GENŲ, SUSIJUSIŲ SU REFRAKCIJOS SUTRIKIMAIS, POLIMORFIZMŲ IR HSA-MIR-328-3P RAIŠKOS SĄSAJOS SU TRUMPAREGYSTE

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

Edita Kuncevičienė

GENŲ, SUSIJUSIŲ SU REFRAKCIJOS

SUTRIKIMAIS, POLIMORFIZMŲ IR

HSA-MIR-328-3P RAIŠKOS SĄSAJOS

SU TRUMPAREGYSTE

Daktaro disertacija Gamtos mokslai, biologija (N 010)

Disertacija rengta 2014–2020 metais Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Biologinių sistemų ir genetinių tyrimų instituto Dr. K. Janušausko genetinių tyrimų laboratorijoje ir Neuromokslų instituto Oftalmologijos laboratorijoje.

Mokslinė vadovė

prof. dr. Alina Smalinskienė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, gamtos mokslai, biologija – N 010).

Konsultantė

doc. dr. Rasa Liutkevičienė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, me-dicinos ir sveikatos mokslai, medicina – M 001).

Disertacija ginama Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Biologijos mokslo krypties taryboje:

Pirmininkė

prof. habil. dr. Angelija Valančiūtė (Lietuvos sveikatos mokslų universi-tetas, gamtos mokslai, biologija – N 010).

Nariai:

doc. dr. Renata Balnytė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, medici-nos ir sveikatos mokslai, medicina – M 001);

doc. dr. Jurgita Skiecevičienė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, gamtos mokslai, biologija – N 010);

prof. dr. Algimantas Paulauskas (Vytauto Didžiojo universitetas, gamtos mokslai, biologija – N 010);

doc. dr. Lucia Corrado (Rytų Piedmonto universitetas (Italija), medicinos ir sveikatos mokslai, medicina – M 001).

Disertacija ginama viešame Biologijos mokslo krypties tarybos posėdyje 2020 m. gegužės 6 d. 13 val. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Nau-jausių farmacijos ir sveikatos technologijų centro A-204 auditorijoje.

Disertacijos gynimo vietos adresas: Sukilėlių pr. 13, LT-50162 Kaunas, Lietuva.

LITHUANIAN UNIVERSITY OF HEALTH SCIENCES

Edita Kuncevičienė

POLYMORPHISMS OF GENES

RELATED TO THE REFRACTION

DISORDERS AND HSA-MIR-328-3P

EXPRESSION ASSOCIATIONS

WITH MYOPIA

The Doctoral Dissertation was prepared in Dr. K. Janušauskas Laboratory of Genetic Research at the Institute of Biology Systems and the Genetic Research and Ophtalmology Laboratory at the Neurosciences Institute at Lithuanian University of Health Sciences during the period of 2014–2020. Scientific Supervisor

Prof. Dr. Alina Smalinskienė (Lithuanian University of Health Sciences, Natural Sciences, Biology – N 010).

Consultant

Assoc. Prof. Dr. Rasa Liutkevičienė (Lithuanian University of Health Sciences, Medical and Health Sciences, Medicine – M 001).

The Dissertation is defended at the Biology Research Council of the Lithuanian University of Health Sciences:

Chairperson

Prof. Habil. Dr. Angelija Valančiūtė (Lithuanian University of Health Sciences, Natural Sciences, Biology – N 010).

Members:

Assoc. Prof. Dr. Renata Balnytė (Lithuanian University of Health Scien-ces, Medical and Health ScienScien-ces, Medicine – M 001);

Assoc. Prof. Dr. Jurgita Skiecevičienė (Lithuanian University of Health Sciences, Natural Sciences, Biology – N 010);

Prof. Dr. Algimantas Paulauskas (Vytautas Magnus University, Natural Sciences, Biology – N 010);

Assoc. Prof. Dr. Lucia Corrado (Eastern Piedmont University (Italy), Medical and Health Sciences, Medicine – M 001).

Dissertation will be defended in open session of the Biology Research Council of Lithuanian University of Health Sciences on the 6th _{May 2020 at}

1:00 p.m. in A-204 auditorium of the Centre for Advanced Pharmaceutical and Health Technologies at Lithuanian University of Health Sciences.

5

TURINYS

SANTRUMPOS ... 7

ĮVADAS ... 9

1. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11

2. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12

2.1. Trumparegystės epidemiologija ... 12

2.2. Trumparegystės klasifikacija ... 14

2.3 Trumparegystės patogenezė ... 15

2.4. Genetinė analizė trumparegystės tyrimuose ... 16

2.5. Su trumparegystės pasireiškimu siejami genų polimorfizmai ... 20

2.5.1. GJD2 ir RASGRF1 genai ... 20

2.5.2. PAX6 genas ... 24

2.5.2.1. PAX6 geno sąsajos su miR-328 ... 26

2.5.3. COL2A1 genas ... 27

2.5.4. COL8A1 genas ... 28

3. TYRIMO METODIKA ... 30

3.1. Tiriamųjų imtis ... 30

3.1.1. Trumparegystės paveldimumo tyrimuose dalyvavusių tiriamųjų imtis ... 30

3.1.2. Trumparegystės grupė ... 31

3.1.3. Kontrolinė grupė ... 31

3.2. Refrakcijos tyrimai ... 31

3.3. Dvynių zigotiškumo nustatymas ... 32

3.4. Genominės DNR išskyrimas ... 32

3.5. DNR kiekio ir grynumo matavimas ... 32

3.6. Genų polimorfizmų tyrimai TL-PGR metodu ... 33

3.7. MiRNR raiškos tyrimai ... 35

3.7.1. RNR išskyrimas iš kraujo ... 35

3.7.2. Kopijinės deoksiribonukleininės rūgšties (kDNR) ruošimas ... 36

3.7.3. MiRNR amplifikacijos reakcija ... 38

3.8. MiRNR raiškos rezultatų analizė... 41

3.9. Statistinė analizė ... 42

4. REZULTATAI ... 44

4.1. Trumparegystės paveldimumo tyrimas dvynių metodu ... 44

4.2. Genų polimorfizmų tyrimai ... 47

4.2.1. Tiriamųjų kontingentas genų polimorfizmų tyrimuose ... 47

4.2.2. Genų polimorfizmų sąsajų su trumparegyste tyrimai ... 48

4.2.2.1. Genų polimorfizmų sąsajos su trumparegystės laipsniais ir lytimi ... 48

4.2.2.2. Genų polimorfizmų dvinarė logistinės regresijos analizė ... 55

4.2.2.3. Genų derinių logistinės regresijos analizė ... 56

4.3. Hsa-miR -328-3p raiškos tyrimai ... 57

6

4.3.2. Hsa-miR-328-3p raiškos periferiniame kraujyje tyrimai ... 58

4.3.3. PAX6 geno ir hsa-miR-328-3p raiškos sąsajos su tinklainės pigmentinio epitelio tankiu ... 61

5. REZULTATŲ APTARIMAS ... 63

5.1. Trumparegystės paveldimumo tyrimai dvynių metodu ... 63

5.2. GJD2, RASGRF1, COL2A1, COL8A1, PAX6 genų VNP sąsajos su trumparegyste ... 63

5.3. Hsa-miR-328-3p sąsajos su PAX6 geno VNP rs662702 ... 67

5.4. PAX6 geno VNP rs662702 ir hsa-miR-328-3p sąsajos su TPET ... 68

IŠVADOS ... 69

SUMMARY ... 70

LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 93

AUTORĖS PUBLIKACIJŲ SĄRAŠAS ... 106

Heritability of myopia and its relation with GJD2 and RASGRF1 genes in Lithuania ... 108

Independent association of whole blood miR-328 expression and polymorphism at 3’-UTR of the PAX6 gene with myopia ... 114

PRIEDAI ... 119

CURRICULUM VITAE ... 128

7

SANTRUMPOS

ACTC1 – širdies raumens aktiną 1 koduojantis genas

AGDD – amžinė geltonosios dėmės degeneracija AIC – Akaike informacinis kriterijus

AII – AII amakrininės ląstelės

cAMP – ciklinis adenozino monofosfatas CB – kūgelio bipolinė ląstelė

Cdc25 – (angl. Cell Division Cycle-25) – fosfatazė, reguliuojanti ląstelės ciklą

COL1A1 – pirmo tipo kolageną alfa 1 koduojantis genas COL2A1 – antro tipo kolageną alfa 1 koduojantis genas COL8A1 – aštunto tipo kolagenąalfa 1 koduojantis genas

CT – (angl. Threshold cycle) – PGR ciklas, kuriame mėginio raiška

viršija slenkstinę ribą

CTNND2 – kateniną delta 2 koduojantis genas

Cx – koneksinas D – dioprija DCN – dekorinas

DC5 – δ-kristalino geną stiprinantis elementas DNR – deoksiribonukleorūgštis

dNTP – dezoksiribonukleozidtrifosfatai (A, C, G, T) DZ – dizigotiniai

EDTA – etilendiamintetraacto rūgštis

FAM 5’ – (angl. 5' Carboxy-Fluorescein) – karboksi-fluoresceinas, fluorescencinis dažas

FBN1 – fibrilino 1 baltymą koduojantis genas

FGF2 – fibroblastų augimo faktorių koduojantis genas GC – ganglijinės ląstelės

GCL – ganglijinis ląstelių sluoksnis GDP – guanozino difosfatas

GTP – guanozino trifosfatas

GJD2 – tarpląstelinių plyšinių jungčių delta 2 baltymą koduojantis genas

GNV – gyslainės neovaskuliarizacija

GOLGA8B – baltymą golginą koduojantis genas

GS – galimybių santykis

h2 _{– paveldimumo koeficientas}

HC – horizontaliosios ląstelės HGF – hepatocitų augimo faktorius

8 iRNR – informacinė ribonukleino rūgštis INL – vidinis branduolinis sluoksnis kb – kilobazė

kDNR – kopijinė deoksiribonukleino rūgštis

LRPAP1 – žemo tankio baltymų lipidų receptorių koduojantis genas

LUM – lumikaną koduojantis genas

miRNR – mikro ribonukleinorūgštis MMP2 – matrikso metaloproteinazė-2 MZ – monozigotiniai

MYOC – miociliną koduojantis genas

MYP1-20 – už trumparegystę atsakingų genų, citogenetinių regionų skirstymas

OD – dešinė akis OS – kairė akis

OSA – oftalmologiškai sveiki asmenys OPL – išorinis pleksiforminis sluoksnis ONL – išrorinis branduolio sluoksnis

PAX6 – PAX6 baltymus koduojantis genas

PKA – fosfokinazė A

PI – pasikliautinasis intervalas

PMVGS – plataus mąsto viso genomo sąsajos

P4HA2 – prolyl-4-hidroksilazę alfa 2 koduojantis genas

r – koreliacijos koeficientas

RASGRF1 – Ras baltymo specifinį guanino nukleotidą atpalaiduojantį faktorių 1 koduojantis genas

RB – stiebelio bipolinė ląstelė RNazė – ribonukleazė

SFE – sferinis ekvivalentas

SLC39A5 – metalo jonų SLC pernešėjus koduojantis genas SOX2 – SOX2 transkripcijos faktorių koduojantis genas SPSS – socialinių mokslų statistinis paketas

TE – eliucijos buferinis tirplas

TGF-β1, 2 – transformuojantį augimo faktorių beta 1, 2 koduojantis genas

TL-PGR – tikro laiko polimerazės grandininė reakcija TPE – tinklainės pigmentinis epitelis

TPET – tinklainės pigmentinio epitelio tankis TPJ – tarpląstelinės plyšinės jungtys

UTR – (angl.Untranslated region) – netransliuojamas regionas

VNP – vieno nukleotido polimorfizmas

9

ĮVADAS

Trumparegystė – dažniausiai pasitaikantis akių refrakcijos sutrikimas, kai lygiagretūs spinduliai, perėję akies optinę sistemą, susikerta prieš tinklainę. Šio sutrikimo priežastis gali būti pailgėjęs akies obuolys arba per didelė lęšiuko laužiamoji geba (Holden ir kt., 2015).

