LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
Vytis Čižinauskas
LIPOSOMINIŲ NANO–NEŠIKLIŲ SU
DIHIDROKVERCETINU MODELIAVIMAS,
CHARAKTERIZAVIMAS IR
GALIMYBIŲ PRITAIKYTI APSAUGAI
NUO UV SPINDULIUOTĖS POVEIKIO
TYRIMAS
Daktaro disertacija Biomedicinos mokslai,
farmacija (08B)
Disertacija rengta 2013–2018 metais Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos Klinikinės farmacijos katedroje.
Mokslinis vadovas
prof. dr. Vitalis Briedis (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, biome-dicinos mokslai, farmacija – 08B).
Disertacija ginama Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos Farmacijos mokslo krypties taryboje.
Pirmininkė
prof. dr. Jurga Bernatonienė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, biomedicinos mokslai, farmacija – 08B).
Nariai:
prof. dr. Sonata Trumbeckaitė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, biomedicinos mokslai, farmacija – 08B);
prof. dr. Ramunė Morkūnienė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, biomedicinos mokslai, farmacija – 08B);
prof. dr. Eugenijus Valatka (Kauno technologijos universitetas, techno-logijos mokslai, chemijos inžinierija – 05T);
prof. dr. Jouni Hirvonen (Helsinkio universitetas, biomedicinos mokslai, farmacija – 08B).
Disertacija ginama viešame farmacijos mokslo krypties tarybos posėdyje 2018 m. rugpjūčio 29 d. 11 val. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto „Santakos“ slėnio Naujausių farmacijos ir sveikatos technologijų centro 205 auditorijoje.
LITHUANIAN UNIVERSITY OF HEALTH SCIENCES MEDICAL ACADEMY
Vytis Čižinauskas
MODELING OF LIPOSOMAL
NANO-CARRIERS WITH
DIHYDROQUERCETIN,
THEIR CHARACTERISATION AND
PHOTOPROTECTIVE PROPERTIES
EVALUATION
Doctoral Dissertation Biomedical Sciences, Pharmacy (08B) Kaunas, 2018Dissertation has been prepared at the Department of Clinical Pharmacy of Medical Academy of Lithuanian University of Health Sciences during the period of 2013–2018.
Scientific Supervisor
Prof. Dr. Vitalis Briedis (Lithuanian University of Health Sciences, Biomedical Sciences, Pharmacy – 08B).
Dissertation is defended at the Pharmacy Research Council of the Lithua-nian University of Health Sciences.
Chairperson
Prof. Dr. Jurga Bernatonienė (Lithuanian University of Health Sciences, Biomedical Sciences, Pharmacy – 08B).
Members:
Prof. Dr. Sonata Trumbeckaitė (Lithuanian University of Health Sciences, Biomedical Sciences, Pharmacy – 08B);
Prof. Dr. Ramunė Morkūnienė (Lithuanian University of Health Sciences, Biomedical Sciences, Pharmacy – 08B);
Prof. Dr. Eugenijus Valatka (Kaunas University of Technology, Techno-logical Sciences, Chemical Engineering – 05T);
Prof. Dr. Jouni Hirvonen (University of Helsinki, Biomedical Sciences, Pharmacy – 08B).
Dissertation will be defended at the open session of the Pharmacy Research Council of Lithuanian University of Health Sciences on the 29th of
August, 2018 at 11 a.m. in the 205 auditorium of “Santaka” Valley Center for the Advanced Pharmaceutical and Health Technologies.
TURINYS
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS... 8
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12
1.1. UV spinduliuotės poveikis ir apsisaugojimo būdai ... 12
1.1.1. Molekuliniai UV spinduliuotės sukeliamo poveikio mechanizmai ... 13
1.1.2. Apsauginių priemonių nuo UV spinduliuotės efektyvumo vertinimas ... 15
1.1.3. Išoriškai vartojamos priemonės, apsaugančios nuo UV spinduliuotės poveikio ... 16
1.2. Augalinės kilmės medžiagų pritaikymas apsaugai nuo UV spinduliuotės... 18
1.2.1. Dihidrokvercetino fizikinės–cheminės savybės ir biologinis poveikis ... 18
1.2.2. Augalinių aliejų pritaikymas apsaugai nuo UV spinduliuotės poveikio ir dihidrokvercetino skvarbos į odą gerinimui ... 20
1.3. Liposomos ir jų pritaikymas veikliųjų medžiagų pernašai į odą ... 20
1.3.1. Liposomų privalumai ir trūkumai ... 20
1.3.2. Liposomų skvarbos į odą mechanizmai ... 22
1.3.3. Liposomas sudarantys komponentai ir liposomų tipai ... 23
1.3.4. Liposomų gamybos metodai ... 26
1.3.5. Liposomų kokybės vertinimo kriterijai ir metodai ... 28
1.4. Literatūros apžvalgos apibendrinimas ... 32
2. TYRIMO OBJEKTAS IR METODAI ... 34
2.1. Tyrimo objektas ... 34
2.2. Reagentai ir medžiagos ... 34
2.3. Laboratorinė įranga ... 35
2.4. Tyrimo metodai ... 37
2.4.1. Saulės apsauginio faktoriaus nustatymas ... 37
2.4.2. Dihidrokvercetino kiekybinis nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 38
2.4.4. Dihidrokvercetino tirpumo nustatymas ... 47
2.4.5. Augalinių aliejų riebalų rūgščių sudėties nustatymas ... 47
2.4.6. Lipidinių nešiklių gamyba ... 48
2.4.7. Lipidinių nešiklių liofilizacija ... 49
2.4.8. Lipidinių nešiklių fizikinių–cheminių savybių nustatymas ... 49
