, bet mažai specifiški sepsio diagnostikoje [26, 31]. Ši aplinkybė dažnai nulemia apsunkintą sepsio diferencinę diagnostiką, kuriai gali daryti įtaką gydytojo individualus po-žiūris, žinios bei įgūdžiai. Pastebėta, kad centrinės nervų sistemos (CNS) pa-žeidimai dažniau formuojasi ir dauginė organų disfunkcija greičiau progre-suoja, esant neinfekcinės kilmės SUA [32].
Dabartinėse sepsio gydymo gairėse rekomenduojama ankstyva ir racionali antibiotikoterapija, kartu skiriant adekvačią skysčių terapiją, nepamirštant hemodinamikos stabilizavimo [9]. Buvo manoma, kad į tikslą nukreipta skys-čių skyrimo terapija (angl. Goal directed fluid therapy, GDFT) per pirmas 6 val. po hospitalizacijos gali sumažinti mirštamumą, tačiau ši taktika susi-laukė kritikos dėl riboto pritaikymo [9]. 2018m. sepsio gydymo gairės buvo dar kartą peržiūrėtos ir ypatingas dėmesys atkreiptas į pagalbos teikimo pradžią, atpažinus septinę būklę. Pabrėžiama pirmosios pagalbos teikimo valandos svarba. Per šį laiką ypač rekomenduojama paimti mėginį kraujo pasėliui, pradėti plataus spektro antibiotikoterapiją bei skirti 30 ml/kg kris-taloidų infuziją [33]. Nepaisant šių pastangų mirštamumas nuo sepsio išlieka didelis [34]. Šis faktas pabrėžia būtinybę geriau stratifikuoti sunkios būklės pacientus, siekiant identifikuoti ligonius, turinčius didelę mirties tikimybę. Šiame kontekste kraujo biožymenys ir ligonių būklės įvertinimo skaičiuoklės ankstyvoje sepsio stadijoje gali būti išskirtinės klinikinės reikšmės. Tikima, kad tai pagreitintų sepsio diagnozavimą ir padidintų ligonio galimybes išgyventi. Iki 2019 m. yra pasiūlyta daugiau nei 170 skirtingų biožymenų sepsio diagnostikai bei diferencijavimui. Tačiau šiuo metu žinomų bio-žymenų, įskaitant C-reaktyvų baltymą (CRB), prokalcitoniną (PCT) ir inter-leukiną-6 (IL-6), specifiškumas ir jautrumas yra riboti [35].
16
2.2. Infekcijos sąlygotas imuninis atsakas
Galima išskirti du uždegiminės reakcijos lygius: lokalų, kai atsakas vyksta tik pažaidos židinyje [32], ir SUA – kai atsakas išplinta už pažaidos židinio, slopindamas agresyvių biofaktorių plitimą. SUA aktyvuoja neuroendokri-ninę, stresinę reakciją, skatina leukocitų migraciją į kraujotaką, intensyvina leukopoezę, kyla organizmo temperatūra, suaktyvėja imuninė sistema [36]. SUA gali formuotis ir kitų uždegiminių, bet ne infekcinių procesų metu, pvz., įvykus sunkiai traumai, nudegus didelį kūno plotą, esant hemoragijai, auto-imunininei ligai [37, 38].
Įvykus trauminiam ląstelių pažeidimui ar infekcijai patekus į organizmą, aktyvuojamas imuninis atsakas, paveikiant tuos pačius receptorius – akty-vatorius, todėl klinikinis SUA abejais atvejais būna labai panašus. Dirgiklis, pažeidžiantis ląstelę, sutrikdo intraląstelinio ir ekstraląstelinio matrikso funk-cijas, sužadina skirtingus uždegiminio atsako komponentus. Vieni svarbiau-sių komponentų yra molekulinės struktūros, susijusios su pažeidimu (angl. danger-associated molecular patterns, DAMPs), dar vadinamos aliarminais, kurie inicijuoja neinfekcinį uždegiminį atsaką, bei molekulinės struktūros, susijusios su patogenu (angl. pathogen-associated molecular patterns, PAMPs), inicijuojančios uždegiminį atsaką, esant infekciniam dirgikliui [39].
DAMPs baltymai vyrauja ląstelių branduoliuose bei ląsteliniame skystyje, vykstant audinių pažeidimui, nekrozei. Vieni geriausiai žinomų DAMPs yra terminio šoko baltymai, S100 molekulės, HMGB1 baltymai, adenozitrifos-fatas (ATP). PAMPs molekulinės struktūros yra patogenų sandaros bei meta-bolizmo elementai:egzotoksinai,endotoksinai, flagelinas. Vienos dažniausių abdominalinio sepsio sukėlėjų, gram-neigiamos bakterijos, inicijuoja abdo-minalinį sepsį išorinės membranos lipopolisacharidais (LPS), kurių lipidinė dalis veikia kaip endotoksinai. Gram-teigiamos bakterijos – ląstelės sienelėje esančia lipoteichine rūgštimi (LTA), išorinės plazminės membranos peptido-glikanais ar superantigenais, produkuojamais S. aureus ir S. pyogenes [40]. PAMPs bei DAMPS struktūros yra selektyviai atpažįstamos nespecifinės imuninės sistemos mechanizmų, kurie aktyvuoja SUA [41]. PAMPs ir DAMPs signalų intensyvumas sąlygoja prouždegiminių citokinų gamybą.
Atsakas į infekciją dažniausiai prasideda makrofagams pradedant sąvei-kauti su infekciją sukeliančių m/o komponentais. Šis procesas skatina užde-giminių citokinų (pvz., TNF-α, IL-1β), chemokinų, azoto oksido (NO) išsky-rimą. SUA metu vyksta papildomų uždegiminių (pvz., leukocitų) ir priešuž-degiminių mediatorių (pvz., IL-4, IL-10) gamyba bei įtraukimas [42]. Ste-bima pusiausvyra tarp uždegiminių ir priešuždegiminių mediatorių. Esant sepsiui, progresuoja disbalansas tarp mediatorių, vyksta uždegiminių citokinų
17
hiperprodukcija [43]. Daugėja laisvųjų deguonies ir azoto radikalų, arachi-dono rūgšties metabolitų, trombocitus aktyvuojančio faktoriaus, ląstelėse įsivyrauja deguonies deficitas, traumuojamas endotelis, glikokaliksas. Audi-nių faktorius (AF), taip pat žinomas kaip audiAudi-nių tromboplastinas ar CD142, yra vienas iš uždegiminio atsako komponentų, jungiasi su koaguliacijos baltymais, aktyvuoja krešėjimo kaskadą, formuojasi smulkiųjų kraujagyslių trombozės. Šio proceso pasekmėje pažeidžiamos makroorganizmo ląstelės, audiniai [44]. Mediatorių disreguliuacija progresuoja uždarame rate, sukelda-ma dauginį organų disfunkcijos sindromą (DODS), širdies funkcijos blogė-jimą ir makroorganizmo žūtį [43]. Net pašalinus priežastį, sukėlusią užde-gimą, pvz., nekrotizavusius audinius, uždegiminis procesas nenutrūksta, o chirurginė intervencija tampa nauju dirgikliu patofiziologiniams mechaniz-mams progresuoti [45].