Rega yra svarbiausia žmogaus sensorinė sistema, kurios dėka gaunama daugiausiai informacijos apie supančią aplinką (Young ir kt., 2007). Tai rodo, kad žinios, susijusios su akių refrakcijos sutrikimo mechanizmais yra svar-bios dėl žmogaus gyvenimo kokybės.

Trumparegystės pasireiškimą lemia genetiniai ir aplinkos veiksniai, kurie akių vystymąsi gali paveikti struktūriškai ir fiziologiškai (Young ir kt., 2007; Hales ir kt., 2001).

Atlikti dvynių tyrimai Australijoje, Jungtinėje Karalystėje, Danijoje parodė, kad genetinių veiksnių įtaka trumparegystės pasireiškimui yra dides-nė nei aplinkos veiksniai (Dirani ir kt. 2006; Hammond ir kt., 2001; Lyhne ir kt., 2001). Lietuvoje nuo 2004 iki 2018 metų, trumparegyste vaikų skaičius

padidėjo 1,8 karto (www.sic.hi.lt), tačiau tyrimų, rodančių, kiek augančios

trumparegystės pasireiškimui turi įtakos genetiniai ir aplinkos veiksniai, mūsų šalyje nėra atlikta.

Atlikta genetinės sankibos analize (angl. Linkage Analysis) nustatyta 20 galimų chromosomų regionų, kurie siejami su trumparegyste. Vėliau buvo nustatyti 25 genai, kurių didelė dalis dalyvauja bendruose biologiniuose procesuose, tokiuose kaip tarpląstelinio užpildo struktūros pokyčiai, regu-liuojantys jungiamojo audinio remodeliaciją (Wojciechowski ir kt., 2011).

Šio tyrimo metu tirti COL2A1, COL8A1 genai, koduojantys užląstelinio užpildo II ir VIII tipo kolagenus yra svarbūs jungiamojo audinio remode-liacijoje. II tipo kolagenas aptinkamas kremzėse, stiklakūnyje, VIII tipo ko-lagenas svarbus akies priekinio segmento vystymuisi (Hopfer ir kt., 2005). Sparčiai tobulėjant molekulinės genetikos metodams, plataus mąsto viso genomo sąsajų (PMVGS) tyrimais nustatyta 160 genų, kurie siejami su refrakcijos sutrikimais. Vieni pirmųjų PMVGS tyrimais nustatyti GJD2 ir

RASGRF1 genai. Šie genai siejami su naujais trumparegystės mechanizmais,

tokiais kaip stiebelių ir kūgelių bipoliarinių sinapsių neurotransmisija

(Tedja ir kt., 2018).

GJD2 ir RASGRF1 sąsajų reikšmingumui su trumparegyste įvertinti, buvo

atlikti tyrimai Azijos populiacijoje (Li ir kt., 2015; Chen ir kt., 2015; Oishi ir kt., 2013; Fernandez-Medarde ir kt., 2009), tačiau Europoje tyrimų rezultatų, susijusių su minėtais genais ir trumparegyste, prieinamose duomenų bazėse nepavyko rasti. Siekiant nustatyti trumparegystės pasireiškimą lemiančius

10

genetinius veiksnius yra svarbu atlikti genetinius tyrimus skirtingose po-puliacijose.

PAX6 genas yra atsakingas už centrinės nervų sistemos ir akių vystymąsi,

taip pat svarbus lęšių ir tinklainės diferenciacijoje (Liang ir kt., 2011). Duomenų bazėse randama, kad PAX6 geno vieno nukleotido polimorfizmo (VNP) rs662702 3ʼ netransliuojamame regione (UTR) yra galima sąveika tarp PAX6 geno informacinės RNR (iRNR) ir mikroRNR-328 (miR-328). Manoma, kad minėta sąveika gali slopinti PAX6 geno koduojamo PAX6 baltymo raišką, dėl kurios sutrikdomas normalus akių vystymasis (Wang ir kt., 2013). Atlikti funkciniai tyrimai su skleros ir tinklainės pigmentinio epi-telio ląstelėmis, taip pat parodė, kad padidėjusi miR-328 raiška, turi įtakos

PAX6 geno raiškai (Azhwar ir Perumal, 2015).

Tačiau, dėl ribotos galimybės paimti žmogaus akių audinių, PAX6 geno VNP rs662702 ir hsa- miR-328-3p sąveikos reikšmingumo tyrimų su trum-paregyste in vivo, nebuvo atlikta. Iki šiol nebuvo rasta duomenų ir apie cirku-liuojančios kraujyje hsa-miR-328-3p tyrimus trumparegiams bei šio žymens sąveiką su PAX6 genu. Todėl, mūsų atlikti neinvaziniai hsa-miR-328-3p tyrimai, trumparegių ir sveikųjų periferiniame kraujyje yra svarbūs aiški-nantis PAX6 geno raiškos reguliaciją trumparegystės mechanizme.

11

1. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas – įvertinti su refrakcijos sutrikimais siejamų genų poli-morfizmų ir hsa-miR-328-3p reikšmę trumparegystei.

Darbo uždaviniai:

1. Įvertinti genetinių ir aplinkos veiksnių įtakątrumparegystės pasireiškimui. 2. Nustatyti genų: GJD2 rs634990, RASGRF1 rs8027411, COL2A1 rs1635529, COL8A1 rs13095226, PAX6 rs662702 vieno nukleotido po-limorfizmus (VNP) trumparegystės ir kontrolinės grupės tiriamiesiems ir įvertinti sąsajų reikšmingumą trumparegystės pasireiškimui.

3. Nustatyti PAX6 geno VNP rs662702 ir COL8A1 geno VNP rs13095226 genotipų derinių reikšmingumą trumparegystės pasireiškimui.

4. Įvertinti PAX6 geno VNP rs662702 ir hsa-miR-328-3p raiškos sąsajas su trumparegyste.

5. Įvertinti PAX6 geno VNP rs662702 ir hsa-miR-328-3p raiškos sąsajas su tinklainės pigmentinio epitelio tankiu.

Darbo mokslinis naujumas

Šiame moksliniame darbe, dvynių metodu buvo įvertintas genetinis po-veikis akių biometriniams parametrams, susijusiems su trumparegyste. Iki šiol, dvynių tyrimo metodu, trumparegystės ar akių biometrinių parametrų

paveldimumas Lietuvoje nebuvo tirtas.

Taip pat, nustatytos genų: GJD2 rs634990, RASGRF1 rs8027411, PAX6 rs662702, COL2A1 rs1635529,COL8A1 rs13095226 VNP sąsajos su

paregyste ir įvertintas šių polimorfizmų reikšmingumas, atsižvelgiant į trum-paregystės laipsnį ir lytį.

Šiame darbe pirmą kartą nustatyti PAX6 geno VNP rs662702 ir COL8A1

geno VNP rs13095226 genotipų variantų deriniai, kuriuos turintiems asme-nims padidėja rizika trumparegystės pasireiškimui.

Taip pat buvo atlikti PAX6 geno VNP rs662702 3’-UTR sąsajų su hsa-miR-328-3p raiška tyrimai.

Nors hsa-miR-328-3p aptinkama daugelyje audinių, tačiau dėl riboto akies audinio paėmimo iki šiol hsa-miR-328-3p raiškos pokyčiai in vivo nebuvo tirti (Tsai ir kt., 2008).

Šiame tyrime, žmogaus kraujyje cirkuliuojančios hsa-miR-328-3p raiškos tyrimai atlikti, naudojantis „Applied Biosystems“ sukurtais miRNR išskyrimo iš žmogaus veninio kraujo rinkiniais. Hsa-miR-328-3p raiška buvo vertinta trumparegystės ir kontrolinėje tiriamųjų grupėse. Gauti rezultatai parodė reikšmingas sąsajas tarp hsa-miR-328-3p raiškos padidėjimo ir trumpare-gystės, lyginant su kontroline grupe.

12

2. LITERATŪROS APŽVALGA

Tyrimai rodo, kad trumparegių žmonių visame pasaulyje yra 1,89 mlrd., o tai sudaro 28 proc. pasaulio populiacijos. Jei plitimo rodikliai nesikeis, prog-nozės rodo, kad iki 2050 m. sergančiųjų trumparegyste padaugės daugiau nei du kartus (iki 4,95 mlrd.) (2.1.1 pav.) (Holden ir kt., 2016).

2.1.1 pav. Trumparegystės atvejų skaičiaus ir paplitimo pokytis pasaulyje

nuo 2000 iki 2050 metų (pagal Holden ir kt., 2016).