2.4.9. Dihidrokvercetino įterpimo į lipidinius nešiklius efektyvumo tyrimai ... 50
2.4.10. Dihidrokvercetino atpalaidavimo iš lipdinių nešiklių in vitro
tyrimai ... 51
2.4.11. Lipidinių nešiklių stabilumo tyrimas ... 51
2.4.12. Skvarbos į žmogaus odą ex vivo tyrimai ... 52
2.4.13. Kiekybinis dihidrokvercetino skvarbos į odą nustatymas ... 53
2.4.14. Žmogaus odos mėginių analizė antrinių jonų skrydžio laiko masių spektrometrijos metodu ... 55
2.4.15. Dihidrokvercetino ir lipidinių nešiklių savybių vertinimas naudojant ląstelių kultūras in vitro ... 57
2.4.16. Statistinis duomenų vertinimas ... 60
3. REZULTATAI ... 61
3.1. Dihidrokvercetino apsauginių savybių nuo UV spinduliuotės vertinimas ... 61
3.2. Dihidrokvercetino skvarbą į odą gerinančių medžiagų atranka ... 65
3.2.1. Dihidrokvercetino skvarbą į odą gerinančios augalinių aliejų savybės ... 66
3.2.2. Riebalų rūgščių skvarbos į odą savybės ... 67
3.3. Lipidinių nano–nešiklių formulavimas ir vertinimas ... 68
3.3.1. Lipidinių nešiklių formulavimas plono lipidų sluoksnio drėkinimo metodu ... 69
3.3.2. Lipidinių nešiklių formulavimas, pritaikant tiesioginio sonikavimo ultragarso zondu metodą ... 90
3.4. Biofarmacinis lipidinių nešiklių vertinimas ... 96
3.4.1. Dihidrokvercetino atpalaidavimas iš lipidinių nešiklių in vitro ... 96
3.4.2. Dihidrokvercetino lipidinių nešiklių skvarba į žmogaus odą ex vivo ... 98
3.5. Lipidinių nešiklių efektyvumo, apsaugant nuo UV spinduliuotės, vertinimas in vitro ... 100
3.5.1. Lipidinių nešiklių citotoksiškumo vertinimas ... 100
3.5.2. Lipidinių nešiklių apsauginių savybių nuo UV spinduliuotės biologinis vertinimas ... 102
IŠVADOS ... 109
BIBLIOGRAFIJOS SĄRAŠAS ... 111
DISERTACIJOS TEMA PASKELBTŲ PUBLIKACIJŲ SĄRAŠAS ... 128
SUMMARY ... 157
PRIEDAI ... 183
CURRICULUM VITAE ... 186
SANTRUMPOS
AR – Aptikimo riba
NR – Kiekybinio nustatymo riba
LN – Lipidinis, liposominio tipo nešiklis DHK – (+)-dihidrokvercetinas
DLS – dinaminės šviesos sklaida EM – elektronų mikroskopija PEG 400 – Polietilenglikolis 400 UV – Ultravioletiniai spinduliai
UVA – 400–315 nm bangos ilgio ultravioletiniai spinduliai UVB – 315–280 nm bangos ilgio ultravioletiniai spinduliai VDD – Vidutinis dalelių dydis
PDI – Dalelių polidispersiškumo indeksas ANOVA – Vienfaktorinė dispersinė analizė Aps/min – Apsisukimų skaičius per minutę DNR – Deoksiribonukleorūgštis
RNR – Deoksiribonukleorūgštis
IE – Dihidrokvercetino įterpimo į lipidinius nešiklius efektyvumas EI – Ekstrakcijos išgava
ESC – Efektyvioji skysčių chromatografija m/z – Masės/krūvio santykis
Mr – Molekulinė masė
NAD(P)H – Nikotinamido adenino dinukleotido fosfatas PAM – Paviršiui aktyvi medžiaga
R2 – Determinacijos koeficientas
Rs – Chromatogramos smailių atskyrimo koeficientas RR – Riebalų rūgštis
SPF – saulės apsauginis faktorius (angl. Sun protection factor) SSN – Santykinis standartinis nuokrypis
SN – Standartinis nuokrypis SS – Skatinimo santykis Rt – Sulaikymo laikas
ROS – Reaktyvūs deguonies junginiai (angl. reactive oxygen species) ζ – Paviršiaus dzeta potencialas
ĮVADAS
Odos vėžys, fotosenėjimas ir fotoimunosupresija yra tiesiogiai siejami su UV spinduliuotės poveikiu žmogaus odai. Remiantis Lietuvos Higienos instituto duomenimis, Lietuvoje nustatomų odos vėžio atvejų nuolat daugėja: 2013 metais buvo nustatyta 8682 odos vėžio atvejai, o pagal 2017 metų išankstinius duomenis jau 10175 atvejai [87]. UV spinduliuotė sukelia speci-fines DNR pažaidas, dėl kurių odoje vyksta fotosenėjimo ir karcinogenezės procesai [129]. Ji taip pat veikia odos struktūrinių elementų integralumą bei sukelia reaktyvių deguonies junginių (ROS) susidarymą, kurie netiesiogiai sukelia DNR pažaidas ir organizmo fotoimunosupresiją [93]. Nuo žalingo UV spinduliuotės poveikio žmogaus odos ląsteles galima apsaugoti slopinant UV spinduliuotės sukeliamus patogenezės procesus arba naudojant UV spin-duliuotę atspindinčias ar sugeriančias medžiagas.
Rinkoje esančių, išoriškai vartojamų apsauginių produktų nuo UV spin-duliuotės poveikio efektyvumas yra ribotas [63]. Tyrimai, atliekami su Eu-ropoje registruotais apsauginių priemonių nuo UV spinduliuotės veikliaisiais komponentais rodo, jog dalis šių komponentų nėra fotostabilūs, gali skverbtis į odą bei sukelti toksines ir fototoksines reakcijas [96, 138]. Su apsauginių priemonių nuo UV spinduliuotės vartojimu siejamos ir aplinkosauginės prob-lemos, nes šie produktai kaupiasi jautriose ekosistemose [69, 181]. Ribotas rinkoje esančių produktų efektyvumas ir saugumas skatina ieškoti naujų veikliųjų medžiagų, kurios apsaugotų nuo UV spinduliuotės ją sugerdamos ar atspindėdamos, būtų draugiškos aplinkai ir kartu galėtų saugiai slopinti UV spinduliuotės sukeliamus patogenezės procesus.