2.3. Infekcinio proceso poveikis hemodinamikai
Pradinėje uždegiminės reakcijos stadijoje didėja neutrofilų migracija į už-degimo židinį, padidėja kraujagyslių endotelio pralaidumas ir intravaskulinio skysčio ekstravazacija. Taip pat mažėja periferinių kraujagyslių rezistentiš-kumas, dilatuoja arterijos ir arteriolės [111]. Ansktyvojoje (hiperdinaminėje) fazėje didėja širdies minutinis tūris (ŠMT). Vėliau mažėja periferinė per-fuzija, ryškėja intravaskulinė hipovolemija, hipotenzija. Septinei būklei pro-gresuojant uždegiminiai mediatoriai inicijuoja hiperkoaguliaciją, formuojasi smulkiųjų kapiliarų trombozė. Tai sukelia hipokesmiją bei distrubucinį šoką [108].
NO yra vienas pagrindinių širdies ir kraujagyslių sistemos reguliatorių sveikame organizme. Septinio šoko metu ženkliai didėjant jo kiekiui orga-nizme, progresuoja vazodilatacija ir sutrinka intarląstelinė kalcio homeostazė, kardiovaskuliniai refleksai, įsivyrauja kraujagyslių lygiųjų raumenų relak-sacija [112]. Oksidacinis stresas, manifestuojantis dėl laisvųjų deguonies ra-dikalų ir NO pertekliaus, ardo kraujagyslių endotelį, todėl dar labiau padidėja intravaskulinių skysčių perėjimas į intersticinį tarpą [113]. Viena reikšmin-giausių progresuojančio sepsio komplikacijų – širdies nepakankamumas, dažnai lemiantis neigiamas pacientų išeitis. Uždegiminiai mediatoriai skatina NO koncentracijos augimą. NO neigiamai veikia širdies kontraktiliškumą ir kamerų prisipildymą. Slopinamas kalcio jonų perėjimas iš sarkoplazminio tinklo į sarkoplazmą sistolės metu, šių jonų grįžimas diastolės fazėje, taip pat jungimasis su troponinu C bei minimalizuojamas jautrumas endogeniniams adrenerginiams ligandams [113]. Miokardo disfunkciją sąlygoja ir kiti veiksniai: prouždegiminiai mediatoriai tiesiogiai slopina širdies raumens
18
kontraktiliškumą, aktyvuoja vainikinių kraujagyslių endotelio ir kardiomio-citų adhezijos molekules, pastarosios jungiasi su neutrofilais, kurie infil-truojasi į kardiomiocitus ir sukelia kardiotoksinį poveikį [114, 115]. Širdies raumens energetinis badas prasideda dėl mitochondrijų funkcijų sutrikimo, susidarę oksidacinio streso apykaitos produktai sutrikdo pačių mitochondrijų funkcionalumą, sutrinka deguonies apykaita. Ląstelių sąstingis dėl mito-chondrijų disfunkcijos pastebėtas ir ŪMI metu [116]. Vienas iš labai svarbių miokardo depresijos mechanizmų yra ir β1-adrenerginių receptorių perdir-ginimas katecholaminais, kurių konc. išauga sepsio pradžioje dėl organizmo kompensacinio atsako [117]. Perdirginus β1-adrenerginius receptorius, kar-diomiocituose daugėja kalcio, vyksta apoptozė, progresuoja miokardo iše-mija, tachiaritmijos [118].
2.4. Gretutinių ligų įtaka infekcijos eigai
Neabejotinai svarbią įtaką infekciniams procesams turi gretutinės ligos ir amžiaus pakitimai. Mokslinėje litertūroje yra pastebėta, kad didėjant gre-tutinių ligų kiekiui, tikimybė patirti sepsį taip pat didėja [119, 120]. Plačiai aprašoma amžiaus įtaka sepsio eigai ir išeitims. JAV išnagrinėjus medici-ninius įrašus nuo 1979 iki 2002 m., nustatyta, kad vyresni negu 65m. amžiaus pacientai sudaro 64,9 proc. visų pacientų, hospitalizuotų dėl sepsio. Šios am-žiaus grupės žmonių rizika susirgti sepsiu yra 13,1 karto didesnė nei jaunesnių [121]. Defektyvi adaptacinė imuninė reakcija seniai laikoma imuninės funk-cijos sumažėjimo priežastimi senatvėje, tačiau pastarojo dešimtmečio tyrimai rodo, kad kalti yra ir daugybiniai amžiniai įgimtos imuninės sistemos ląstelių pokyčiai [122]. Vyresniame amžiuje tiek neutrofilai, tiek makrofagai turi su amžiumi susijusių funkcinių pokyčių, įskaitant sumažėjusį chemotaksį, fago-citozę, antibakterinę apsaugą ir reaktyviųjų deguonies formų generavimą [123]. Mirštamumas nuo sepsio vyresniame amžiuje tampa 2,6 karto dažnes-nis. Amžius yra ir nepriklausomas mirštamumo nuo sepsio prediktorius [124]. Be abejo, vyresni pacientai pasižymi didesniu gretutinių ligų kiekiu, nu-statyta, kad pusė išgyvenusių sepsį vyresnio amžiaus pacientų miršta per artimiausius dvejus metus [125]. Atliktose studijose pastebėta, kad moterų sergamumas septinėmis ligomis yra toks pat kaip vyrų arba mažesnis [126].
Esami tyrimai rodo, kad cukrinis diabetas yra infekcijos rizikos ir sepsio veiksnys [127]. Hiperglikemija siejama su žalingu poveikiu granulocitų chemotaksiui, fagocitozei [128]. Taip pat yra pastebėta, kad cukrinis diabetas ir lėtinė inkstų liga yra susiję su didesne mirštamumu rizika dėl sepsio [129], tačiau duomenų apie miRNR biožymenų raiškos ryšį su šiomis patologijomis sepsio metu yra labai mažai [130].
19
Ryšys tarp lėtinių kraujagyslių ligų ir sepsio sunkumo nebuvo aprašytas anksčiau, bet jis yra tikėtinas, atsižvelgiant į endotelio disfunkcijos vaidmenį sepsio patofiziologijoje [131]. Lėtinis uždegimas gali padidinti sepsio pro-gresavimo riziką [132] ir gali nurodyti pacientus, linkusius į perdėtą arba sutrikusią reakciją, esant ūminei infekcijai.
Nors žalingas nutukimo poveikis sveikatai yra gerai ištirtas reiškinys, jo poveikis ūminėms ligoms atrodo prieštaringas. Anksčiau skelbtose publika-cijose galima apatikti „nutukimo paradoksą“, kai sunkių ūminių ligų metu viršsvorį turintys ar nutukę pacientai dažniau patirdavo palankias išeitis nei normalaus svorio pacientai [133, 134]. „BMC Anesthesiology“ žurnale publi-kuotoje aštuonių tyrimų metaanalizėje teigiama, kad sepsiu sergančių, virš-svorį turinčių, bet nenutukusių pacientų mirštamumas buvo mažesnis nei normalaus svorio pacientų [135]. Nutukimo paradokso fenomeną mėginama aiškinti keliais būdais. Pirma, padidėjęs svoris gali būti susijęs su didesniais medžiagų apykaitos ištekliais, o tai naudinga ūminių ligų metu, nes jos yra katabolinės. Antra, riebaliniai audiniai gali moduliuoti uždegiminį atsaką, išskirdami priešuždegiminius mediatorius, tokius kaip leptinas [136] ir tirpų TNF [137]. Be to, padidėjęs renino-angiotenzino sistemos aktyvumas gali teigiamai veikti hemodinaminius procesus sepsio metu [138].