Didžiausias trumparegystės paplitimas (70–90 proc.) nustatytas pietryčių Azijoje (2.1.2 pav.) (Morgan ir kt., 2012; Wu ir kt., 2016). Taivane tarp mokyklinio amžiaus vaikų trumparegystės paplitimas siekia 84 proc., o Pietų Korėjoje atliktame tyrime, kuriame buvo tiriami 19 metų amžiaus kariai, trumparegystės paplitimas sudarė 97 proc. (Lin ir kt., 2004; Jung ir kt., 2012). JAV, Europoje ir Australijoje trumparegystės paplitimas yra ženkliai mažes-nis (Group ir kt., 2004; Vitale ir kt., 2008). Atlikti tyrimai JAV rodo, kad trumparegystės paplitimas siekia 34–42 proc., Australijoje 17–30 proc. as-menų yra trumparegiai (French ir kt., 2013). Jungtinėje Karalystėje trum-paregystė nustatyta vidutiniškai trečdaliui suaugusių, kurių amžius yra virš 20 metų (Solouki ir kt., 2010). Atlikti britų tyrimai vaikams iki 11 metų, parodė nevienodą trumparegystės paplitimą skirtingų rasių asmenims: ne-didelis paplitimas (3 proc.) rastas tarp baltaodžių europiečių, 10 proc. tarp afrikiečių ir 25 proc. tarp pietų azijiečių (Rudnicka ir kt., 2010).

13

2.1.2 pav. Trumparegystės paplitimas pasaulyje (2016 metai)

Trumparegystės paplitimas Europos šalyse svyruoja nuo 13,7 iki 36,1 proc. (2.1.3 pav.). Pagal Lietuvos Statistikos departamento duomenis, Lietuvoje per pastarąjį dešimtmetį vaikų su trumparegyste padaugėjo beveik 2 kartus (2.1.4 pav.). 2017 metais nustatyti 63,4 vaikų trumparegystės atvejai 1000 gyventojų, tačiau Lietuvos Statistikos departamento duomenų apie

suaugusiųjų trumparegystę nėra pateikta (www.sic.hi.lt).

2.1.3 pav. Trumparegystės paplitimas Europoje (2010–2017 metų duomenys)

14

2.1.4 pav. Vaikų trumparegystės atvejų skaičius Lietuvoje (2004–2018 metai)

Nustatyta, kad trumparegystės paplitimo rodikliai suaugusiems skiriasi priklausomai nuo amžiaus. Trumparegystės paplitimas tarp vyresnio amžiaus žmonių yra mažesnis nei jaunesniems suaugusiems. 1988–1990 metais, JAV

atlikti akių tyrimai 4926 suaugusiems, parodė, kad tarp asmenų nuo 43 metų

amžiaus, trumparegystės atvejų pradeda mažėti. Nuo 43 iki 54 metų amžiaus trumparegystės atvejų sumažėjo 22 proc.; nuo 55 iki 64 metų amžiaus – 43 proc. (Wang ir kt., 1994).

2.2. Trumparegystės klasifikacija

Pasaulyje trumparegystė skirstoma pagal keletą klasifikacijos sistemų: 1) atsižvelgiant į klinikines charakteristikas; 2) pagal trumparegystės atsira-dimo priežastį; 3) pagal trumparegystės laipsnį ir 4) pagal trumparegystės atsiradimo amžiaus pradžią (Goss ir kt., 1997; Rosenfield ir kt., 2006).

Remiantis klinikinėmis charakteristikomis trumparegystė skirstoma į pen-kias kategorijas: 1) paprastoji trumparegystė (Simple myopia) – trumparegys-tė atsirandanti vaikystrumparegys-tėje, didėja nuo –0,3 iki –0,5 dioptrijos (D) per metus. Trumparegystės progresas lėtėja arba sustoja paauglystėje; 2) naktinė trum-paregystė (Myopia nocturna) – trumparegystė susijusi su emetropija, kuri atsiranda tamsoje ir dingsta didėjant apšvietimui; 3) pseudomiopija – trum-paregystės forma, sukelta akomodacinės sistemos spazmo; 4) progresyvioji trumparegystė (Myopia progressive) trumparegystė paprastai atsirandanti

vaikams iki dvylikos metų dėl akies obuolio pailgėjimo. Ši trumparegystės forma būdinga 2 proc. pasaulio gyventojų. Akies tempimas didėja su amžiu-mi, gali privesti prie regėjimo praradimo; 5) sukelta trumparegystė (Myopia transitoria) – trumparegystės rūšis, kuri atsiranda dėl tam tikrų vaistinių

15

preparatų vartojimo ar gliukozės kiekio kraujyje pokyčių. Ši trumparegystė laikina ir gali būti grįžtama (Goss ir kt., 1997, Rosenfield ir kt., 2006).

Pagal trumparegystės atsiradimo priežastį, trumparegystė skirstoma į dvi kategorijas: 1) ašinė trumparegystė (Myopia axialis) – trumparegystė, atsi-randanti esant pailgėjusiai akies optinei ašiai; 2) refrakcinė trumparegystė

(Myopia refractiva) – trumparegystė atsiradusi dėl pernelyg didelės lūžio

ga-lios optinėje akies sistemoje (Young ir kt., 2007).

Oftalmologijoje trumparegystę labiausiai priimtina klasifikuoti pagal laipsnius, priklausomai nuo regos aštrumo sumažėjimo. Klinikiniu požiūriu trumparegstė būna trijų laipsnių: silpna iki –3,0 D, vidutinė nuo –3,0 D iki –6,0 ir didelio laipsnio trumparegystė ≥ –6,0 D (Young ir kt., 2007; Fer-nández-Medarde ir kt., 2009).

Kitas klasifikavimo būdas remiasi trumparegystės pasireiškimo amžiaus pradžia: 1) įgimta trumparegystė (Myopia congenita) – labai retai pasitaikanti trumparegystės forma, kuri diagnozuojama pirmosiomis kūdikio gyvenimo dienomis dėl akies obuolio vystymosi sutrikimų; 2) jaunimo trumparegystė (< 20 metų); 3) ankstyva suaugusiųjų trumparegystė (20–40 metų) ir 4) vė-lyva suaugusiųjų trumparegystė (> 40 metų) (Goss ir kt., 1997).

2.3. Trumparegystės patogenezė

Yra nustatyti aplinkos ir genetiniai veiksniai, kurie siejami su

trumpare-gystės patogeneze.

Aplinkos veiksniai: yra žinoma, kad išsilavinimo lygis, urbanizacija,

pre-nataliniai veiksniai, socialinė ir ekonominė padėtis, mažas fizinis aktyvumas, retas buvimas lauke, pasyvus kvėpavimas cigarečių dūmais, paspartina trum-paregystės atsiradimą (Czepita ir kt., 2011).

Genetiniai veiksniai: trumparegystė gali būti paveldima monogeniniu

arba poligeniniu būdu. Retai pasitaiko, kad trumparegystė paveldima mono-geniniu autosominiu dominantiniu, autosominiu recesyviniu ar susijusiu su X chromosoma būdu. Poligeninis trumparegystės paveldėjimas vyksta žymiai dažniau. Remiantis tyrimų duomenimis, nustatyta, kad genai atsakingi už didelio laipsnio trumparegystę yra 1–5, 7, 8, 10–12, 14, 17–22 chromoso-mose. Genai, atsakingi už silpną ir vidutinio laipsnio trumparegyste ap-tinkami 7 chromosomoje. Trumparegystė paplitusi daugelyje sindromų, tokių

kaip: Dauno, „Cohen“, „Cornelia de lange“, „Ehlers-Danlos“, „Kniest“,

„Knobloch“, Marfano, „McCune-Albright“, Noonano, „Prader-Willi“,

„Ru-binstein-Taybi“, Stiklerio, „Weill-Marchesani“. Taip pat trumparegystė bū-dinga ir turintiems vaisiaus alkoholinį sindromą, homocistinuriją, įgimtą naktinį aklumą. Trumparegystės išsivystymui įtakos gali turėti ir ornitino aminotransferazės ir prolidazės trūkumas, nepakankamas kalcio, fluorido ir

16

seleno kiekis maiste ir taip pat būdinga neišnešiotiems kūdikiams. Manoma,

kad genetiniai veiksniai nulemia eilę defektų, susijusių su jungiamojo audinio baltymu kolagenu, kuris svarbus akies skleros struktūrai palaikyti (Czepita ir kt., 2002; Yu ir kt., 2011; Wojciechowski ir kt., 2011; Morgan ir kt., 2012; Goh ir kt., 2010).

Atlikti genetinių veiksnių tyrimai šeimoms, pateikė įrodymų, patvirtinan-čių svarbų genetinių veiksnių vaidmenį trumparegystės pasireiškimui (Wojciechowski R. ir kt., 2005; Ip ir kt., 2007). Ip ir kt. (2007) atliko tyrimą Australijoje, 2353 vaikams, kurių amžiaus vidurkis 7 metai. Rezultatai rodo, kad ne trumparegiams tėvams, rizika susilaukti trumparegio vaiko yra 7,6 proc., turint trumparegystę vienam iš tėvų – 14,9 proc., o esant abiems tėvams trumparegiams – 43 proc. (Ip JM irk t., 2007). Kiti tyrimai Taivane parodė, kad esant ≥ –5,5 D trumparegiams tėvams su didelio laipsnio trum-paregyste, galimybių santykis vaikams sirgti trumparegystę padidėja 3,7 karto (95 proc. PI: 1,1–6,5) (Lyhne ir kt., 2001).

Karlsson ir kt. (2004), JAV įvertino eilę dvynių tyrimų ir nustatė, kad 95 proc. monozigotinių dvynių turi panašią refrakciją, ir tik 29 proc. dizi-gotinių dvynių turi refrakcijos panašumą (Karlsson ir kt., 2004). Vėliau, di-delio mąsto dvynių tyrimai Australijoje, Juntinėje Karalystėje, Olandijoje patvirtino, kad genetiniai veiksniai labiau lemia refrakciją, nei aplinkos veiksniai. Trumparegystės paveldimumas skirtingose studijose svyravo nuo 75 proc. iki 94 proc. Šie rezultatai dar kartą patvirtina genetinių veiksnių svarbą trumparegystės pasireiškimui (Dirani irk t., 2006; Hammond ir kt., 2001; Lyhne ir kt., 2001).

2.4. Genetinė analizė trumparegystės tyrimuose

1990 metais atlikta genų sankibos analizė (angl. Linkage analysis) padėjo identifikuoti pirmąjį lokusą (MYP1), kuris siejamas su trumparegystės pasi-reiškimu. Vėliau buvo identifikuota dar 19 su trumparegyste susijusių lokusų, kurie pavadinti nuo MYP1 iki MYP20 (Young ir kt., 2001). Vykdant už trumparegystę atsakingų kandidatinių genų paiešką, daugiausiai atlikta VNP atvejo-kontrolės tyrimų. Šių tyrimų dėka, nustatyti 25 genai, susiję su trumparegystės patogeneze, priklausantys ir nepriklausantys MYP lokusams (Wojciechowski ir kt., 2011). Mokslininkai teigia, kad tyrimų atsikartojamu-mas įvairiose populiacijose yra svarbus patvirtinant genų ir trumparegystės sąsajų tyrimus (Metlapally ir kt., 2009; Tang ir kt., 2007). Kandidatinių genų sąsajų su trumparegyste tyrimai aprašomi 2.4.1 lentelėje.