Augalinės kilmės medžiagos pasižymi antioksidacinėmis savybėmis, slo-pina karcinogenezės mechanizmus, yra saugios aplinkai ir retai sukelia šaluti-nes reakcijas. Remiantis paskelbtais mokslinių tyrimų rezultatais, gamtoje aptinkamų polifenolių savybės laikomos tinkamiausiomis siekiant apsaugoti žmogaus odą nuo žalingo UV spinduliuotės poveikio [23]. Tiriamajame darbe buvo pasirinktas polifenolių grupės junginys – flavanonas dihidrokvercetinas (DHK), aptinkamas margainio, Pycnogenol® ir daugelio kitų medicinoje nau-dojamų augalinių ekstraktų sudėtyje kaip priemaiša [52, 156, 207]. Fizikinės– cheminės DHK savybės rodo, kad šis junginys turi absorbcijos maksimumus UVC, UVB ir UVA spinduliuotės spektruose ir pasižymi priešuždegiminėmis [115, 210], odos pigmentaciją mažinančiomis [10], navikų susidarymą slopi-nančiomis [146], apsaugančiomis nuo oksidacinio pobūdžio DNR pažaidų [125] ir UV spinduliuotės indukuotos odos karcinogenezės [144] savybėmis. DHK apsauga nuo UV spinduliuotės patvirtina, jog šis junginys gali veikti
tiek sugerdamas UV spinduliuotę tiek slopindamas UV spinduliuotės suke-liamų pažaidų susidarymą.
DHK apsauginės savybės veikiant į UV spinduliuotės sukeliamus pato-genezės procesus gali būti pritaikomos tik užtikrinus jo skvarbą į odos epider-mio ir dermos sluoksnius. Lipidinių nano–nešiklių, su skvarbą gerinančiomis medžiagomis, pritaikymas DHK pernašai į odą gali užtikrinti efektyvų jo pasiskirstymą odos sluoksniuose [11]. Augaliniai aliejai yra augalinės kilmės medžiagos galinčios pasižymėti fotoapsauginėmis ir skvarbą gerinančiomis savybėmis [103, 124, 204]. Galimas sinerginis poveikis, apsaugant nuo UV spinduliuotės poveikio, ir skvarbą į odą gerinančios savybės skatina atlikti tyrimus su DHK ir augaliniais aliejais bei jų sudėtyje aptinkamomis riebalų rūgštimis. Su atrinktomis DHK skvarbą gerinančiomis medžiagomis tikslinga modeliuoti lipidinius nano–nešiklius ir įvertinti jų savybes. Sumodeliuotų formuluočių skvarbos į žmogaus odą ex vivo ir apsauginių savybių nuo UV spinduliuotės poveikio tyrimų rezultatų vertinimas leidžia prognozuoti paga-mintų sistemų efektyvumą vartojant ant odos ir apsaugant nuo UV spindu-liuotės poveikio.
Darbo tikslas
Sumodeliuoti liposomines nano–struktūrines sistemas, skirtas dihidro-kvercetino pernašai į odą ir biologiniais tyrimais įvertinti jų efektyvumą, ap-saugant nuo UV spinduliuotės poveikio.
Darbo uždaviniai:
1. Ištirti ir įvertinti apsauginį dihidrokvercetino poveikį nuo UV spindu-liuotės tyrimais in vitro su ląstelių kultūromis.
2. Atlikti augalinės kilmės medžiagų, gerinančių dihidrokvercetino skvar-bą į odą atranką.
3. Sumodeliuoti liposomines nano–struktūrines sistemas su dihidrokver-cetinu ir atrinktomis skvarbą gerinančiomis medžiagomis, atlikti sudė-ties optimizavimą bei įvertinti jų kokybę.
4. Atlikti biofarmacinį eksperimentinių formuluočių charakterizavimą ir įvertinti veikliosios medžiagos skvarbą į odą ex vivo.
5. Įvertinti apsaugines eksperimentinių formuluočių savybes nuo UV spin-duliuotės, tyrimais in vitro su ląstelių kultūromis.
Mokslinio darbo naujumas. Mokslinio darbo naujumas grindžiamas
di-hidrokvercetino pritaikymu apsaugai nuo UV spinduliuotės sukeliamo ža-lingo poveikio, kryptinga dihidrokvercetino skvarbą į odą gerinančių
medžia-gų atranka ir liposominių sistemų dihidrokvercetino pernašai į odą pritai-kymu, kurių tinkamumas buvo įvertintas fizikiniais–cheminiais, biofarma-ciniais ir biologiniais tyrimais.
Pirmą kartą suformuluotos liposominės sistemos su dihidrokvercetinu, kurių taikymas – išorinė ir gilesnių odos sluoksnių apsauga nuo žalingo UV spinduliuotės poveikio. Pirmą kartą įvertinta dihidrokvercetino skvarba į nepažeistą žmogaus odą iš sumodeliuotų liposominių nešiklių tyrimais ex vivo.
Pirmą kartą atliktas detalus riebalų rūgščių skvarbos iš natūralių aliejų į odą ex vivo vertinimas, taikant masių spektrometrijos biovaizdinimo metodą. Kartu atliktas aliejų savybių, gerinant dihidrokvercetino skvarbą į odą, nusta-tymas leido atrinkti efektyviai dihidrokvercetino skvarbą į odą gerinantį sojų pupelių aliejų.
Pirmą kartą atliktas detalus pavienių riebalų rūgščių įtakos endogeninių odos ex vivo riebalų rūgščių persiskirstymui tyrimas, taikant masių spektro-metrijos biovaizdinimo metodą.
In vitro tyrimai su ląstelių kultūromis patvirtino liposominių sistemų įtaką didinant dihidrokvercetino efektyvumą, apsaugai nuo UV spinduliuotės sukeliamo poveikio.
Praktinė ir teorinė reikšmė. Augalinių aliejų riebalų rūgščių skvarbos į
odą biovaizdinimo ir dihidrokvercetino skvarbos į odą skatinimo tyrimai patvirtino, kad aliejų riebalų rūgščių sudėtis turi reikšmingą įtaką veikliosios medžiagos skvarbos į odą skatinimui.