Rūkymas ir rūkymo nutraukimas netolimoje praeityje taip pat yra susiję su padidėjusia sepsio rizika, o alkoholio vartojimo įtaka sepsio rizikai yra prieštaringa, nepaisant nustatyto alkoholio poveikio imuninei sistemai [120]. Svarbu įvertinti ir gretutinių ligų skaičių. Nustatytas tiesioginis ryšys tarp gretutinių ligų skaičiaus ir sepsio sunkumo, o pacientui turint daugiau nei 4 gretutines ligas, mirštamumo rizika ženkliai didėja[139]. Gretutinių ligų išaiškinimas ir įvertinimas sepsio metu leidžia kokybiškiau prognozuoti pa-ciento išeitis, skirti racionalesnį gydymą [132].
2.5. MiRNR
MiRNR yra trumpa (18-25 nukleotidų), viengrandė RNR molekulė. MiRNR dalyvauja genų raiškos reguliacijoje, ląstelių metaboliniuose, tarpu-savio sąveikos, dalijimosi, diferenciacijos ir kituose procesuose, įtakoja iki 60 proc. baltymus koduojančių genų [46]. MiRNR transkribuojamas nuo deoksirinonukleorūgšties (DNR) ląstelės branduolyje, citoplazmoje miRNR seka jungiasi prie informacinės RNR (iRNR), kuri perneša informaciją apie baltymą. MiRNR gali slopinti iRNR transliaciją arba aktyvinti jos degradaciją [47], taip paveikdama baltymų sintezę ribosomose. MiRNR molekulės gali jungtis prie kelių šimtų skirtingų iRNR. Potencialių susijungimo vietų kiekis, komplementarumas tarp besijungiančių sekų ir iRNR prieinamumas lemia
20
miRNR sukeliamą poveikį [48]: iRNR transliacijos inchibiciją, degradaciją (2.5.1 pav.).
2.5.1 pav. MiRNR veikimas (adaptuota pagal [49–53])
1. Transkripcijos metu branduolyje, katalizuojant fermentui RNR polimeraze II ir III, nuo
DNR grandinės nurašoma pirminė miRNR seka. Viena pirminė miRNR struktūra gali saugoti nuo vieno iki šešių būsimų miRNR fragmentų [50]. 2. Stuburinių organizmų ląstelių
branduoliuose pirminę miRNR atpažįsta branduolio baltymas DiGeorge Syndrome Critical Region 8 (DGCR8) kartu su RNR kerpančiu baltymu Drosha. Iš pirminės miRNR iškerpamos prekursinės miRNR sekos [51]. 3. Baltymas Eksportin-5 atpažįsta prekursorines miRNR
molekules ir inicijuoja perkėlimą į citoplazmą. Perkėlimui reikalinga energija gaunama iš nukletidų guanozin-5'-trifosfatų (GTP), veikiant GTP surišančiam baltymui Ran [52]. 4.
Citoplazmoje prekursorinė miRNR perkerpama fermentu Dicer, suformuojamos dvi 22 nukleotidų ilgio miRNR grandinės: miRNR ir miRNR*. Tik viena iš šių grandinių vėles-niuose etapuose išlieka funkcionali [53]. 5. Mažiau energijos stabilioje būsenoje turinti
miRNR grandinė, žymima ženklu *, degraduoja. 6. Antroji subrendusi miRNR grandinė
pa-tenka į ribonuokleobaltyminio komplekso (angl. RNA-induced silencing complex (RISC)) sudėtį, miRNR grandinė geba atpažinti iRNR taikinio seką ir, dalyvaujant Ago baltymams, su juo jungtis. 7. Jeigu miRNR seka visiškai komplimentari iRNR sekai, Ago2 baltymas
perkerpa iRNR ir sukelia jos degradaciją. Jeigu visiško komplimentarumo nėra, slopinamas transliacijos (iRNR nukleotidų sekos vertimas į baltymo aminorūgščių seką) procesas [50].
MiRNR molekulės gali būti perkeliamos į organizmo kraujotaką ir išlikti stabilios būklės [54]. Ši savybė egzistuoja, nes miRNR molekulės yra perke-liamos už ląstelės ribų per mikrovezikules ir egzosomas, naudojant ATP
21
energiją, aktyviai sekretuojant junginius su baltymais [55]. Kartais miRNR molekulės gali patekti į kraujotaką pasyviuoju būdu po audinių pažeidimo ar ląstelių apoptozės [55]. Sepsio metu nėra aišku, iš kurių ląstelių ir kokiu būdu į kraujotaką patenka daugiausiai miRNR molekulių. Į kraujotaką patekusios miRNR sekos formuoja kompleksus su specifiniais RNR jungiančiais bal-tymais, tokiais kaip AGO2 [56]. Kraujyje miRNR sekos gali cirkuliuoti eks-traląstelinėse vezikulėse, pvz.: apoptoziniuose kūneliuose ir egzosomose [57]. Cirkuliuojančios miRNR vezikulių viduje aktyviai vykdo tarpląstelinės informacijos perdavimą.
Šiuo metu žinoma bent 2000 skirtingų miRNR molekulių, kurios yra įtrauktos į specifines organizmo būkles [58]. Svarbu tai, kad miRNR daly-vauja tiek natūraliuose fiziologiniuose organizmo procesuose, tiek ir jo pa-žeidimo, ligų metu. Plačiai tiriama miRNR molekulių reikšmė onkologinių susirgimų metu [59]. Šios molekulės aktyviai veikia didžiojoje dalyje biolo-ginių procesų.
Anksčiau atlikti tyrimai rodo, kad kraujo serumo miRNR molekulės yra pakankamai stabilios, jų raiška mažai svyruoja sveikų individų kraujo seru-me, jų nepaveikia ribonukleazė. Tiriant tapačiomis sąlygomis, šios molekulės silpnai paveikios temperatūrinių svyravimų, pH kitimo [60].Akivaizdu, kad kraujo, prakaito, šlapimo ir motinos pieno ekstraląstelinių miRNR molekulių raiška gali būti objektyviai įvertinama klinikinėje aplinkoje, skirtingai nei laiko reikalaujančios mikrobinės kultūros.
Cirkuliuojančios miRNR molekulės gali būti tiriamos skirtingose organiz-mo terpėse, populiariausios yra tos, iš kurių galima paimti mėginį neinva-zyviu arba mažai invaneinva-zyviu būdu [61]. MiRNR molekulių raiškos pokytis labiausiai ištirtas nefrakcionuoto kraujo, serumo ir plazmos terpėse [62, 63]. Šiuo metu nėra atlikta pakankamai išsamių tyrimų, kurie leistų objektyviai išrinkti tinkamiausias terpes miRNR analizėms skirtingais atvejais. Nefrak-cionuotas kraujas tinkamas ištyrimui, kai nenumatomas mėginių saugojimas tolimesniems analizės etapams. Todėl daug populiaresnės yra kraujo serumo ir plazmos terpės. Kraujo serumo arba plazmos terpės tinkamos ilgalaikiam mėginių saugojimui. MiRNR molekulės kraujo plazmoje ir serume gali būti atsparios ekstremalioms sąlygoms, tokioms kaip uždelstas saugojimas, pasi-kartojantys užšaldymo – atitirpinimo ciklai, pH ar temperatūriniai svyravimai [64]. Taip pat šiose terpėse stebimas mažesnis rezultatų heterogeniškumas tarp mėginių [65]. Renkantis tarp kraujo plazmos ir serumo terpių, įvertinta, kad miRNR raiškos tikslumui kraujo plazmos mėginiuose gali turėti įtakos užterštumas trombocitais, o serumo mėginiuose dažniausiai aptinkama di-desnė miRNR molekulių koncentracija negu plazmoje [66]. Kita vertus, koaguliacijos ypatumai kartais gali lemti serumo mėginių miRNR raiškos
22
skirtumus [67]. Abiem atvejais svarbu atlikti tiriamosios medžiagos mėginių vertinimą dėl hemolizės, kuri gali iškreipti biožymenų raišką.