17

2.4.1 lentelė. Trumparegystės kandidatiniai genai

Genas Informacija apie geną _{į nuorodą} Šaltinis

1 2 3

LUM MYP3 lokusas. LUM genas koduoja lumikaną (angl.

Lumican), tai yra proteoglikanas. Lumikanas gali kontroliuoti

kolageno fibrilogenezę, kuri sukelia kolageno remodeliaciją trumparegių skleroje, o tai pagrindžia kodėl lumikanas yra siejamas su didelio laipsnio trumparegystės pasireiškimu.

Young ir kt., 1998

DCN MYP3 lokusas. Dekorinas (DCN) žinomas kaip

dermatansul-fato proteoglikanas 3 (DSPG3), kuris aptinkamas skleros užduląsteliniame užpilde. VNP tyrimai parodė reikšmingas sąsajas tarp DCN koduojančio geno ir trumparegystės.

Zhang ir kt., 2009

COL1A1 MYP5 lokusas. Skleros remodeliacija yra vienas iš didelio

laipsnio trumparegstės pasireiškimo mechanizmų. Sklerą sudaro 1 tipo kolagenas, kurį koduoja kolageno 1 tipo alfa 1 genas (COL1A1), VNP tyrimai reikšmingi sąsajose su trumparegyste.

Paluru ir kt., 2003

PAX6 MYP7 lokusas. PAX6 (angl. The pair box 6) yra pagrindinis

genas kontroliuojantis akių vystymąsi. PAX6 geno sąsajos pirmiausia įrodytos su vidutinio laipsnio trumparegyste. Toli-mesniais atvejo-kontrolės tyrimais buvo įrodytos reikšmingos sąsajos ir su didelio laipsnio trumparegyste.

Hammond ir kt., 2004

FGF2

(bFGF) MYP11 lokusas. Fibroblastų augimo faktorius 2 (FGF2) žino-mas kaip pagrindinis fibroblastų augimo faktorius (bFGF), kuris yra skleros užląstelinio užpildo komponentas. Tačiau šio geno VNP tyrimų rezultatai yra kontraversiški.

Zhang ir kt., 2005

MIPEP,

C1QTNF9B MYP20 lokusas. Nustatyta, kad VNP rs1886970, yra MIPEP geno 14 introne ir yra genų sankibos pusiausvyroje su rs9318086, esančiu MIPEP 10 introne. Shi et al. (2011) nustatė reikšmingą sąsają su didelio laipsnio trumparegyste pagal lytį ir amžių (heterozigotinis GS, 1,35; homozigotinis GS, 1,63; p = 1,33 × 10–5_{). Shi et al. (2011) nustatė, kad iš trijų genų,} esančių lokuse, stebima dviejų genų (MIPEP ir C1QTNF9B) raiška tinklainėje ir tinklainės pigmentiniame epitelyje.

Shi ir kt., 2011

TGFβ1 Transformuojantis augimo faktorius beta 1 (TGFβ1) yra taip pat skleros užląstelinio užpildo komponentas. Atvejo-kont-rolės tyrimai parodė reikšmingas TGFβ1 sąsajas su didelio laipsnio trumparegyste.

Lin ir kt., 2009

TGFβ2 Atvejo-kontrolės tyrimais įrodyta, kad ir TGFβ2 turi sąsajas

18 2.4.1 lentelės tęsinys 1 2 3 COL2A1 COL11A1 COL18A1 FBN1

COL2A1 genas koduoja antro tipo alfa 1 kolageną, dar

žino-mas, kaip genas, lemiantis 1 tipo Stickler sindromą.COL11A1 genas lemia 2 tipo Stickler sindromą. COL18A1 genas lemia Knobloch sindromą. Fibrilinas 1 (FBN1) yra genas lemia Marfano sindromą. Turint aprašytus sindromus yra

charakterizuojama didelio laipsnio trumparegystė, todėl šie genai yra įtraukiami kaip kandidatiniai genai, siejami su didelio laipsnio trumparegyste.

Metlapally ir kt., 2009 Mutti ir kt., 2007

MMP Matrikso metalo proteinazės (MMP) ir jų inhibitoriai yra įrodyti daugelyje tyrimų kaip kandidatiniai trumparegystės genai. Nustatytos reikšmingos MMP1-MMP3 ir MMP9 genų sąsajos su trumparegyste, tačiau tarp MMP8-11, MMP12 ir trumparegystės reikšmingų skirtumų nenustatyta.

Hall ir kt., 2006 Schache ir kt., 2012

HGF ir

cMET Hepatocitų augimo faktorius (HGF) rišasi su receptoriumi cMET, kuris yra glaučiai susijęs su biologiniu MMP akty-vumu ir TIMP. Reikšmingos HGF sąsajos su didelio laipsnio trumparegyte buvo nustatytos Kinijoje, tačiau kiti pakartoti tyrimai Kinijoje ir Kaukazijoje reikšmingų sąsajų neparodė.

Han ir kt., 2006 Yanovitch ir kt., 2009

MYOC Mutacijos miocilino (MYOC) gene identifikuotos kaip gliaukomos priežastis. Kadangi gliaukoma dažnai pastebima trumparegiams, buvo įvertintos MYOC geno sąsajos su trumparegyste. Kinijoje ir Kroatijoje tyrimai parodė

reikšmingas MYOC sąsajas su didelio laipsnio trumparegyste, tačiau atlikti tyrimai europiečiams ir JAV gyventojams paneigė šias sąsajas.

Tang ir kt., 2007 Dai ir kt., 2012

Nuo 2010 metų atlikti PMVGS tyrimai ženkliai padidino genų skaičių, atsakingų už trumparegystės atsiradimą. Atlikta metaanalizė, į kurią buvo įtraukta 160 420 pacientų su refrakcijos sutrikimais, įskaitant ir trumpare-gystę, atskleidė nuo 37 iki 161 genų, kurie turi sąsajas su refrakcijos sutriki-mais (Tedja ir kt., 2018).

Nauji nustatyti genai į trumparegystės patogenezę įtraukė naujus me-chanizmus, tokius kaip stiebelių ir kūgelių bipoliarnių sinapsių neurotrans-misiją, priekinio segmento (angl. Anterior-segment) morfologiją ir angio-genezę (2.4.2 lentelė) (Tedja ir kt., 2018).

19

2.4.2 lentelė. PMVGS tyrimais nustatyti genai, kurių mutacijos gali lemti

trumparegystės pasireiškimą

Genas Informacija apie geną _{į nuorodą} Šaltinis

GJD2,

RASGRF1 GJD2 ir RASGRF1 yra pirmieji PMVGS tyrimais nustatyti genai, kurie atsakingi už refrakcijos sutrikimus. Nustatyta, kad abiejų genų raiška nustatyta tinklainės fotoreceptorinėse ląstelėse ir atlieka svarbų vaidmenį regos signalų procese. Šie tyrimai padėjo atrasti kitus galimus biologinius trumparegystės mechanizmus,

tokius kaip RASGRF1 geno raiškos reguliaciją muskariniais

receptoriais ir neurotransmisiją tarp fotoreceptorinių ląstelių.

Fernandez-Medarde ir kt., 2009; Solouki ir kt., 2010; Hysi ir kt., 2010

ZNF644 MYP21 lokusas. Penkių kartų Han kinų šeimoje, išsiskiriančioje

autosominę, dominuojančia didelio laipsnio trumparegyste, Shi ir kt. (2011) atliko egzomo sekoskaitą ir segregacijos analizę ir nustatė ZNF644 geno misens mutaciją.

Shi ir kt., 2011

CCDC111 MYP22 lokusas. Keturių kartų kinų šeimoje su autosomine,

do-minuojančia didelio laipsnio trumparegyste, Zhao ir kt., (2013) atliko egzomo sekoskaitą ir nustatė CCDC111 geno misens muta-ciją (Y89D). Ši mutacija nebuvo nustatyta 270 asmenų kontroli-nėje grupėje. Žmogus, kuris turėjo sunkesnę trumparegystę nei jo vaikai, buvo homozigotas, pagal rizikos alelius, o visi kiti turin-tys mutaciją šeimos nariai buvo heterozigotai. Kadangi klinikinio fenotipo sunkumas buvo skirtingas tarp mutacijas turinčių asme-nų, Zhao ir kt., (2013) teigė, kad aplinkos įtaka greičiausiai prisi-dėjo prie šeimos ir sporadinių pacientų etiologijos.

Zhao ir kt., 2013

LRPAP1 MYP23 lokusas. Egzomo sekoskaita buvo nustatytos dvi LRPAP1

geno mutacijos: 1-bp delecija vienoje šeimoje ir 2 bp deleciją kitose dviejose šeimose. Tačiau, atlikus LRPAP1geno analizę 100 individų, sergančių -6 D ar didesnio laipsnio trumparegyste, mutacijos neaptiktos. Taip pat nenustatyta jokių pakitusių variantų lyginat su 100 kontrolinės grupės asmenų.

Aldahmesh ir kt., 2013

SLC39A5 MYP24 lokusas. Trijų kartų kinų šeimos nariams, kuriems buvo

autosominė, dominuojanti didelio laipsnio trumparegystė, Guo ir kt. (2014) atliko viso egzomo sekoskaitą ir nustatė SLC39A5 ge-no ge-nonsense mutaciją (Y47X). Taip pat buvo atlikta SLC39A5 geno analizė 180 asmenų, kurie turėjo didelio laipnio trumpare-gystę, tačiau nustatytas tik vienąs pacientas, kuris taip pat turėjo Y47X mutaciją.

Guo ir kt., 2014

P4HA2 MYP25 lokusas. Trijų kartų kinų šeimos nariams, turintiems

autosominę, dominuojančią didelio laipsnio trumparegystę, Guo ir kt. (2015 m.) atliko viso egzomo sekoskaitą ir nustatė heterozi-gotinę P4HA2 geno misens mutaciją (E291K), kuri nebuvo rasta 626 asmenų kontrolinėje grupėje ir neaptikta duomenų bazėse. Buvo atlikta P4HA2 geno sekoskaita 186 asmenims su didelio laipsnio trumparegyste ir rastos dar 4 naujos mutacijos 5 pacien-tams.