Pavienių riebalų rūgščių skvarbos į odą biovaizdinimo tyrimai patvirtino, jog skvarbą gerinančios riebalų rūgštys veikia endogeninių riebalų rūgščių persiskirstymą odoje. Praktiškai išnagrinėti riebalų rūgščių skvarbos į odą ir poveikio endogeninėms riebalų rūgštims mechanizmai.
Ex vivo skvarbos į odą tyrimų rezultatai patvirtino, kad dihidrokvercetino skvarbai ir pasiskirstymui tarp epidermio ir dermos turi įtakos liposominio tipo formuluotės sudėtis. Pritaikius liposomas su skvarbą gerinančiomis auga-linės kilmės medžiagomis kaip efektyvų nešiklį, nustatyta geresnė dihidro-kvercetino skvarba į dermą. Gauti biofarmacinių tyrimų in vitro ir ex vivo rezultatai yra reikšmingi vertinant sumodeliuotų liposomų su dihidro-kvercetinu kokybę bei kuriant tikslinio pritaikymo lipidinius nano–struk-tūrinius nešiklius.
Efektyvumo apsaugant ląstelių kultūras in vitro nuo dėl UV spinduliuotės susidarančių reaktyvių junginių poveikio tyrimai patvirtino liposominių nešiklių tinkamumą, siekiant padidinto veikliosios medžiagos efektyvumo.
Darbo rezultatų aprobavimas. Tyrimų rezultatai paskelbti 7 mokslinėse
konferencijose: 6th BBBB Conference on pharmaceutical sciences „Strate-gies to improve the quality and performance of modern drug delivery systems“ (2015 m. rugsėjo 10–12 d., Helsinkis, Suomija); The 6th Inter-national Pharmaceutical Conference "Science and Practice 2015" (2015 m. lapkričio 5–6 d., Kaunas, Lietuva); PBP World Meeting – 10th World Mee-ting on Pharmaceutics, Biopharmaceutics and Pharmaceutical Technology (2016 m. balandžio 4–7 d., Glazgas, Škotija); The Vital Nature Sign: 10th International Scientific Conference "The Vital Nature Sign" : May 19–20, 2016, Vilnius, Lithuania (2016 m. gegužės 19–20 d., Vilnius, Lietuva); The 7th International Pharmaceutical Conference "Science and practice 2016", dedicated to the 240th anniversary of prof. Johann Friedrich Wolfgang (2016 m. spalio 20–21 d., Kaunas, Lietuva); 2nd European conference on Pharmaceutics (2017 m. balandžio 3–4 d., Krokuva, Lenkija); The Vital Nature Sign : 11th International scientific conference "The Vital Nature Sign" (2017 m. spalio 19–20 d., Vilnius, Lietuva).
Tyrimų tematika paskelbti 2 moksliniai straipsniai, kurie išspausdinti leidiniuose, įtrauktuose į Mokslinės informacijos instituto duomenų bazę.
Darbo apimtis ir struktūra: disertaciją sudaro įvadas, literatūros
ap-žvalga, tyrimo objektas ir metodai, rezultatai ir jų aptarimas, išvados, bib-liografijos sąrašas (217 šaltinių), disertacijos tema paskelbtų publikacijų są-rašas, sumodeliuotų formuluočių sudėtys, mokslinių publikacijų disertacijos tema kopijos, santrauka (anglų k.), mokslinės ir kūrybinės veiklos aprašymas ir padėka. Darbe pateiktos 14 lentelių, 4 lygtys ir 52 paveikslai. Disertacijos apimtis 187 puslapiai.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. UV spinduliuotės poveikis ir apsisaugojimo būdai
Ultravioletinė spinduliuotė (UV) yra skirstoma į tris tipus pagal bangos ilgius: UVC (200–280 nm), UVB (290–320 nm) ir UVA (320–400 nm) [20]. UVB ir UVC spinduliuotės tipai yra pavojingiausi žmogaus organizmui, nes pasižymi didžiausia energija ir apima didžiausios DNR sugerties spektrą [93]. Pagrindinis ir didžiausias UV spinduliuotės šaltinis yra Saulė. UV spektro spinduliuotę itin gerai atspindi Žemės atmosfera, todėl paviršių pasiekia tik apie 5 proc. visos UV spinduliuotės. Ją sudaro 5 proc. UVB ir 95 proc. UVA spinduliuotės [71]. Greineris su kolegomis teigia, jog UVA ir UVB spin-duliai, pasiekiantys Žemės paviršių, gali sukelti žmogaus odos ląstelių apop-tozę, nekrozę ar nekontroliuojamą mutavusių ląstelių dauginimąsi žmogaus odoje [79].
UV spinduliuotės poveikis žmogaus odai yra tiesiogiai siejamas su mela-nomų ir kitų tipų odos vėžių pasireiškimo rizika. Saikingas UV spinduliuotės kiekis yra naudingas žmogui dėl: teigiamo poveikio serotonino – melanino sistemai; endogeninio vitamino D gamybos; endorfinų išsiskyrimo ir auto-imuninių procesų supresijos [144]. Vasaros ar atostogų metu, teigiamą po-veikį sukeliantis UV spinduliuotės kiekis dažnai viršijamas, todėl saulės spinduliuotė tampa žalinga, gali sukelti eritemą, paskatinti fotosenėjimo procesus ir padidinti riziką susirgti odos vėžiu [213]. Norint sumažinti riziką susirgti odos vėžiu, dėl UV spinduliuotės poveikio, siūlomi šie apsaugos būdai: 1) spinduliuotės vengimas; 2) drabužių ir apdangalų, apsaugančių nuo UV spinduliuotės dėvėjimas 3) išoriškai vartojamų apsauginių produktų nuo UV spinduliuotės poveikio naudojimas [79]. Mokslinėje literatūroje teigiama, kad žmogaus oda turi natūraliai susiformavusius mechanizmus, apsaugančius nuo UV spinduliuotės poveikio [97]. Natūralūs mechanizmai suteikia tik trumpalaikę apsaugą, o siekiant ilgalaikės apsaugos tikslinga naudoti išorines apsaugos priemones.
Nepaisant nedidelio žemę pasiekiančio UV spinduliuotės kiekio, ji yra pagrindinis odos karcinogenezės veiksnys. Nevengiant UV spinduliuotės, žalingą UV spinduliuotės poveikį gali sumažinti tik išoriškai vartojamos apsauginės priemonės.