2.6. Infekcinis uždegimas ir miRNR
MiR-146a biožymuo buvo vienas pirmųjų iš miRNR, kuris įtartas daly-vavimu uždegiminiuose procesuose sepsio metu. Ankstesniuose tyrimuose yra įrodyta, kad miR-146a dalyvuja imuniniame atsake [68], sepsio patofizio-loginiuose mechanizmuose [54, 69]. In vivo pelių tyrime, analizuojant peles su panaikinta chromosomos dalimi, atsakinga už miR-146a molekulių trans-kripciją, rastas aktyvesnis uždegiminių citokinų (TNFα, IL-6, IL-1β) atsakas į LPS injekcijas [70]. Kituose tyrimuose stebimas ir mieloproliferacinis sind-romas, lėtinis uždegimas, kokybiškų hemopoetinių ląstelių sumažėjimas [71]. Taip pat in vitro yra nustatyta, kad šis biožymuo dalyvauja formuojant atsaką į LPS ataką ir žmogaus monocituose, o jo raiškos indukcija priklauso nuo branduolio transkripcijos veiksnio kapa B (NF-kB) [13]. Manoma, kad miR-146a molekulės gali veikti kaip įgimto imuninio atsako grįžtamojo ryšio re-guliatorės, veikdamos kelis baltymus: TRAF6 (su TNF receptoriais susijęs 6 faktorius), IRAK1 (su IL-1 receptoriumi susijusi kinazė 1), kurie yra svar-būs priešuždegiminiam signalizavimui ir IRAK2 (su IL-1 receptoriumi susi-jusi kinazė 2) [70, 72]. Žinoma, kad šis biožymuo dalyvauja esant ir kitoms ligoms, kurių metu aktyvi uždegiminė sistema, labiausiai aptariamos auto-imiuninės, onkologinės, sąnarių pažaidos ligos, aterosklerozė, nefropatija [68, 73].
Yra nustatytas teigiamas ryšys tarp miR-23a žymens raiškos augimo ir IL-6 arba TNF-α verčių didėjimo, pabrėžiant miR‑23a žymens uždegiminį vaidmenį. Įtariama, kad miR-23a molekulės yra įtrauktos į atsaką, esant bakterinei infekcijai ir progresuojant sepsiui. Sepsio pradinėse stadijose ste-bimas autofagijos didėjimas [74],kurią inicijuoja bakterijų LPS, prisijung-dami prie TLR2 ir 4 (angl. toll-like receptor) receptorių [75]. Viename at-liktame tyrime nurodoma, kad miR-23a molekulės gali slopinti makrofagų autofaginį aktyvumą [14]. Manoma, kad miR-23a gali selektyviai jungtis prie baltymo ATG12 ir tokiu būdu paveikti autofagiją [76]. MiR-23a biožymenų raiškos sumažėjimas, esant LPS atakai, gali būti apsauginiu organizmo me-chanizmu, susijusiu su uždegiminiu veiksnių reguliavimu, nutraukiant aud-ringą uždegiminį atsaką. Taip pat pastebėta, kad veikiant makrofagus LPS in vitro ir slopinant miR-23a molekulių raišką, makrofagų gyvybingumas būna didesnis negu neslopinant miR-23a [14].
Manoma, kad miR-30 sekos dalyvauja imuniniame atsake ir su juo susi-jusiose ligose. Šių biožymenų dalyvavimas uždegiminiuose procesuose nėra
23
detaliai tirtas. Pastebėtas šio biožymens raiškos pasikeitimas sepsio ir kitų infekcinių susirgimų metu [11, 15]. Tiriant žmonių įgimto imuniteto sąveiką su A. butzleri sukeliama infekcija, nustatyta miR-30d molekulių įtaka endo-citozei, signaliniams keliams [15]. Viename tyrime teigiama, kad miR-30 molekulės slopina šeimininkų ląstelių gebėjimą atsispirti M. tuberculosis bakterijų infekcijai [77].
2.7. MIRNR ir širdies raumens bei kraujagyslių pažaida
MiRNR molekulės atlieka aktyvų vaidmenį širdies ir kraujagyslių ligų patofiziologijoje [78]. Jos yra įtrauktos ir į ūminio išeminio širdies raumens pažeidimo mechanizmą [79]. Susijusios su širdies raumens išeminiu – re-perfuziniu pažeidimu bei raumens ląstelių apoptoze [16]. Manoma, kad cirku-liuojančių kraujyje miRNR molekulių raiškų nustatymas gali būti naudingas ŪMI įvertinimui, diagnozavimui, gydymo taktikos parinkimui [80].
Tyrėjai yra nustatę, kad miR-30d molekulės gali būti įtrauktos į SUA ir neovaskuliarizacijos procesus po ŪMI [81]. Žinoma, kad miR-23 grupės molekulės yra svarbios angiogenezėje [82]. Taip pat manoma, kad miR-23a gali atspindėti IŠL progresavimą [83] ir yra patvirtintas miR-23a raiškos pokyčio ryšys su širdies raumens hipertrofija [84]. Anksčiau buvo nustatyta, kad miR-146a pakitusi raiška paveikia pelių su ŪMI širdies funkciją ir apoptozę [85]. MiR-146a vadinamas su ląsteliniu stresu susijusiu biožyme-niu. Manoma, kad jis padeda reguliuoti įgimtą imuninį atsaką bei uždegiminį procesą, provokuojamą nekrozavusių kardiomiocitų [86].
Kaip minėta anksčiau, yra sukaupta įrodymų, kad miR-30d-5p, miR-23a-3p, miR-146a-5 molekulės yra svarbios širdies ir kraujagyslių ligų patofiziologiniuose mechanizmuose. Vis dėto šių molekulių raiškos pokyčiai nebuvo pakankamai ištirti žmonių ŪMI atvejais.