Guo ir kt., 2015

20

2.5. Su trumparegystės pasireiškimu siejami genų polimorfizmai 2.5.1. GJD2 ir RASGRF1 genai

Atlikti du skirtingi su trumparegyste susiję PMVGS tyrimai, padėjo nu-statyti 15q14-25 chromosomos lokusą, kuris yra šalia GJD2 (angl. Gap

junction protein delta 2) ir RASGRF1 (angl. Ras protein-specific guanine nucleotide-releasing factor 1) genų. Aptinkama didelė GJD2 ir RASGRF1 genų raiška tinklainės fotoreceptorinėse ląstelėse, todėl manoma, kad šie genai atlieka svarbų vaidmenį regos signalų procese (Fernandez-Medarde ir kt., 2009). GJD2 – tai tarpląstelinių plyšinių jungčių (TPJ) delta 2 baltymą koduojantis genas, dar žinomas kaip genas, kuris koduoja neuronų specifinį 36kDa baltymą koneksiną (CX36) (Nakanishi ir kt., 2009; Solouki ir kt., 2010). TPJ yra specializuotos struktūros tarp ląstelių, per kurias vyksta vi-duląstelinis mažų iki 1 kDa dydžio molekulių ir jonų transportas (Pereda ir kt., 2014). Kiekvieną TPJ sudaro du puskanaliai (koneksonai), o šiuos sudaro šeši koneksinai (Cx) (2.5.1.1 pav.) (Harris ir kt., 2001). Koneksonai gali būti sudaryti iš visų tų pačių koneksinų (homomerinių) arba skirtingų koneksinų baltymų (heteromerinių) (Sohl ir Willecke, 2003). TPJ kanalai skiriasi elekt-riniu, selektyviu pralaidumu ir kanalų vartų jautrumu įtampai (Bukauskas ir kt., 2002).

2.5.1.1 pav. Tarpląstelinių plyšinių jungčių struktūra ir molekulinis organizavimas (pagal Bloomfield ir Volgyi, 2009)

21

Eksperimentiniai tyrimai su laboratoriniais gyvūnais padėjo atskleisti tinklainės neuronų TPJ mechanizmą. Nustatyta, kad CX36 baltymo raiška yra didžiausia tinklainėje, lyginant su kitais aprašomais koneksinais, tokiais kaip CX43, CX45 ir CX50. Iš CX36 suformuota TPJ atlieka svarbų vaidmenį transmisijos procese tinklainės elektrinėje grandinėje, tarp fotoreceptorinių, amakrininių ir bipoliarinių ląstelių (2.5.1.2 pav.). Atlikti tyrimai Tikro laiko polimerazės grandininės reakcijos (TL-PGR), Western bloto ir imunofluo-rescencijos metodais parodė, kad CX36 raiška stipriai didėja akies vystymosi metu (Kihara ir kt., 2009).

2.5.1.2 pav. Tinklainės sluoksniai ir penkios pagrindinės tinklainės

ląstelių rūšys (pagal Bloomfield ir Volgyi, 2009)

Cx – koneksino tipai, C – kūgeliai, R – stiebeliai, HC – horizontaliosios ląstelės,

RB – stiebelio bipolinė ląstelė, CB – kūgelio bipolinė ląstelė, AC – amakrininės ląstelės, AII – AII amakrininės ląstelės (AII), GC – ganglijinės ląstelės, ONL – išorinis branduolinis sluoksnis, OPL – išorinis pleksiforminis sluoksnis, INL – vidinis branduolio sluoksnis,

22

Yra žinoma, kad koneksino baltymų fosforilinimas arba defosforilinimas lemia TPJ laidumą. Tyrimai parodė, kad Cx36 raiška, vyraujanti TPJ nervų sistemoje yra moduliuojama fosforilinimo būdu, kurį skatina cAMP / PKA (fosfokinazės A) aktyvumas arba azoto oksidas (Patel ir kt., 2006).

Cx36 dalyvauja tiek homologinėse TPJ su kaimyninėmis amakrininėmis ląstelėmis, tiek aptinkamas heterologinėse TPJ su kolbelių bipoliarinių ląs-telių susijungimo vietomis (Famiglietti ir Kolb, 1975; Massey ir Mills, 1999). Signalai gauti iš kūgelių į kūgelių bipoliarines ląsteles yra skirstomi į ON ir OFF kanalus. Kolbelių bipoliarinės ląstelės turi savybę į šviesą reaguoti prie-šingu poliškumu. Tačiau stiebelių bipoliarinės ląstelės turi tik vieną kanalų tipą, kuris sukuria ON atsakus. Stiebelių bipoliarinės ląstelės nesudaro sinap-sių tiesiogiai į ganglijines ląsteles. Stiebelių signalas pereina į ON ir OFF kanalus AII amakrininėmis ląstelėmis. Toliau šis signalas pasiekiamas AII, sudarant TPJ su ON / OFF kūgelių bipoliarinėmis ląstelėmis (Vaney ir kt., 1994; Vardi ir Smith, 1996).

Atlikta GJD2 geno VNP rs634990 regiono analizė su arčiausiai išsidės-čiusiais genais ACTC1, GOLGAA8B parodė, jog tinklainėje GJD2 genas turi didžiausią raišką, tuo tarpu ACTC1 genas turi vidutinę, o GOLGA8B genas žymiai mažesnę raišką (2.5.1.3 pav.) (Solouki ir kt., 2010).

Vis dėlto, tikslus mechanizmas, kuriuo būtų GJD2 geno VNP variantai siejami su trumparegyste, iki šiol nėra išaiškintas.

2.5.1.3 pav. GJD2 geno VNP rs634990 regiono analizė (pagal Solouki ir kt., 2010)

23

RASGRF1 genas yra 139 kb ilgio, kurį sudaro 28 egzonai. Didžiausia RASGRF1 geno raiška nustatyta tinklainės fotoreceptorinėse ląstelėse (Zippel ir kt., 1997).

RASGRF1 genas koduoja RAS baltymą, kuris aktyvuoja specifinį guanino

nukleotidą atpalaiduojantį faktorių 1 (Hysi ir kt., 2010). RASGRF1 funkcija yra atpalaiduoti RAS signalinio baltymo difosfatą (GDP) ir prijungti guanizino trifosfatą (GTP), ir vėliau sugrąžinti jo aktyvumą (2.5.1.4 pav.).

RASGRF1 turi katalizinę Cdc25 sritį, kuri svarbi tam, kad paskatintų Ras

nukleotidų pasikeitimą. RASGRF1 svarbus reguliuojant RAS signalinį kelią ir yra susijęs su sinapsiniu perdavimu fotoreceptorių atsakuose. Ras baltymas turi funkcinę įtaką trumparegystės patogenezėje ir yra reguliuojamas muskarinių receptorių ir retinoinės rūgšties (Fernández-Medarde ir kt., 2009). Eksperimentiniai tyrimai su laboratoriniais gyvūnais parodė sumažėjusią retinoinės rūgšties sintezę gyslainėje trumparegyste sergantiems gyvūnams. Tai patvirtino ir intervenciniai tyrimai, atlikti in vivo (Mertz ir kt., 2000), todėl muskarinių inhibitorių naudojimas galbūt galėtų užkirsti kelią trumparegystės pasireiškimui (Tong ir kt., 2009).

2.5.1.4 pav. RASGRF1 transdukuoja viduląstelinį stimulą Ras aktyvacijoje,

katalizuodamas Ras GDP keitimą į GTP (pagal Tanya ir kt., 2006) RASGRF1 yra vienas pirmųjų genų, kuris nustatytas atlikus PMVGS

tyri-mus, siejamas su refrakcijos sutrikimais Europoje (Hysi ir kt., 2010), vėliau Amerikoje, Australijoje ir Azijoje (Verhoven ir kt., 2013; Kiefer ir kt., 2013).

Buvo atlikta RASGRF1 geno VNP rs8027411 tyrimų metaanalizė, į kurią įtraukti 2529 asmenys, turintys didelio laipsnio trumparegystę ir 3127

24

kontrolinės grupės tiriamieji iš keturių studijų. Rezultatai parodė, kad RASGRF1 geno VNP rs8027411 buvo reikšmingai susijęs su didelio laipsnio trumparegyste Kinijos ir Japonijos populiacijose. RASGRF1 geno VNP rs8027411 G alelio nešiotojai turėjo mažesnę didelio laipsnio trumparegys-tės riziką, palyginti su T alelio nešiotojais (G, vs T, GS = 0,83, 95 proc. PI= 0,77−0,89; p < 0,001) (Verhoven ir kt., 2012).

Tačiau, kitų mokslininkų pakartoti PMVGS tyrimai Azijos ir Europos gy-ventojams neparodė reikšmingų sąsajų tarp RASGRF1 geno didelio laipsnio trumparegystės (Verhoven ir kt., 2012; Shi ir kt., 2013). Taip pat tyrimai parodė, kad rezultatai buvo statistiškai reikšmingi homozigotiniuose, hetero-zigotiniuose ir dominuojančiuose modeliuose (Shi ir kt., 2013).

Ribotas duomenų kiekis ir paskelbti kontraversiški GJD2, RASGRF1 genų polimorfizmų tyrimų duomenys skirtingose populiacijose, paska-tino atlikti šių genų polimorfizmų tyrimus Lietuvoje, įtraukiant į tyrimus asmenis su silpna, vidutinio ir didelio laipsnio trumparegyste.

2.5.2. PAX 6 genas

PAX6 genas (angl. The paired box 6 gene) yra 11p13 chromosomos

regio-ne, turi 14 egzonų, kurie koduoja 436 amino rūgščių ilgio baltymą. PAX6 genas priklauso transkripcijos faktorių šeimai (Tsonis ir kt., 2006). Funkci-niai tyrimai parodė, kad mutacijos mažina PAX6 geno trankripcijos akty-vacijos potencialą per DNR rišančius domenus (Yu ir kt., 2011), kurie funk-cionuoja kaip reguliatoriai geno transkripte (Tsonis ir kt., 2006).

Nustatyta, kad PAX6 geno koduojamas PAX6 baltymas turi įtakos em-briono akies obuolio vystymosi metu (Glaser ir kt., 1994; Shu ir kt., 2014). Eksperimentiniai tyrimai su laboratoriniais gyvūnais taip pat parodė, kad

PAX6 genas yra svarbus vystantis lęšiui ir šio geno mutacijos gali būti

tie-siogiai susijusios su aniridija, katarakta ir didelio laipsnio trumparegyste (Glaser ir kt., 1994; Tsonis ir kt., 2006; Shu irk t., 2014).