1.1.1. Molekuliniai UV spinduliuotės sukeliamo poveikio mechanizmai
UV spinduliuotė gali sukelti tris tarpusavyje susijusias būsenas – foto-imunosupresiją, fotosenėjimą ir fotokarcinogenezę. Fotoimunosupresija sie-jama su sisteminiu UV spinduliuotės poveikiu, pasireiškiančiu per antigenus gaminančių Langerhanso ląstelių sumažėjimą, imunosupresinių mediatorių išsiskyrimo skatinimą, imunines reakcijas reguliuojančių T-tipo ląstelių persiskirstymą ir molekulinius pokyčius [56]. Tuo tarpu, fotosenėjimas yra procesas, kuris vyksta dėl odos ląstelių ir tarpląstelinės matricos pažeidimų. Ląstelės greičiau sensta ir oda netenka savo funkcinių savybių [109, 139]. Fotokarcinogenezė priklauso nuo genetinio polinkio sirgti odos vėžiu, tačiau jos patogenezėje visada vyksta fotoimunosupresija ir fotosenėjimas [72, 79, 189]. Šie procesai yra neatsiejami vienas nuo kito, todėl siekiant juos sustabdyti, tikslinga apžvelgti jų patogenezės mechanizmus.
Brohemas ir kiti teigia, jog UVB spinduliuotė daugiausiai veikia viršutinį odos sluoksnį – epidermį, o UVA spinduliuotė – gilesnius sluoksnius – dermą [26]. UV spinduliuotės fizikinės savybės (bangos ilgis ir energija) nulemia tai, jog UVB spinduliuotė nepasiekia dermos sluoksnio, tuo tarpu UVA spinduliai prasiskverbia iki viršutinių dermos sluoksnių. Pasak Lisby ir kitų, UVB spinduliuotė yra nuo 1000 iki 10000 kartų mutageniškesnė nei UVA spinduliuotė žmogaus ląstelėms [118].
UV spinduliuotės žalingas poveikis žmogaus organizme pasireiškia DNR pažaidomis, reaktyvių deguonies junginių formavimusi ir fotoimunosupresija [93]. DNR yra pagrindinis UVB ir UVA spinduliuotės indukuojamų pažaidų taikinys. Veikiant UV spinduliuotei DNR pažaidos susidaro tiesiogiai, dėl absorbuotos spinduliuotės, arba per netiesioginio poveikio mechanizmus [82]. DNR grandinei tiesiogiai absorbuojant UV spinduliuotės fotonus, toje pačioje polinukleotidų grandinėje susidaro kovalentinės jungtys tarp greta esančių pirimidino bazių – timino (T) arba citozino (C). Dėl šių jungčių su-sidaro trys DNR pažaidų tipai: ciklobutano pirimidino dimerai (CPD), pirimidino – pirimidono fotoproduktai (6-4 PP) ir Devaro valentiniai izomerai [32]. Šios pažaidos laikomos specifinėmis UV spinduliuotės sukeliamomis DNR pažaidomis.
UVB spinduliuotė sukelia didesnį fotopažaidų kiekį nei UVA spinduliuotė dėl aukštesnio energijos lygmens. Veikiant UVB spinduliuotei susidaro visų tipų fotoproduktai, o UVA spinduliuotės poveikyje nesusidaro 6-4 PP [49, 133]. Mokslinių tyrimų duomenimis, 6-4 PP yra laikomi labiau mutageniškais nei CPD ir jų ląstelėse susidaro iki 10 kartų mažiau nei CPD [64]. Tai paaiškina didesnį UVB spinduliuotės mutageniškumą. Svarbu pastebėti, kad 6-4 PP šalinimas ląstelėse įvyksta per 24 valandas, tuo tarpu CPD ir Devaro
valentiniai izomerai ląstelėse išlieka keletą dienų [150]. UVA spindulių po-veikyje 6–4 PP gali virsti į Devaro valentiniais izomerais, kurie ląstelėse išlieka ilgiausiai [32].
Žmogaus organizmą nuolat veikia abiejų tipų, UVA ir UVB, spin-duliuotės, todėl susidaro visos paminėtos DNR pažaidos. Susidarančių DNR pažaidų kiekio vertinimas yra vienas iš rodiklių, parodančių apsauginių prie-monių nuo UV spinduliuotės poveikio efektyvumą.
Netiesioginio poveikio DNR pažaidos susidaro dėl endogeninių odos chro-moforų, tokių kaip trans–urokaninė rūgštis, citochromai, flavinas, hemas, NAD(P)H, porfirinai ir kolagenas, absorbuotos UV spinduliuotės [31]. UVB spinduliuotė, dėl savo reaktyvumo, sukelia DNR pažaidas tiek tiesiogiai tiek netiesiogiai. Tuo tarpu UVA spinduliuotės poveikio mechanizmas daugiau siejamas su netiesioginių pažaidų susidarymu, nes UVA spektro spinduliuotę stipriau sugeria endogeniniai chromoforai nei DNR [169]. Chromoforams absorbuojant UV spinduliuotę, jos energija gali būti tiesiogiai perkeliama į DNR arba į molekulinį deguonį. Energijai pasiekus molekulinį deguonį, susidaro reaktyvūs deguonies junginiai (ROS) [154]. Susidariusiems ROS reaguojant su odoje esančiu azoto monoksidu susidaro stiprus oksidatorius peroksinitritas. Peroksinitritas sukelia melanino degradaciją iki dioksetano, kuris dėl savo lipofiliškumo gerai skverbiasi pro ląstelių membranas, pasiekia branduolius ir perduoda aukšto sužadinimo energiją į pirimidino bazes, esančias DNR grandinėje. Taip netiesioginiu būdu indukuojamas CPD for-mavimasis [154].