2.8. MiRNR pritaikymas imunomoduliacijoje ir parinkimo tyrimui galimybės
MiRNR molekulės gali būti potencialūs terapiniai taikiniai. Būtina pa-stebėti, kad iki 2019m. jau yra rasta miRNR molekulių, galinčių sukelti ligą. Pvz.: padidėjusi miR-17-92 klasterio raiška stimuliuoja limfogenezę ir ska-tina limfoproliferacinių ligų atsiradimą [87]. Remiantis šiuo metu turimais duomenimis, galima teigti, kad nėra miRNR molekulių, kurios dalyvautų tik imuninės sistemos mechanizmuose. Identifikacija specifinių biologinių pro-cesų, kurie priklausytų nuo konkrečios, paveikiamos miRNR, leistų mo-duliuoti tik vieno tipo ląsteles ar procesus. Kadangi manoma, kad miRNR
24
raiškos moduliacija gali leisti kontroliuoti fiziologinius mechanizmus, ku-riuose dalyvauja miRNR ar jų taikiniai, vis plačiau mėginama taikyti eks-perimentinį miRNR molekulių slopinimą [88]. Navikai gali tapti priklausomi nuo onkologinį procesą palaikančios miRNR. Pastebėta, kad in vivo pato-geninės miRNR slopinimas lemia greitą naviko susitraukimą [89]. Proveržis, paveikiant miRNR onkologinių procesų metu, leidžia tikėtis sėkmės, pritai-kant patirtį uždegiminių ligų gydyme. Viename tyrime su pelėmis, užslopinus miR-195, kurios raiška didėdavo kepenyse ir plaučiuose, pelių išgyvena-mumas didėdavo [90]. Taip pat pastebėta, kad gyvūnuose miRNR molekulių deficitas dažnai fenotipiškai nepasireiškia [91]. Cheminių medžiagų, kurios gebėtų paveikti miRNR molekules, dalyvaujančias imuninėje sistemoje, sin-tetinimas yra sudėtingas, daug iššūkių keliantis procesas, tačiau inovatyvūs, nauji metodai leidžia tikėtis progreso [92]. Tikima, kad artimiausias ženklus proveržis medicinoje bus medikamentų, veikiančių į miRNR molekules-tai-kinius, sukūrimas [93].
Mokslinėje literatūroje yra duomenų, kad pakitusios miR-30d, miR-23a ir miR-146a-5p molekulių raiškos gali būti naudingos identifikuojant infekci-nius, aseptinius SUA procesus, tokius kaip ŪMI [11]. Nepaisant anksčiau ras-tų šių biožymenų tiesioginių bei netiesioginių sąsajų su SUA, sepsiu, ŪKS, nėra pakankamai informacijos, galinčios padėti įvertinti šių žymenų pritaiky-mą klinikinėje praktikoje. Mokslininkų kaupiama informaciją apie miRNR sekų dalyvavimą patofiziologiniuose procesuose ateityje gali padėti spręsti klinikinės klasifikacijos, atsako į skiriamą gydymą, ligos moduliavimo prob-lemas [94]. Todėl nuspręsta ištirti kraujo serumo cirkuliuojančių miR-30d-5p, miR-23a-3p ir miR-146a-5p molekulių raiškos pokyčius ligoniams, sergan-tiems abdominaliniu sepsiu ir ST pakilimo ŪMI, referentiniams pacientams bei visapusiškai įvertinti diagnostines bei prognozines šių molekulių savybes dėl išliekančio poreikio tobulinti diferencinę diagnostiką, gydymo taktiką pacientams su SUA.
2.9. Biocheminių rodiklių pokyčiai sisteminio uždegimo metu
Yra atlikta tyrimų, kuriais mėginta nustatyti tradicinių biožymenų, ro-diklių, vertę prognozuojant septinių pacientų išeitis [95, 96]. Įrodyta, kad CRB koncentracijos sepsio diagnozavimo dieną turi silpną prognozinę vertę [97]. PCT vertės, APACHE II ir SOFA balai geriau prognozuoja nepalankias išeitis, lyginant su CRB. Vis dėlto nei vieno iš jų prognozinis tikslumas ne-buvo labai geras [98]. Biomarkerių, plačiai naudojamų klinikinėje praktikoje, jautrumas ir specifiškumas nėra pakankamai dideli, kad būtų galima būtų ko-kybiškai numatyti septinių pacientų mirštamumo riziką.
25
CRB, PCT yra tradiciniai žymenys, taikomi infekcinių ligų diagnostikoje [99]. Vis dėlto CRB yra mažai specifiškas, o šio rodiklio vertės dydis ne visada atspindi SUA mastą [100]. Anksčiau buvo manoma, kad didelės PCT reikšmės infekcinės ligos pradžioje gali būti susijusios su nepalankiomis išei-timis. Dabar įsivyrauja nuomonė, kad vertėms gali turėti įtakos ligos sukelėjo tipas, o ne paciento būklės sunkumas [101].
Auksiniu standartu ŪMI diagnostikoje laikomi miokardo troponinas I (cTnI) bei T (cTnT) nėra visiškai specifiški miokardo pažeidimui [102]. Troponino koncentracijos kilimo priežastimis gali būti ir lėtinis inkstų nepa-kankamumas, širdies nepanepa-kankamumas, prieširdžių virpėjimas, subarach-noidinis kraujavimas ar plaučių embolija [103]. Nuo 2009 m. vis plačiau tiriamos miRNR molekulės kaip kandidatės ŪMI diagnostikoje. 2014 m. jau buvo rasta daugiau nei 30 potencialių miRNR biožymenų [104], o miR-132, miR-140-3p ir miR-210 geba tiksliai prognozuoti mirtį dėl širdies ir krau-jagyslių ligų [105].
CRB konc. padidėjimas stebimas ne tik infekcinių ligų metu, tačiau ir aseptinių patofiziologinių procesų, tokių kaip ŪKS, metu [106]. Perkutaninės koronarinės intervencijos metu paveikiamas kraujagyslių endotelis, šis dir-giklispapildomai skatina CRB koncentracijos kraujyje didėjimą [107]. Taip pat pastebėtas ryšys tarp uždegiminio proceso aktyvumo, padidėjusios CRB koncentracijos ŪMI ir dažnesnių restenozių metu [108]. Kartais padidėjusi CRB koncentracija ŪKS metu yra vertinama kaip infekcinio proceso pa-tvirtinimas ir pacientui empiriškai pradedama taikyti antibiotikoterapija. Todėl uždegiminės reakcijos etiologinio veiksnio atpažinimas turėtų būti greitas, ypač sunkios būklės pacientams.
Įprastai klinikinėje praktikoje tiriami uždegimo rodikliai nėra pakankamai informatyvūs SUA diferencinėje diagnostikoje, todėl svarbi naujų žymenų paieška. Sepsio gydymo opinijos lyderių teigimu, artimiausiu metu nebus rastas vienas, itin specifiškas ir jautrus biožymuo, tinkantis didžiajai daliai, net ir skirtingos kilmės, sepsio atvejų [26]. Todėl, natūralu, kad didelis dė-mesys skiriamas biožymenų kombinacijoms, sistematizuotam laboratorinių testų gretinimui su klinikiniais duomenimis, integruotų vertinimo skalių kūrimui [26]. Naujausi tyrimai siūlo atkreipti dėmesį į miRNR analizę [109]. Manoma, kad išsiaiškinus šių molekulių raiškas, pokytį dinamikoje, tikslinius taikinius, miRNR galima būtų naudot ligų diagnostikoje, prognozėje ar gy-dyme [110].