Nustatyta, kad sinergetiniam transkripcijos aktyvavimui būtinas PAX6 ir

SOX2 / SOX3 kompleksas, kuris jungiasi su tiksline DNR seka (2.5.2.1 pav.). PAX6 geno raiška prasideda prieš akių ektodermos formavimąsi daugelyje

stuburinių rūšių. Pradinėje viščiuko embriono vystymosi stadijoje, stebimas labai žemas SOX2 raiškos lygis galvos ektodermoje. Tuo tarpu, PAX6 balty-mas ekspresuojabalty-mas galvos ektodermoje, tačiau nesukuria stabilaus komp-lekso su tikslinėmis DNR sekomis, tokiomis kaip DC5. Antroje stadijoje prasideda SOX2 / SOX3 raiška, trečioje stadijoje PAX6 „bendradarbiauja“ su SOX2 / SOX3 prie tikslinių DNR sekų ir aktyvuoja lęšių diferenciacijos ge-nus, tokius kaip δ-kristalinas. SOX2 ir / arba SOX3 ekspresiją aktyvuojama

25

optinės vezikulės indukcinių signalų (SOX2 ir SOX3 viščiuko embrione; SOX2 pelių embrionuose) (Kamachi ir kt. 1998) ir SOX3 varlių embrionuose (Zygar ir kt., 1998).

2.5.2.1 pav. Genetinis akies lęšio vystymosi iniciacijos modelis, sudarytas iš PAX6 ir SOX2 / SOX3 (Pagal Kamachi ir kt., 2001)

A. PAX6 (žalia spalva), SOX2 ir SOX3 (raudona) ir δ-kristalino (mėlyna) genų raiška ektodermoje lęšio indukcijos metu viščiuko embrione. B. Molekuliniai virsmai,

atsirandantys ankstyvoje lęšio vystymosi stadijoje.

Tyrimai parodė, kad PAX6 geno VNP rs662702 rizikos alelis (C) lemia sumažėjusią PAX6 koduojamo baltymo sintezę, dėl kurios gali padidėti MMP2 (matrikso metaloproteinazės-2) raiška (Chen ir kt., 2012; Mayes ir kt., 2006). MMP-2 dalyvauja skleros remodeliavime, todėl dėl įvykusios PAX6 geno mutacijos reikšmingai didėja rizika trumparegystės pasireiškimui (Bo

Jiang ir kt., 2016). Taip pat, nustatyta, kad PAX6 geno VNP rs662702 CC

genotipo dažnis yra didesnis asmenims su didelio laipsnio trumparegyste. Todėl, PAX6 geno VNP rs662702 3’-UTR yra vienas svarbiausių rizikos įver-tinimo žymenų, nustatant pacientus, linkusius į didelio laipsnio trumpare-gystės išsivystymą (Jiang ir kt., 2011).

PMVGS tyrimai rodo, kad polimorfizmai, esantys greta CTNND2 (angl.

Catenin Delta 2) geno yra susiję su didelio laipsnio trumparegyste (Marcus ir kt, 2011). Glaudi sąveika tarp CTNND2 ir PAX6 patvirtina, kad trumpa-regystės vystymasis susijęs su genas-genas sąveika (Callaerts ir kt., 1997).

Iki šiol PAX6 geno sąsajų su trumparegyste tyrimai buvo atlikti rytų Azijos šalyse (Kinijoje, Japonijoje), tačiau šių tyrimų duomenų kitose populiacijose neradome. Norint išaiškinti PAX6 geno genotipų variantų įtaką trumparegystės pasireiškimui, svarbu atlikti daugiau genetinių

26

tyrimų, įtraukiant trumparegystės laipsnius. Tai paskatino atlikti PAX6 geno polimorfizmo tyrimą trumparegystės ir kontrolinės grupės tiria-miesiems Lietuvoje.

2.5.2.1. PAX6 VNP rs662702 geno sąsajos su miR-328

MikroRNR (miRNR) yra evoliuciškai koncervatyvios, nekoduojančios, viengrandės RNR molekulės, kurių ilgis yra 20–25 nukleotidai (Lagos-Quintana ir kt., 2002; Ambros ir kt., 2004). Gyvūnuose, subrendusi miRNR yra komplementari su 3’-UTR vienos ar daugiau informacinių RNR (iRNR). MiRNR sujungimas su tiksline iRNR sukelia baltymo transliacijos slopinimą ir / arba iRNR skaidymą. MiRNR gali reguliuoti ląstelių augimą, diferen-ciaciją ir apoptozę (Farh ir kt., 2005). Daug dėmesio yra sutelkta į miRNR vaidmenį sergant vėžiu, tačiau Liang ir kt. (2011) savo tyrimais įrodė, kad miRNR gali turėti įtakos PAX6 geno reguliacijoje, sukeliant riziką didelio laipsnio trumparegystės pasireiškimui.

Bioinformatikos metodais buvo nustatyta, kad PAX6 geno VNP rs662702

sutampa su miR-328 surišimo vieta (Liang ir kt., 2011). Vėliau paaiškėjo, kad

PAX6 geno VNP rs662702 gali sąveikauti su miR-328 ir didinti

transfor-muojančio augimo faktoriaus-ß3 raišką tinklainės pigmentinio epitelio (TPE) ląstelėse ir taip pat gali didinti matrikso metalo proteinazės raišką skleroje. Tačiau žinoma, kad dėl PAX6 geno VNP rs662702 sąveikos su miR-328, 1 tipo kolageno ir integrino ß1 raiška skleroje mažėja (Chen, 2012). Nusta-tyta, kad PAX6 geno VNP rs662702 rizikos alelis (C) lemia miR-328 pri-sijungimą prie 3’-UTR transkripto, kuris sukelia PAX6 baltymo transliacijos slopinimą (Wang ir kt., 2013).

Atliktas tyrimas su miR-328 ir PAX6 geno raiškos lygiais TPE ir skleros ląstelėse parodė, jog didėjant miR-328 raiškai, PAX6 geno raiška mažėja skleros ląstelėse, tačiau TPE ląstelėse nustatytas padidėjimas. Kitas tyrimas buvo atliekamas su PAX6 geno raiškos slopinimu, naudojant skirtingas miR-328 koncentracijas TPE ląstelėse. Šis tyrimas atskleidė, kad PAX6 geno raiškos mažėjimas priklauso nuo didėjančios miR-328 koncentracijos. Paste-bėta, jog trumparegystės vystymosi metu, padidėja retinoinės rūgšties raiška. JASPAR duomenų bazėje rastas 2 kb miR-328 promotoriaus regionas, ku-riame yra retino rūgštį reaguojantys elementai, matoma, jog jie gali reguliuoti miR-328 raišką. TPE ląstelės, paveiktos skirtingomis retinoinės rūgšties do-zėmis, pastebimai padidina miR-328 raiškos lygį ir slopina PAX6 geno raišką. Visi šie tyrimai rodo, kad miR-328 tarpininkavimas PAX6 geno reguliavime vaidina svarbų vaidmenį trumparegystės pasireiškime (Azhwar ir Perumal, 2015).

27 2.5.3. COL2A1 genas

COL2A1 (angl. Collagen alpha-1 chain of type II) – II tipo kolageną α1

koduojantis genas, kurio lokusas yra 12q13.11 (12 chromosomos ilgojo peties 1 regiono 3 segmento 1 subsegmento 1 ruože). Nustatyta, kad COL2A1 geną sudaro 52322 bazės, 57 egzonai. COL2A1 koduojamos II tipo kolageno alfa-1 grandinės yra spiralinės formos molekulės, kurios abiejuose galuose turi N- ir C-propeptidus (2.5.3.1 pav.). Alfa-1 grandinės susisukdamos tarpusavyje sudaro trigubą grandinę, prokolageno molekulę, kuri yra II tipo kolageno pagrindas (Cheah ir kt., 1985). Prokolageno molekulės yra išskiriamos į užląstelinę ertmę ir apdorojamos N- ir C-proteinazių (Moilanen ir kt., 2002). Nuo prokolageno molekulės atskilus amino ir karboksilo terminaliniams ga-lams, molekulės virsta kolagenu, kurios sudaro plonas, organizuotas fibriles. Fibrilės viena su kita jungiasi kryžminiu būdu. Kryžminiai fibrilių ryšiai formuoja stiprias ir brandžias II tipo kolageno skaidulas, kurios suteikia stuktūrą ir stiprumą jungiamiesiems audiniams, o šie palaiko kūno raumenis, sąnarius ir odą (Ahmad ir kt., 1991).

Iki šiol yra ištirti 28 kolageno tipai (Exposito ir kt., 2005), dažniausi yra I –V tipai. I tipo kolagenas aptinkamas kauluose, sausgyslėse, odoje; II tipo – stiklakūnyje, kremzlėse; III tipo – tinklainėje; IV tipas formuoja bazinę membraną; V tipas aptinkamas ląstelių paviršiuje ir plaukuose. Fibroblastai gamina daugiausia kolagenų, kurių yra įvairaus tipo jungiamajame audinyje ir epitelinėse ląstelėse (Engel ir kt., 2005). Kai kurie kolagenai atlieka svarbų vaidmenį ląstelių adhezijoje, kuri svarbi normalios audinio struktūros ir funkcijos palaikymui (Yu ir kt., 2015).

COL2A1 geno mutacijos yra siejamos su Stiklerio sindromu. Kitų

COL2A1 regionų mutacijos gali sukelti netipišką Stiklerio sindromą, apimantį daugiausia akių fenotipus, ypač ankstyvoje stadijoje (Go ir kt., 2003). Ankstyva didelio laipsnio trumparegystė vaikams yra pirmasis ir lengvai at-pažįstamas ženkas, kad jie gali turėti Stiklero sindromą. Atlikti sąsajų tyrimai tarp COL2A1 geno VNP rs1635529 ir trumparegystės parodė, kad COL2A1 genas gali būti siejamas su trumparegyste kaukaziečiams. Tačiau, pietryčių Azijoje atlikti COL2A1 geno VNP rs1635529, rs60542319, rs1635530, rs1635531 ir rs954326 tyrimai, neparodė jokių reikšmingų skirtumų tarp trumparegystės ir kontrolinės grupės tiriamųjų (Wang ir kt., 2012).

28

2.5.3.1 pav. II tipo kolageno susidarymas (pagal Chhabra ir kt., 2013) 2.5.4. COL8A1 genas

COL8A1 (angl. Collagen Type VIII Alpha 1 Chain) genas koduoja vieną iš

dviejų VIII tipo kolageno alfa grandinių (Muragaki ir kt., 1991). Genų pro-duktas yra trumpos grandinės kolagenas, kuris yra pagrindinis ragenos endo-telio, Brucho membranos (angl. Bruch’s membrane) ir gyslainės stromos ele-mentas (Tamura ir kt., 1991).