Susidarę ROS paveikia ne tik DNR, bet ir biologines membranas, citoplazminius ląstelių baltymus ir lipidus. Vykstanti lipidų peroksidacija ir amino rūgščių oksidacija sukelia negrįžtamus pokyčius ląstelėse ir indukuoja tolimesnes pažaidas. Pažeidžiami ir baltymai reikalingi DNR pažaidų atsta-tymui ir susidaro ydingas besireplikuojančių pažaidų ratas [151]. Sutrinka DNR nukleotidų šalinimo mechanizmas, susidariusios pažaidos nešalinamos ir tampa premutageniškomis [5, 127]. Dėl nepašalintų pažaidų atsiranda klai-dos vykstant DNR replikacijai.
Dažniausiai pasitaikančios DNR replikacijos klaidos yra nukleotidų persistūmimas C→T arba grupinės mutacijos CC→TT p53 geno, slopinančio auglių susidarymą, raiškoje. Jos laikomos specifinėmis UVB spinduliuotės sukeltomis pažaidomis. Pažeista p53 geno funkcija pažeidžia ląstelės ciklą ir leidžia ląstelėms replikuotis nepašalinus susidariusių pažaidų, taip padidinant tolimesnę mutacijų riziką [129]. Su šiomis pažaidomis tiesiogiai siejama odos vėžio karcinogenezės rizika: C→T bei CC→TT mutacijos nustatomos sura-gėjusių ląstelių karcinomose ir aktininės keratozės ląstelėse, o bazinių ląstelių karcinomose ir odos melanomose, p53 taškinės C→T mutacijos nustatomos joms progresuojant [94]. UV spinduliuotės sukeliamos DNR mutacijos ir jų
pasireiškimas odos vėžio patogenezėje, patvirtina reikšmingą UV spin-duliuotės sukeliamų pažaidų įtaką odos vėžio pasireiškimui.
Siekiant užkirsti kelią pažaidų dėl UV spinduliuotės poveikio susidarymui, reikia apsaugoti odą nuo UV spinduliuotės poveikio ją sugeriant, atspindint išoriškai arba veikiant į pažaidų patogenezės mechanizmus. Odą nuo tiesio-ginio UV spinduliuotės poveikio gali apsaugoti UV filtrai. Siekiant poveikio į UV sukeliamų pažaidų patogenezės mechanizmus, reikalingos medžiagos, kurios pasiskirstytų odos epidermyje bei dermoje ir slopintų arba neutra-lizuotų susidarančius ROS.
1.1.2. Apsauginių priemonių nuo UV spinduliuotės efektyvumo vertinimas
Europoje galiojančios rekomendacijos nurodo, jog apsauginių priemonių nuo UV spinduliuotės efektyvumas turi būti vertinamas naudojant in vitro spektroskopinius metodus pagal absorbuotą spinduliuotės kiekį [60]. Pagal šviesos bangų absorbciją yra skaičiuojamos saulės apsauginio faktoriaus (SPF) ir apsauginio faktoriaus nuo UVA spinduliuotės poveikio (PF-UVA) reikšmės. Iš SPF ir PF-UVA faktorių gaunamas išvestinis rodiklis – SPF/PF-UVA santykis. Dažnai nurodomas ir kritinis sugeriamų bangų ilgis, atitinkantis apsauginės priemonės UV spektro sugerties maksimumus. Šie metodai yra pakankami kosmetinių priemonių tyrimams, nes jų apsauginės savybės veikia tik odos išorėje.
In vitro metodai suteikia pakankamai informacijos komercinių formu-luočių modeliavimui, tačiau yra nuolatos kritikuojami dėl savo ribotumo ir neatitikimo su duomenimis in vivo [19, 51, 175]. Naujų fotoapsauginių me-džiagų tyrimams dažnai naudojami biologiniai tyrimai su ląstelių kultūromis in vitro, kuriais galima įvertinti veikliųjų medžiagų veikiančių į UV pažaidas poveikį molekuliniame lygmenyje. Tokiems tyrimams svarbu pasirinkti ląsteles, kurios atitiktų pagrindines tikslinius audinius sudarančias ląsteles ir pasirinkti ar bus vertinami tiesioginiai UV pažaidų žymenys (CPD, 6-4 PP) ar netiesioginiai, tokie kaip ROS [32, 154].
Žmogaus odos epidermį daugiausiai sudaro keratinocitų ląstelės. Stabili transformuota adherentinė žmogaus keratinocitų ląstelių linija HaCaT yra dažnai naudojama, kaip modelis UV spinduliuotės poveikiui tirti. Ši ląstelių linija gali neribotai daugintis ir pasižymi keratinizavimosi, augimo, lipidų kompozicijos ir sintezės savybėmis, atitinkančiomis pirminių žmogaus keratinocitų savybes [24, 178]. HaCaT ląstelių genomas turi dvi taškines p53 geno, kuris atsakingas už apoptotinį atsaką į UVB iradiaciją, mutacijas. Henseleito ir kitų tyrimai parodė, kad HaCaT ląstelės pasižymi panašaus stiprumo apoptotiniu atsaku į UVB spinduliuotę kaip ir ląstelės, turinčios
laukinio tipo, nepakeistą p53 geną ir yra tinkamos UVB apsauginių savybių vertinimui [85].
Odos dermos sluoksnio pagrindinės ląstelės yra fibroblastai. Dermos modeliui plačiai naudojama adherentinė fibroblastų ląstelių linija 3T3, kuri buvo išskirta iš šveicariškų pelių embrionų ir aprašyta Torado ir Greeno [200]. Ši ląstelių linija pasižymi stipriu atsaku į UV spinduliuotę ir yra naudojama vertinant galimas fototoksiškumo ir odos dirginimo reakcijas pagal gaires, parengtas bendradarbiaujant EVCAM (Europos alternatyvių metodų validavimo centras), OECD (Tarptautinė ekonominio bendra-darbiavimo ir plėtros organizacija) ir COLIPA (Europos kosmetikos, tualeto reikmenų ir parfumerijos gaminių asociacija) [143, 191]. 3T3 ląstelių linija, pagal mokslinėje literatūroje aprašomus tyrimus ir anksčiau minėtas gaires, naudojama vertinant apsaugines veikliųjų medžiagų savybes nuo UVA spinduliuotės [36, 98, 215].