26
3. TYRIMO METODIKA
3.1. Tyrimo organizavimas
Tyrimui atlikti gautas Kauno regioninio biomedicininių tyrimų etikos komiteto leidimas Nr. BE-2-19 (1priedas). Valstybinė duomenų apsaugos inspekcija išdavė leidimą Nr. 2R-5671 atlikti asmens duomenų tvarkymą mokslinio tyrimo tikslu (2 priedas). Klinikinis tyrimas užregistruotas https://anzctr.org.au, registracijos numeris – ACTRN12618001176257. 2017–2019 m. atliktas monocentrinis prospektinis tyrimas, kuris neturėjo įtakos pacientų gydymo taktikai. Tyrimo metu taikyti standartizuoti LSMUL KK ligų gydymo ir diagnostikos metodai.
3.2. Tiriamųjų kontingentas
Tyrime dalyvauti pakviesti įtraukimo kriterijus atitinkantys (3.2.1lentelė), LSMU KK chirurgijos ar intensyvios terapijos skyriuose gydyti asmenys, kurie neturėjo atmetimo kriterijų (3.2.2lentelė).
3.2.1 lentelė. Įtraukimo kriterijai • Vyresni negu 18 m. amžiaus pacientai.
• Sutikimas dalyvauti tyrime, pasirašant Informuoto asmens sutikimo formą. • Esant vienai iš būklių:
- numatoma atlikti skubią chirurginę intervenciją dėl peritonito,
- skubus ST pakilimo ŪMI gydymas, taikant vainikinių kraujagyslių angioplastiką, - numatomaplaninė, nedidelės apimties chirurginė intervencija, pacientas neserga
IŠL, neturis infekcinio židinio. 3.2.2 lentelė. Neįtraukimo kriterijai
• Onkologinė liga
• Apžiūrint pacientą, sąmonės įvertis < 12 balų pagal Glazgo komos skalę (GKS) • Nėštumas
• Asmenys, dėl sveikatos būklės negalintys vertinti savo interesų
• Studentai, jeigu jų dalyvavimas biomedicininiame tyrime susijęs su studijomis • Kariai tikrosios karinės tarnybos metu
• Asmenys, tyrimo eigoje atsisakę tęsti dalyvavimą
• Įkalinimo įstaigose ar kitose laisvės atėmimo vietose esantys asmenys
• Sveikatos priežiūros įstaigų, kuriose atliekamas biomedicininis tyrimas, darbuotojai, pavaldūs tyrėjui
• Asmenys, patyrę ūminį galvos smegenų kraujotakos sutrikimą
• Pacientai, kuriems patyrus ŪMI, širdies vainikinių arterijų angiografijos metu nenustatytas susiaurėjimas
27
Tiriamieji, suskirstyti į 3 grupes:
1) I grupę sudarė pacientai, kuriems numatyta atlikti skubią chirurginę in-tervenciją dėl peritonito.
2) II grupę sudarė pacientai, gydyti dėl ŪMI.
3) III, referentinė, grupė. suformuota iš pacientų, anksčiau nesirgusių IŠL, neturinčių infekcinio židinio ir atvykusių planinei, nedidelės apimties chi-rurginei intervencijai.
Iš viso ištirti 128 asmenys. Asmenų įtraukimo į tyrimą schema pavaizduota 3.2.1 pav. Pagal atitikimo kriterijus visų pacientų galimybės patekti į sufor-muotas grupes buvo vienodos. Placebo, alternatyvūs gydymo metodai tyrime nebuvo taikomi.
Įtarus antrinį peritonitą, remiantis paciento nusiskundimais (abdomina-linės srities skausmas, pykinimas, karščiavimas), teigiamu pilvaplėvės dirgi-nimo mėginiu, radiologiniais (pilvo ultragarsinis, kompiuterinės tomografi-jos, rentgenologinis) tyrimais, biocheminias (CRB, leukocitų verčių padidė-jimas), galutinė antrinio peritonito diagnozė buvo patvirtinama gydytojo chi-rurgo urgentinės intervencijos metu.
ŪMI su ST segmento pakilimu buvo diagnozuotas nepriklausomų gydy-tojų, kurie nebuvo tiesiogiai įtraukti į šį tyrimą, remiantis tarptautiniais stan-dartais [111]. Visiems tiriamiems pacientams, sergantiems ST pakilimo ŪMI, atlikta vainikinių arterijų angiografija ir angioplastika. Šie pacientai gydyti vadovaujantis aktualiomis, galiojančiomis rekomendacijomis [112].
3.2.1 pav. Pacientų įtraukimo į tyrimą diagrama
Imtis pacientų, sutikusiųjų dalyvauti tyrime (n = 157) Pacientai, sergantys
peritonitu (n = 44) Pacientai, sergantys ŪMI (n = 77) Referentinė grupė (n = 36) Neatitiko įtraukimo kriterijų (n = 17)
Atitikę kriterijus, tačiau atsisakė dalyvauti (n = 8) Tiriamosios medžiagos hemolizė (n = 4)
Pacientai, sergantys peritonitu (n = 40)
Pacientai, kuriems atliktas molekulinių žymenų vertinimas (n = 128)
Pacientai, sergantys ŪMI
28
3.3. Asmenų pakvietimo dalyvauti tyrime procedūra
Pacientai stacionarizuoti LSMUL KK ir atitikę įtraukimo į tyrimą kri-terijus, aplankyti prieš numatomą infekcinio židinio sanacijos operaciją arba KITS po stacionarizavimo. Pacientams paaškinti tyrimo tikslai, principai, paprašyta sutikimo dalyvauti tyrime. Pacientai skatinti užduoti dominančius klausimus, po to pateikta Regioninio etikos komiteto aprobuota informuoto sutikimo forma kartu su tyrimo aprašymu ir palikta pakankamai laiko apsi-spręsti dėl dalyvavimo biomedicininiame tyrime, atsižvelgiant į aplinkybes, galinčias daryti įtaką sprendimo priėmimui (pvz., netikrumas, abejonės, patirties stoka, kultūriniai, kalbiniai aspektai ir kt.). Asmuo sutikęs dalyvauti tyrime, pasirašydavo Informuoto asmens sutikimo formą, nurodydavo vardą, pavardę, datą ir laiką. Informuoto asmens sutikimo dalyvauti biomedicini-niame tyrime formą pasirašydavo ir tyrėjas. Pacientui raštiškai sutikus da-lyvauti tyrime, jam buvo paliekamas vienas sutikimo formos egzempliorius, kitas paimtas saugoti.
Paciento asmeniniai duomenys buvo koduojami, kiekvienam tiriamajam priskiriant simbolių kombinaciją, kuri pažymima Informuoto asmens sutiki-mo forsutiki-moje ir viešai nebuvo skelbiama. Duomenys buvo registruojami į statistinio apdorojimo lent. skaitmeniniame formate, siekiant išvengti subjek-tyvaus vertinimo, atliekant statistinę analizę. Tiriamajam paaiškinta, kad jis turi teisę atsisakyti dalyvauti biomedicininiame tyrime, raštu atšaukdamas sutikimą dalyvauti tyrime, nenurodant priežasčių ir motyvų.
3.4. Duomenų rinkimas
Pacientų duomenys rinkti užpildant tyrimo protokolą (3 priedas). Detalus protokolo pildymas buvo paremtas toliau įvardytais (3.4.1 pav.) etapais.
29
30
3.4.1. Pradinis etapas
Paciento įtraukimo į tyrimą metu (prieš operaciją ar stacionarizavus pa-cientą KITS dėl ŪMI) atlikta:
• Registruoti tiriamųjų nusiskundimai, ligos anamnezė, patikslinant simp-tomų pradžią, trukmę.