VIII kolagenas yra gaminamas raumenų ląstelių ir makrofagų kraujagyslių sienelėje. COL8A1 baltymas reguliuoja matrikso metaloproteinazių aktyvu-mą ir endotelio ląstelių migraciją, kurią skatina kraujagyslių endotelio augimo faktorius angiogenezės metu. COL8A1 gali sukelti tiesioginius ar

netiesio-29

ginius struktūrinius pokyčius Brucho membranoje, o tai yra trumparegių gyslainės neovaskuliarizacijos (GNV) rizikos veiksnys. GNV dažniausiai atsiranda pacientams, sergantiems amžine geltonosios dėmės degeneracija (AGDD) ir didelio laipsnio trumparegyste (Ikuno ir kt., 2008).

Tyrimai rodo, kad COL8A1 genas svarbus tinklainės angiogenezei, tiek esant didelio laipsnio trumparegystei, tiek AGDD (Leveziel ir kt., 2012; Fritsche ir kt., 2013; Seddon ir kt., 2015). Atlikti atvejo-kontrolės COL8A1 VNP tyrimai, 431 asmeniui, siekiant nustatyti galimą sąsają tarp COL8A1 VNP ir GNV, parodė, kad jos yra susijusios su AGDD, didelio laipsnio trum-paregystę turintiems asmenims (Velazquez-Villora, 2016).

Logistinės regresijos analizė parodė, kad COL8A1 geno VNP rs13095226 ir rs669676 buvo reikšmingai susiję su GNV trumparegyste sergantiems pacientams, atsižvelgiant į amžių, lytį ir hipertenziją (p < 0,05). Ašies ilgio ir COL8A1 geno VNP rs13095226 genotipų sąsajų analizė atskleidė svarbią COL8A1 geno reikšmę GNV išvystymui didelio laipsnio trumparegyste ser-gantiems pacientams. COL8A1 geno VNP rs13095226 C alelis parodė reikš-mingą skirtumą tarp trumparegyste sergančių GNV pacientų ir nesergančių trumparegyste GNV grupės (p = 0,034, GS = 2,0 (1,1–3,9). Rezultatai parodė, kad COL8A1 geno VNP rs13095226 rizikos alelį turintys heterozigotai ir homozigotai (dominuojantis modelis, CT / CC) turėjo ženkliai didesnį akies ašies ilgį, lyginant su homozigotiniais pacientais, turinčiais TT genotipą (p = 0,01). Tačiau statistiškai reikšmingų skirtumų tarp COL8A1 geno VNP rs13095226 CC / CT ir TT genotipų ir refrakcijos sutrikimų nenustatyta (Velazquez-Villora, 2016).

Duomenų trūkumas apie COL8A1 geno VNP rs13095226 ir COL2A1

geno VNP rs1635529 ir trumparegystės sąsajas kitose populiacijose, paskatino atlikti VNP tyrimus Lietuvoje, atsižvelgiant į tiriamųjų trum-paregystės laipsnį ir lytį.

30

3. TYRIMO METODAI

Tyrimai vykdyti Lietuvos sveikatos mokslų universiteto (LSMU) Biolo-ginių sistemų ir genetinių tyrimų instituto (BSGTI) Dr. K. Janušausko ge-netinių tyrimų laboratorijoje ir LSMU Neuromokslų instituto (NI) Oftalmolo-gijos laboratorijoje. Tyrimams atlikti yra gautas Kauno regioninio biomedi-cininių tyrimų etikos komiteto leidimas (BE-2-48) (žr. 1 priedą). Visi tiria-mieji sutiko dalyvauti tyrimuose ir pasirašė asmens informavimo formą (žr. 2 priedą).

3.1. Tiriamųjų imtys

3.1.1. Trumparegystės paveldimumo tyrimuose dalyvavusių tiriamųjų imtis

Į šiuos tyrimus buvo įtraukti LSMU BSGTI „Dvynių centre“ 2004–2014 metais užregistruoti dvyniai (3.1.1.1 pav.). Šiame tyrime buvo vertinti mono-zigotinių (MZ) ir dimono-zigotinių (DZ) dvynių porų akių refrakcijos sferiniai ekvivalentai (SFE). Buvo laikomasi tiriamųjų atmetimo kriterijų.

3.1.1.1 pav. Tyrimų struktūra ir imtys

MZ dvyniai – monozigotiniai dvyniai; DZ dvyniai– dizigotiniai dvyniai; OSA – oftalmologiškai sveiki asmenys.

31 Tiriamųjų atmetimo kriterijai:

1. Katarakta

2. Ankstesnės intervencijos, kurios galėjo paveikti refrakciją 3. Amžius: ≤ 18 ir ≥ 40

4. Atsisakymas dalyvauti tyrime. 3.1.2. Trumparegystės grupė

Tyrime dalyvavo LSMU BSGTI „Dvynių centre“ užregistruoti dvyniai (2004–2014 m., 2016–2017 m.), kurie buvo atrinkti po vieną, pirmą gimusįjį asmenį iš dvynių poros, turintys silpną, vidutinio ar didelio laipsnio trum-paregystę (3.1.1.1 pav.). Hsa-miR-328-3p raiškos tyrimams buvo atrinkti as-menys, turintys didelio ir vidutinio laipsnio trumparegystę (n = 42).

3.1.3. Kontrolinė grupė

Tyrimo kontrolinę imtį sudarė du tiriamųjų pogrupiai:

1. Oftalmologiškai sveiki LSMU BSGTI „Dvynių centre“ užregistruoti dvyniai (2004–2014 m., 2016–2017 m.), kurie buvo atrinkti po vieną, pirmą gimusįjį asmenį iš dvynių poros. Hsa-miR-328-3p raiškos tyrimams buvo atrinkti oftalmologiškai sveiki asmenys, kurie neturėjo jokių širdies ir krau-jagyslių (skilvelių aritmijų, prieširdžių virpėjimo) ar (ir) kvėpavimo (astmos, plaučių vėžio, kvėpavimo takų infekcijų) ligų, kurios gali turėti įtakos hsa-miR-328-3p raiškos lygiui.

2. LSMU Kauno klinikų Akių ligų klinikos NI Oftalmologijos laborato-rijos sveikų asmenų grupė. Šią imtį sudaro pacientai, kuriems išsamiai ištirtas regėjimas ir nenustatyta jokių oftalmologinių sutrikimų. Į šią grupę atrinkti pacientai, atsižvelgiant į pacientų amžių. Taip pat buvo laikomasi prieš tai minėtų tiriamųjų atmetimo kriterijų.

3.2. Refrakcijos tyrimai

Refrakcijos tyrimai buvo atlikti autorefraktometru(Accuref-K9001, Shin-Nippon, Japonija), naudojant 1 proc. ciklopentolato tirpalą. Akių refrakcijos SFE vidurkis buvo skaičiuojamas, taikant standartinę formulę: SFE = sfera + (cilindras/2).

Asmenys, turintys refrakcijos SFE bent vienoje akyje ≥ –0,5 D buvo priskiriami į trumparegystės grupę. Asmenys, turintys abiejų akių refrakcijos SFE ribose tarp 0,49 ir –0,49 D, priskirti į kontrolinę (emetropijos) grupę.

32

Taip pat truparegystės laipsnis buvo apibrėžiamas pagal korekcinio lešio stiprumą arba optinę galią, kuri fokusuoja vaizdą tinklainėje. Akių tyrimų rezultatai buvo užrašomi standartizuotose formose (žr. 3 priedą).

3.3. Dvynių zigotiškumo nustatymas

Dvynių zigotiškumas buvo nustatytas remiantis DNR tyrimais. Zigotiš-kumo nustatymo tyrimai buvo atlikti UAB „SYNLAB“, anksčiau žinomai kaip UAB „SORPO“ medicinos tyrimų centras. Tyrimui buvo naudotas poli-merazės grandininės reakcijos rinkinys: AmpFlSTR® _Identifiler® _(Applied

Biosystems, Foster, CA, JAV), kurio dėka amplifikuoti trumpi tandeminiai pasikartojimai. 15 specifinių DNR buvo naudojama genetinių profilių paly-ginimui: D8S1179, D21S11, D7S820, CSF180, D3S1358, TH01, D13S317, D16S539, D2S1338, D19S433, vWA, TROX, D18S51, D5S818 ir amelo-geninas.

3.4. Genominės DNR išskyrimas

Atliekant tiriamųjų sveikatos patikrinimą, periferinis kraujas buvo paimtas į mėgintuvėlius su EDTA (etilendiamino tetraacetatu) antikoagulentu. Toliau genominės DNR iškyrimas buvo vykdomas dviem metodais: 1) vykdant DNR išskyrimą druskų išsodinimo metodu, 2) naudojant komercinį genominės DNR išskyrimo rinkinį su silikagelio kolonėlėmis.

Genominės DNR išskyrimas druskų išsodinimo metodu

Trumparegystės genetiniams tyrimams, dvynių (žr. 3.1.2 ir 3.1.3 skyrius) DNR buvo išskiriama iš periferinio kraujo, naudojant druskinį metodą (Miller ir kt., 1988).

Genominės DNR išskyrimas kolonėlių metodu

Dalies trumparegystės genetinių tyrimų kontrolinės grupės tiriamųjų (žr. 3.1.3 skyrių) DNR buvo išskirta iš periferinio kraujo, naudojant „Macherey-Nagel GmbH & Co“ (Vokietija) kompanijos reagentų rinkinį „NucleoSpin Blood L Kit“ su kolonėlėmis pagal gamintojo nurodytą darbo protokolą (Ma-cherey-Nagel GmbH & Co. KG, 2010).

3.5. DNR kiekio ir grynumo matavimas

DNR kokybė yra labai svarbi tolimesniuose genetiniuose tyrimuose. DNR kiekio ir grynumo vertinimui buvo naudojamas „NanoDrop™ 2000“

33

(Thermo ScientificTM_{, JAV) spektrofotometras. DNR ir RNR sugeria 260 nm}

ilgio ultravioletinius spindulius. Jei 260/280 nm absorbcijų santykis yra 1,8–2,0, tai rodo, kad DNR yra gryna, nėra baltymų ir kitų priemaišų.