Ląstelių atsakas į UV spinduliuotę dažniausiai vertinamas atskirai UVA ir UVB spinduliuotei. Dermos sluoksnį atitinkančioms ląstelėms neatliekami tyrimai su UVB spinduliuote, nes ji šio sluoksnio nepasiekia. Tuo tarpu epidermio sluoksnio ląstelėms gali būti neatliekami tyrimai su UVA spindu-liuote, nes natūraliai epidermis yra stipriai veikiamas UVB spinduliuotės, kuri sukelia ir UVA spektrui būdingus pokyčius. Dažniausiai pasirenkama UVA spinduliuotės dozė yra 2,5 J/cm2, kuris nurodomas ir OECD gairėse [143,
215]. Tuo tarpu UVB apšvitos dozė parenkama intervale nuo 10 iki 100 J/cm2 [66, 205, 212]. Tokios apšvitos dozės atitinka saulės spektro spinduliuotės intensyvumą ir sukelia reikšmingus pokyčius ląstelėse, skatindamos tiesio-ginių ir netiesiotiesio-ginių pažaidų susidarymą.
Apibendrinant, apsauginių priemonių nuo UV spinduliuotės efektyvumo vertinimas atliekamas pasitelkiant spektrofotometrinius metodus, tačiau siekiant įvertinti naujos veikliosios medžiagos apsaugines savybes yra tikslinga taikyti biologinius metodus. Toks biologinio vertinimo metodas yra in vitro tyrimai su ląstelių kultūromis. Vertinant apsauginį poveikį odos ląstelėms, tikslinga pasirinkti HaCaT ir 3T3 ląstelių linijas kaip modelius, ati-tinkančius epidermio ir dermos sluoksnius.
1.1.3. Išoriškai vartojamos priemonės, apsaugančios nuo UV spinduliuotės poveikio
Rinkoje esančios priemonės, skirtos apsaugai nuo UV spinduliuotės, yra sudarytos iš plačios kompozicijos veikliųjų medžiagų apsaugančių nuo UVA ir UVB spinduliuotės. Veikliosios medžiagos, pagal savo veikimo principą, yra skirstomos į fizinius ir cheminius UV filtrus. Fiziniai filtrai atspindi UV spinduliuotę, o cheminiai – sugeria [148]. Šiuo metu Europos Sąjungoje yra
registruota 30 medžiagų, skirtų apsaugai nuo UV spinduliuotės [217]. Dauguma šių medžiagų yra cheminiai filtrai, kurie ilgą laiką buvo laikomi efektyvesniais ir priimtinesniais vartotojui nei fiziniai. Sukūrus nano–struk-tūrinius fizinius filtrus jie naudojami mišiniuose su cheminiais filtrais siekiant sinerginio efekto [9]. Svarbu pabrėžti, kad rinkoje esančių apsauginių prie-monių poveikis paremtas tik jų veikimu odos išorėje.
Gamintojai, vystydami apsaugines priemones nuo UV spinduliuotės, susi-duria su UV filtrų saugumo ir efektyvumo problemomis, o mokslinėje literatūroje pateikiami duomenys kelia susirūpinimą dėl komerciškai nau-dojamų UV filtrų saugumo žmogui ir aplinkai. Rekomenduojamas, efektyvią apsaugą užtikrinantis tepamos ant odos, apsauginės priemonės kiekis yra 2 mg/cm2. Gomez–Berrados ir kitų tyrimas, atliktas Prancūzijoje, atskleidė, jog apsauginių priemonių nuo UV spinduliuotės vartotojai vartoja iki 2 kartų mažesnį apsauginės priemonės kiekį, nei nurodoma rekomendacijose [76]. Tai parodo, jog vartotojus reikia edukuoti tam, kad būtų pagerintas šiuo metu rinkoje esančių apsauginių priemonių efektyvumas. Tuo tarpu apsauginių priemonių nuo UV spinduliuotės gamintojai efektyvumo problemą sprendžia kurdami produktus su itin aukštais apsauginiais faktoriais. Viliamso ir kitų klinikinis tyrimas pademonstravo, jog vartojant saulės kremus su itin aukštu SPF ir mažesnes nei efektyvias dozes, galima apsisaugoti nuo žalingo UV spinduliuotės poveikio [209]. Aukštas apsauginių priemonių SPF ir PF–UVA reikšmes leidžia pasiekti padidintas UV filtrų kiekis formuluotėje. Padidinus UV filtrų kiekį formuluotėje – padidėja ir galimų toksinių reakcijų tikimybė bei aplinkos tarša. UV filtrai turi būti saugūs vartotojui ir aplinkai, todėl ieškoma naujų medžiagų, kurios padėtų užtikrinti efektyvią ir saugią apsaugą nuo UV spinduliuotės poveikio.
Giokasas su kolegomis teigia, jog komercinių apsauginių priemonių, skirtų apsaugai nuo UV spinduliuotės, veiklieji junginiai gali sukelti žalą žmogui ir aplinkai [75]. Dauguma cheminių filtrų yra gerai į odą besiskverbiančios molekulės. Remiantis Morohoshio ir kitų atliktais tyrimais in vitro, cheminiai filtrai organizme gali sukelti estrogeninį poveikį [135]. Komercinių UV filtrų komponentų fotostabilumo tyrimai parodė, kad ne visi UV filtrai išlieka stabilūs ir efektyvūs veikiant UV spinduliuotei [3, 88, 164]. Kockleris ir kiti teigia, jog dalis UV filtrų fotoproduktų gali sukelti fotosensibilizacijos reak-cijas ir indukuoti ROS formavimąsi [108]. Kurį laiką buvo manoma, kad fiziniai nano–dispersiniai UV filtrai gali prasiskverbti pro odą ir sukelti imunines reakcijas, patekę į sisteminę kraujotaką. O’Keefe ir kitų ekspe-rimentai su žmogaus imuninėmis ląstelėmis pademonstravo, kad cinko oksido nano–dispersijos ir cheminiai UV filtrai yra gerai toleruojami imuninių ląstelių [142]. Vis dėlto negalima atmesti fakto, jog patekusios į sisteminę kraujotaką, nano–dalelės gali jungtis su baltymais, suformuodamos imunines
reakcijas sukeliančią baltymų karūną [140]. Verta paminėti, jog apsauginių produktų nuo UV spinduliuotės veikliosios medžiagos yra laikomos augančia grėsme aplinkai. Teksaso pakrantės zonų ir Iberijos upės baseino tyrimai pademonstravo, jog cheminių filtrų koncentracijos šiose jautriose ekosistemose palaipsniui didėja [69, 181].