• Surinkti duomenys apie gretutines ligas: širdies, kraujagyslių, kvėpa-vimo, odos, virškinimo sistemos, kepenų, tulžies latakų, šlapimą išski-riančių organų, kraujo, vidinės sekrecijos, nervų.
• Žymėta preliminari ar galutinė diagnozė.
• Vertinti klinikinio tyrimo duomenys, akcentuojant neinvazinį arterinį kraujo spaudimą (AKS), širdies susitraukimų dažnį (ŠSD), kūno pavir-šiaus temperatūrą (T°), kvėpavimo dažnį (KD), sąmonę pagal GKS. • Registruoti demografiniai duomenys: amžius, lytis, ūgis, svoris. • Pacientų ambulatoriškai vartoti medikamentiniai ir kiti preparatai. • Žalingi įpročiai: rūkymas, alkoholio vartojimas.
• Kiti svarbūs veiksniai, galintys turėti įtakos imuniniam atsakui.
• Laiko intervalas nuo simptomų pradžios iki periferinio veninio kraujo mėginio paėmimo.
• Įvertinta 12 derivacijų elektrokardiograma (EKG).
• Tiriamųjų, sergančių peritonitu, būklės sunkumas vertintas SOFA (3.4.1.1 lentelė) įvertinimų skale, naudojant skaičiuoklę (adresas: https:// www.mdcalc.com/sequential-organ-failure-assessment-sofa-score).
• Pacientų, sergančių ŪMI, būklių sunkumas įvertintas SOFA, APACHE II (3.4.1.2 lentelė), naudojant skaičiuoklę (adresas:https://www.mdca lc. com/apache-ii-score), GRACE (3.4.1.3 lentelė), naudojant skai-čiuoklę (adresas: https://www.mdcalc.com/grace-acs-risk-mortality-calculator) ir Killip (3.4.1.4 lentel4) skalių įvertinimais.
• Visiems tiriamiesiems paimti veninio kraujo mėginiai molekulinių bio-žymenų vertinimui: miR-30d-5, miR-146a-5p ir miR-23a-3p.
• Tiriamieji, kuriems numatyta chirurginė intervencija, vertinti ASA kla-se (3.4.1.5 lentelė).
• Vertinti tyrimai: BKT, CRB, K+ koncentracija, Na+ koncentracija,
gliu-kozės koncentracija, kreatinino koncentracija, šlapalo koncentracija, bilirubino koncentracija, DATL, INR, GFG.
• Vertintas pacientų, patyrusių ŪMI, cTnI, tyrimas, kuris atliktas anks-tyvame ligos periode.
31
Prieš pradedant anesteziją, pacientams, operuojamiems dėl peritonito, žymėtas per pirmas 3 val. nuo hospitalizacijos pradžios ir bendras ikiopera-ciniu laikotarpiu skirtų intraveninių skysčių tūris.
3.4.1.1 lentelė. Būklės vertinimo SOFA kriterijai [113]
Balai PaO2/FiO2
(mm Hg) Trombocitai (× 103/µl) (balai) GKS Bilirubinas (μmol/l) (mm Hg) VAS
Kreati-ninas (μmol/l) 0 > 400 >150 15 < 20 Nėra hipotenzijos < 106 +1 < 400 < 150 13–14 20–32 VAS < 70 106–168 +2 < 300 < 100 10–12 33–101 dop ≤ 5 arba dob 177–301 +3 < 200 +
DPV < 50 6–9 102–204 epi ≤ 0,1 arba dop > 5 arba nor ≤ 0,1
309–433 +4 < 100 +
DPV < 20 < 6 > 204 epi > 0,1 arba dop >15 arba nor > 0,1
> 442 GKS – Glasgow komų skalė; DPV – dirbtinė plaučių ventiliacija; dob – dobutaminas; dop – dopaminas; epi – epinefrinas; nor – noradrenalinas; SOFA – nuoseklaus organų nepakankamumo įvertinimo skalė (angl. The sequential organ failure assessment score); VAS – vidutinis arterinis spaudimas. Vazopresorių dozė skaičiuojama μg/kg/min.
32
3.4.1.2 lentelė. Būklės vertinimo APACHE II kriterijai [114]
Rodiklis +4 +3 +2 +1 0 +1 +2 +3 +4 Temperatūra °C ≥ 41 39–40,9 38,5– 38,9 38,4 36– 35,9 34– 32–33,9 30–31,9 29,9 ≤ VAS (mm Hg) ≥ 160 130– 159 110–129 70–109 50–69 ≤ 49 ŠSD ≥ 180 140– 179 110–139 70–109 55–69 40–54 ≤ 39 KD ≥ 50 35–49 25–34 12–24 10–11 6–9 < 5 FiO2 <0,5 arba neintubuotas ≥ 500 350–499 200–349 < 200 FiO2 ≥ 0,5 > 70 61–70 55–60 < 55 Arterinis pH ≥ 7,7 7,6– 7,69 7,5–7,59 7,33–7,49 7,25–7,32 7,15–7,24 7,15 < Na+ (mmol/l) ≥ 180 160– 179 155–159 150–154 130–149 120–129 110–119 ≤ 110 K+ (mmol/l) ≥ 7 6–6,9 5,5– 5,9 3,5–5,4 3–3,4 2,5–2,9 < 2,5 CREA (μmol/l), esant IFN balas dvigubinasi ≥ 3,5 2–3,4 1,5–1,9 0,6–1,4 <0,6 HCT (proc.) ≥ 60 50–59,9 46– 49,9 45,9 30– 20–29,9 < 20 LEU (× 109/l) ≥ 40 20–39,9 15– 19,9 3–14,9 1–2,9 1 15-GKS balas A. Balų suma. B. Amžius (metai): ≤ 44 = 0; 45–54 = 2; 55–64 = 3; 65–74 = 5; ≥ 75 = 6. C. Lėtinės ligos: 5 balai skiriami nustačius sutrikimus neoperuotiems arba skubos tvarka kitur operuotiems pacientams. 2 balai – pacientams po planinių operacijų Bendra balų suma: A + B + C
Lėtinės ligos
Kepenys Cirozė, patvirtinta biopsija, ir dokumentuota portinė hipertenzija; buvę
kraujavimai iš virškinimo trakto dėl portinės hipertenzijos; anksčiau buvęs kepenų nepakankamumas
Kardiovaskulinė
sistema IV funkcinė NYHA klasė
Kvėpavimas Lėtinės obstrukcinės, restrikcinės ar kraujagyslių ligos, sukeliančios dusulį;
Dokumentuota lėtinė hipoksija, hiperkapnija, antrinė policitemija, ūminė
plautinė hipertenzija (> 40 mm Hg), nuolatinis O2 poreikis
Inkstai Taikomos dializės
Imuninė sistema Pacientai, gydyti vaistais, kurie slopina atsparumą infekcijai
PaO2 – parcialinis deguonies slėgis arteriniame kraujyje; FiO2 – deguonies kiekis įkvepiamame ore;
Na – natris; K – kalis; ŪIFN – ūmus inkstų funkcijos nepakankamumas; GKS – Glasgo komų skalė;
CREA – kreatininas; HCT – hematokritas; LEU – leukocitai; K+ – kalis; Na+ – natris; NYHA – „New
York Heart Association“ – Niujorko širdies asociacija; AIDS – „Acquired Immune Deficiency Syndrome“ – įgytasis imuninio nepakankamumo sindromas.