3.6. Genų polimorfizmų tyrimai TL-PGR metodu

GJD2, RASGRF1 PAX6, COL2A1, COL8A1 genų VNP tyrimams buvo

naudoti genotipavimo rinkiniai, kurti „Applied Biosystems“ kompanijos (JAV) (3.6.1 lentelė). Tyrimams atlikti, buvo vykdytas TL-PGR metodas (HT 7900 Applied Biosystems, JAV).

3.6.1 lentelė. TaqManTM _{VNP genotipavimo rinkinių informaciniai duomenys}

Genas Rs numeris Rinkinio ID Pradinė koncentracija

GJD2 rs634990 C_2088259_10 40× RASGRF1 rs8027411 C_1835318_10 40× PAX6 rs662702 C_898192_10 40× COL2A1 rs1635529 C_8725130_10 40× COL8A1 rs13095226 C_26159211_10 40× TL-PGR protokolas:

1. TL-PGR reakcijai, paruošiamas atitinkamo geno: GJD2, RASGRF1,

PAX6, COL2A1, COL8A1 genotipavimo mišinys. Reikalingi reagentai

pa-teikti 3.6.2 lentelėje.

3.6.2 lentelė. TL-PGR reikalingi reagentai

Reagentai Pradinė koncentracija Kiekis 1 reakcijai (µl)

TaqMan® _{Master Mix 2× 6,125}

TaqMan® _{SNP Genotyping Assays 20× 3,75}

Vanduo be nukleazių – 0,625

DNR 20 ng / µl 2

Bendras tūris 12,5

2. Į kiekvieną plokštelės šulinėlį įpilama po 10,5 µl genotipavimo mišinio ir 2 µl DNR mėginio.

3. Ant paruoštos ploštelės užklijuojama skaidri plėvelė.

4. Plokštelė centrifuguojama 10 000 aps / min greičiu, 10–15 s. 5. Plokštelė statoma į įrenginio bloką.

6. Paleidžiama TL-PGR programos: „Alelių nustatymas“ ir „Absoliutus

gau-sinimas“, pagal gamintojo nurodytą protokolą (Applied Biosystem, 2010).

34 3.6.3 lentelė. TL-PGR sąlygos

Etapas Temperatūra (°C) Trukmė Ciklų skaičius

1. 95 10 min. 1

2. 95 15 s. ₄₀

3. 60 60 s.

4. 4 ∞ 1

8. Gauti tyrimo rezultatai buvo analizuojami naudojantis „Applied

Biosys-tems 7500 Real-Time PCR System“ programine įranga „7500 Software v2.0.6“. Pagal skirtingą detektorių fluorescencijos intensyvumo santykį,

buvo nustatyti asmenų genotipai (3.6.1 pav.).

3.6.1 pav. Alelių nustatymo rezultatų diagrama X ašyje buvo pasirinktas VIC,

35

3.7. MiRNR raiškos tyrimai 3.7.1. RNR išskyrimas iš kraujo

Kraujas miRNR raiškos tyrimams buvo renkamas į specialius „Tempus TM

Blood RNA Tubes“ (ThermoFischer Scientific, JAV) mėgintuvėlius su

stabi-lizatoriumi ir šaldomas –80 °C temperatūroje iki tyrimų pradžios. RNR sky-rimui naudojami reagentai ir įranga pateikti 3.7.1.1 lentelėje.

RNR išskyrimas iš kraujo apima 4 etapus: 1) mėginio paruošimas, 2) at-skyrimo fazė, 3) RNR išsodinimas, 4) RNR valymas.

RNR išskyrimo iš kraujo protokolas

3.7.1.1 lentelė. RNR išskyrimui reikalingi reagentai, priemonės, įranga

Reagentai Priemonės Įranga

• Chloroformas • 100 proc. izopropanolis • 75 proc. etanolis • Vanduo be RNazių • Trizolio reagentas (TRIzol® _LS) • Polipropileno mikrocentrifuginiai mėgintuvėliai (be RNazių) • Ependorfiniai mėgintuvėliai

(be RNazių)

• Antgaliai (be RNazių)

• Centrifuga (galinti pasiekti 12 000 × g). • Kaitinimo blokas

55–60 °C. • Mikrodozatoriai

Kraujo mėginio paruošimas 1. Kraujas atšildomas ledo vonelėje.

2. Kraujo mėginiai skiedžiami 1 : 1 vandeniu be RNazių (PASTABA: svarbu tą atlikti, nes kitaip gali būti prarasta reikiama RNR, dėl RNazių poveikio). 3. Dedama 5 pM egzogeninės kontrolės (ath-miR-159a)

4. Į 0,25 ml kraujo mėginį įpilama 0,75 ml „TRIzol® _{LS“ reagento.} Atskyrimo fazė

5. Mėginiai 5 min. inkubuojami kambario temperatūroje.

6. Įpilama 0,2 ml chloroformo ir atsargiai uždaromi mėgintuvėliai. 7. Mėginiai 15 s. stipriai supurtomi.

8. 2–15 min. inkubuojama kambario temperatūroje. 9. Mėginiai centrifuguojami 12 000 × g, 15 min, 4 °C.

PASTABA: mėginys atsiskiria į žemesniąją raudoną fenolio-chloroformo fazę, interfazę ir bespalvę vandeninę fazę. RNR yra vandeninėje fazėje. Šioje fazėje taip pat yra 70 proc. pradinio trizolio, naudoto homogeniza-cijai.

10. Vandeninė fazė surenkama į mėgintuvėlius laikant 45° kampu ir perne-šama į naujus mikrocentrifūginius mėgintuvėlius.

PASTABA: surenkant vandeninę fazę, stengiamasi išvengti interfazės ir organinio sluoksnio).

36 RNR išsodinimas

11. Į mėgintuvėlį su vandenine faze įpilama 0,5 ml 100 proc. izopropanolio. 12. 10 min. inkubuojama kambario temperatūroje.

13. Centrifuguojama 12 000 × g, 10 min., 4 °C. RNR valymas

14. Pašalinamas supernatantas, mėgintuvėlyje lieka tik RNR nuosėdos. 15. RNR plaunama su 1 ml 75 proc. etanoliu.

16. Mėginiia centrifuguojami 7 500 × g, 5 min., 4 °C. Nupilamas superna-tantas.

17. 5–10 min. RNR gumulėlis džiovinamas ore.

18. RNR gumulėlis užpilamas vandeniu be RNazių arba 0,5 proc. SDS tirpalu (20–50 µl).

19. 10–15 min inkubuojama 55–60 °C kaitinimo bloke.

20. Pereinama prie tolimesnės procedūros arba paliekama saugoti –70 °C iki tolimesnių tyrimų.

Po RNR išskyrimo, buvo atliekamas RNR kiekio ir grynumo vertinimas naudojant „NanoDrop™ 2000“ programinę įrangą.

3.7.2. Kopijinės deoksiribonukleininės rūgšties (kDNR) ruošimas RNR mėginiai buvo sintezuojami į kopijinę deoksiribonukleininę rūgštį (kDNR). Reakcijai naudotas „TaqMan® _{Advanced miRNA cDNA Synthesis}

Kit“ rinkinys (Applied Biosystems™, JAV) (3.7.2.1 lentelė). Reakcijos

at-liekamos pagal gamintojo nurodytą protokolą ir rekomendacijas.

3.7.2.1 lentelė. KDNR ruošimui reikalingi reagentai, priemonės ir įranga

Reagentai Priemonės Įranga

• 10× Poly A buferis • ATP, 10 mM • Poly A fermentas, 5U / µl • 5× ligazės buferis • RNR ligazės buferis, 10 U / µl • 50 proc. PEG 8000 • 25× ligazės adaptorius • 10× RT fermentų mišinys • 5× RT buferis

• 20× universalus pradmenų mišinys • dNTP mišinys, 100mMZ

• 20× MiR-Amp pradmenų mišinys • 2× MiR-Amp Master mišinys • Tris-EDTA (TE) buferis, pH 8,0

• Polipropileno mėgintuvėliai • Mikrodozatorių antgaliai • Centrifuga su adapteriais 96 šulinėlių plokštelėms • Mikrocentrifuga • Maišyklė • Mikrodozatoriai • Termocikleris 0,2 ml ir 0,5 ml mėgintuvėliams

37 KDNR ruošimo protokolas

Poliadenilinimo reakcija (angl. poly(A) tailing)

1. Reagentai atšildomi ledo bloke. Naudojant maišykle išmaišomi, pašali-nami oro burbulai.

2. Ruošiamas reakcijos mišinys iš reagentų, nurodytų 3.7.2.2 lentelėje. PASTABA: dirbant su RNR mėginiais siekiama išvengti užteršimo RNazėmis, todėl griežtai laikomasi gamintojo nurodymų).

3. Į kiekvieną ruošiamą reakcijai mėgintuvėlį įpilama po 2 µl RNR ir 3 µl poliadenilinimo reakcijos mišinio (bendras tūris 5 µl).

PASTABA: į kiekvieną mėgintuvėlį įdedama RNazių inhibitoriaus, sie-kiant sumažinti užteršimo galimybę RNazėmis).

3.7.2.2 lentelė. Poliadenilinimo reakcijos ruošimui reikalingi reagentai

Reagentai Kiekis 1 reakcijai (µl)

10× Poly A buferis 0,5

ATP, 10 mM 0,5

Poly A fermentas, 5 U / µl 0,3

Vanduo be RNazių 1,7

Bendras tūris 3

4. Mėgintuvėliai uždaromi ir kelias sekundes maišomi maišykle.

5. Mėgintuvėliai dedami į termociklerį ir inkubuojami nurodytomis sąlygo-mis (3.7.2.3 lentelė).

6. Pasibaigus poliadenilinimo reakcijai, nedelsiant atliekama ligacijos reak-cija.

3.7.2.3 lentelė. Poliadenilinimo reakcijos sąlygos

Etapas Temperatūra (°C) Trukmė

1. Poliadenilinimas 37 45 min.

2. Baigties reakcija 65 10 min.

3. Laikymas 4 ∞

Ligacijos reakcija

7. Paruošiamas reagentų mišinys, kaip nurodyta 3.7.2.4 lentelėje. 8. Ligacijos reakcijos mišinys maišomas maišykle, centrifuguojamas.

9. Į kiekvieną mėgintuvėlį, kuriame yra poliadenilinimo reakcijos produkto, pilama po 10 µl ligacijos reakcijos mišinio (bendras tūris: 15 µl).

10. Uždaromi mėgintuvėliai, maišomi maišykle, centrifuguojami.

PASTABA: svarbu užtikrinti tinkamą maišymą, kad ligacijos reakcija vyktų efektyviai).