33
3.4.1.3 lentelė. Būklės vertinimo GRACE kriterijai [115]
Amžius Balai (k/min) Balai ŠSD (mm Hg) Balai SKS (μmol/l) Balai CREA Killip klasė Balai
< 40 0 < 70 0 < 80 63 0-34 2 I 0 40–49 18 70–89 7 80–99 58 35–70 5 II 21 50–59 36 90–109 13 100–119 47 71–105 8 III 43 60–69 55 110–149 23 120–139 37 106–140 11 IV 64 70–79 73 150–199 36 140–159 26 141–176 14 ST de-viacija 30 ≥ 80 91 ≥ 200 46 160–199 11 177–353 23 ↑T ropo-ninai 15 ≥ 200 0 ≥ 354 31 Gaivi- nimas 43 Balų suma
ŠSD – širdies susitraukimų dažnis; SKS – sistolinis kraujo spaudimas; CREA – kreatininas; Killip – ūminio miokardo infarkto klasifikacija, GRACE – globalus ūmių koronarinių įvykių registras (angl. Global Registry of Acute Coronary Events).
3.4.1.4 lentelė. Ūminio miokardo infarkto klasifikacija pagal Killip [116]
Klasė
I Kairiojo skilvelio nepakankamumo požymių nėra II Karkalai, plautinė hipertenzija
III Plaučių edema IV Kardiogeninis šokas
3.4.1.5 lentelė. ASA – pacientų būklės klasifikacija, paremta Amerikos
anes-teziologų draugijos (angl. American Society of Anesthesiologists) rekomen-dacijomis [117]
ASA klasė Požymiai
1 klasė Lokalus procesas, dėl kurio operuojamas pacientas, nėra sisteminių sutrikimų
2 klasė Sergama nesunkia sistemine liga, neribojančia rutininio aktyvumo 3 klasė Sergama sunkia sistemine liga, kuri riboja fizinį aktyvumą 4 klasė Sergama sunkia sistemine liga, nuolat keliančia grėsmę gyvybei 5 klasė Nesitikima, kad pacientas išgyvens 24 val., nepriklausomai nuo to,
ar bus operuojamas
6 klasė Nustatyta biologinė mirtis, organai imami transplantacijai E Skubi operacija
34
3.4.2. Intraoperacinis etapas
Anestezijos metu registruota: • chirurginės intervencijos tipas, • peritonito priežastis,
• skirtų intraveninių skysčių tūris, pavadinimai, • kraujo netekimas,
• anestezijos trukmė,
• priklausomai nuo hemodinamikos, taikyta tęstinė standartinė ar išplės-tinė hemodinamikos stebėsena (AKS, ŠSD, SpO2, EKG, T°, centrinis
veninis spaudimas (CVS), tiesioginis AKS), laktatų konc., kraujo dujų tyrimai. Siekiant tikslaus AKS matavimo rezultato, buvo parenkama rekomenduojamo dydžio manžetė, uždengianti 2 : 3 žasto, o matavimas atliekamas kas 5 min.
• Registruotos hemodinamikos korekcijai skiriamos vazoaktyvios me-džiagos.
Bendroji nejautra buvo atliekama su trachėjos intubacija ir dirbtine venti-liacija, vadovaujantis klinikos protokolais. Anestezijos metu infuzinė tera-pija, vazoaktyvios medžiagos buvo skiriamos anesteziologo sprendimu, sie-kiant, kad VAS būtų ne mažesnis negu 65 mm Hg. Kraujo produktų trans-fuzija skirta taip pat vadovaujantis klinikos protoklais. Anestezijos eigos duo-menys registruoti anestezijos lape (156a forma; 4priedas).
3.4.3. Baigiamasis etapas
Papildomai registruotas prieš ir pooperacinis gydymas. Retrospektyviai, pasibaigus paciento hospitalizacijai, iš medicininės dokumentacijos regist-ruoti duomenys apie išgyvenamumą 30 d. laikotarpiu. Paciento hospitaliza-cijai trukus trumpiau nei 30 d., sveikimo eiga tikslinta skambučiu.
3.5. Tyrimo metodai
3.5.1. Imties tūrio įvertinimas
Remiantis anksčiau atliktų tyrimų duomenimis, kurių metu buvo tirti miR-30d-5p, miR-146a-5p ir miR-23a-3p biožymenys neinfekcinio ir in-fekcinio SUA metu, buvo apskaičiuotas imties tūris [11], kuris skaičiuotas pagal miR-30d-5p, miR-146a-5p ir miR-23a-3p molekulių ΔCt verčių
35
molekulių aptikimo slenkstinių verčių skirtumas tarp tiriamos molekulės ir kontrolinio transkripto Ct verčių vidurkio. Numatyta, kad imties tūris tenkintų
statistiškai reikšmingus skirtumus, esant reikšmingumo lygmeniui alfa 0,05, statistinei jėgai – 0,9. Apskaičiuota, kad būtina įtraukti bent 44 pacientus, lyginant patologinių būklių pacientų duomenis.
3.5.2. Kraujo mėginių paėmimas
Pacientų, sergančių ŪMI, kraujo mėginiai buvo surenkami per pirmąsias 24 val. nuo hospitalizavimo pradžios. Peritonitu sergančių ir referentinės grupių pacientų kraujo mėginai surinkti prieš anestetikų leidimo ir chirurginės intervencijos pradžią.Gydantys gydytojai ir slaugos personalas buvo infor-muoti apie vykstantį tyrimą. Įprastai tiriamųjų veninio kraujo mėginiai būdavo imami gydymo tikslais kateterizuojant ar punktuojant veną. Toliau biožymenys tirti remiantis 3.5.2.1 pav. Kraujas buvo surenkamas į mėgin-tuvėlius su tiksotropiniu geliu, kuris centrifuguojant juda link serumo ir krešulio sandūros pagal tankio gradientą ir sudaro nelaidų barjerą tarp serumo ir krešulio. Minimalus paimamo kraujo kiekis siekė 7 ml. Mėgintuvėliai buvo paliekami kambario temperatūroje (15–25 °C) nuo 30 min. iki 1 val., siekiant visiško kraujo sukrešėjimo. Kitame etape mėgintuvėliai buvo centrifuguo-jami siūbuojančių kaušelių rotoriumi 10 min 3000 s/min greičiu, 4 °C tempe-ratūroje. Buferiniame sluoksnyje gausu leukocitų ir trombocitų, kurių miRNR molekulės, patekusios į seruminę tiriamąją medžiagą, galėtų iškreipti raiškos rezultatus tolimesniuose etapuose. Kruopščiai, nepažeidžiant buferinio sluoksnio, seruminė mėginio dalis buvo atskiriama ir perkeliama į fermentų ribonukleazės bei deoksiribonuklezės neturinčius Eppendorf tipo mėgintu-vėlius. Mėgintuvėliai nedelsiant perkelti saugojimui –80 °C temperatūroje iki tolesnio RNR gryninimo pagal gamintojo protokolą.
3.5.2.1 pav. MiRNR biožymenų raiškos tyrimo etapai Veninio kraujo mėginys kPGR kDNR sintezė RNR išgryninimas Spektrofotometrinis vertinimas Mėginio saugojimas Duomenų analizė