Nepaisant keliamo susirūpinimo dėl UV filtrų naudojimo, sisteminių mokslinės literatūros apžvalgų išvados teigia, jog priemonės, skirtos apsaugai nuo UV spinduliuotės, apsaugo nuo žalingo UV poveikio ir pavojaus signalai dėl komponentų toksinių poveikių žmogui nėra reikšmingi [13, 29]. Tačiau, siekiant užtikrinti saugią apsaugą nuo UV spinduliuotės, reikalingos naujos medžiagos, kurios nesukeltų fototoksinių reakcijų ir būtų draugiškos aplinkai.
1.2. Augalinės kilmės medžiagų pritaikymas apsaugai nuo UV spinduliuotės
Augalinės medžiagos gali būti saugia alternatyva komerciškai naudojamiems UV filtrams. Iš augalinių aliejų ir ekstraktų išskiriami poli-fenoliai ir karotenoidai laikomi perspektyviausiais junginiais, galinčiais ne tik absorbuoti UV spinduliuotę, bet ir veikti į UV sukeliamų pažaidų patogenezės mechanizmus [43, 136, 171]. Verta paminėti, kad siekiant tokio plataus poveikio augaliniai junginiai turi pasiekti tikslines vietas – gyvąjį epidermį ir dermą. Pagal Nicholsą ir Katiyarą, natūralūs polifenoliai veikia sugerdami UV spinduliuotę ir kartu gali padėti sumažinti UV spinduliuotės sukeltus pažeidimus per priešuždegiminius, antioksidacinius ir DNR pažaidų susi-darymą mažinančius mechanizmus [141]. Tuo tarpu karotenoidai, tokie kaip β–karotenas, likopenas ir zeaksantinas, stipriau veikia sugerdami UV spektro spinduliuotę ir veikdami per antioksidacinius mechanizmus [162, 192]. Dėl platesnio poveikio spektro, veikiant į UV spinduliuotės sukeliamus pato-genezės mechanizmus, polifenoliai yra perspektyvesni junginiai už karo-tenoidus. Todėl tikslinga tyrimams pasirinkti polifenolį junginį, atlikti jo UV apsauginių savybių tyrimus ir formuluoti plataus spektro apsauginę priemonę nuo UV spinduliuotės poveikio.
1.2.1. Dihidrokvercetino fizikinės–cheminės savybės ir biologinis poveikis
Dihidrokvercetinas (DHK) yra mažai tyrinėtas polifenolis junginys, kuris dėl fizikinių, cheminių ir biologinių savybių gali būti pritaikomas apsaugai nuo UV spinduliuotės poveikio žmogaus odai. 1948 metais DHK išskyrimą iš didžiosios pocūgės branduolinės medienos (lot. Pseudotsuga menziesii Mirb.) ir fizikines–chemines savybes mokslinėje literatūroje pirmą kartą
aprašė Džonas Pevas [153]. Ilgą laiką DHK buvo laikomas nereikšminga margainio, Pycnogenol® ir kitų medicinoje naudojamų ekstraktų priemaiša [52, 156, 207]. Tačiau, pastarojo dešimtmečio moksliniai tyrimai parodė, jog DHK gali būti pritaikomas vėžinių susirgimų, kardiovaskulinių ir kepenų ligų gydymui bei prevencijai [207].
DHK molekulė absorbuoja UV spindulius visame UV spektre ir turi tris didžiausios UV absorbcijos maksimumus (λmax), ties: 254,4–254,1 nm,
272,6–287,4 nm ir 325,7–329,5 nm bangomis [165]. Spektrinės charak-teristikos rodo, kad didžiausia DHK UV spinduliuotės sugertis yra UVB ir UVC spinduliuotės srityse. Rajnochovos–Svobodovos ir kitų atliktame in vitro tyrime buvo nustatyta, kad DHK yra fotostabilus ir nepasižymi fototoksinėmis savybėmis [159]. Kitų mokslinių grupių tyrimai patvirtino, jog DHK pasižymi priešuždegiminėmis [115, 210], odos pigmentaciją mažinančiomis [10], navikų susidarymą slopinančiomis [146], apsaugan-čiomis nuo oksidacinio pobūdžio DNR pažaidų [125] ir UV indukuotos karcinogenezės odoje [144] savybėmis. Šios fizikinės, cheminės ir biologinės savybės patvirtina DHK tinkamumą plataus spektro apsaugai nuo UV spinduliuotės.
Svarbu paminėti, jog DHK prastai tirpsta vandenyje (tirpumas vandenyje < 0,1 proc.). Kimas ir kiti bei Shubina ir kiti, DHK tirpumo problemai spręsti pasirinko liposominių nešiklių formulavimą [105, 184, 185]. Liposominės formuluotės padidino DHK tirpumą. Šių formuluočių in vivo tyrimai su pelėmis parodė, kad liposominės DHK formuluotės gali sumažinti chemiškai indukuotas atopinio dermatito tipo pažaidas ir yra pritaikomos cheminių nudegimų gydymui.
Remiantis aptartomis fizikinėmis–cheminėmis savybėmis ir biologiniais tyrimais in vitro bei in vivo, DHK yra tinkama veiklioji medžiaga, modeliuojant plataus spektro apsauginę priemonę nuo UV spinduliuotės poveikio. Mokslinėje literatūroje nėra paskelbta išsamių duomenų apie DHK savybes apsaugant žmogaus odą nuo UV spinduliuotės, todėl pasirinkus šią veikliąją medžiagą yra tikslinga atlikti apsauginio poveikio nuo UV spindu-liuotės vertinimą, naudojant ląstelių kultūras in vitro. Siekiant užtikrinti plataus spektro apsaugą, kurią gali suteikti DHK, tikslinga, kad jis pasiektų odos epidermio ir dermos ląsteles, kur veiktų į UV spinduliuotės sukeliamų pažaidų patogenezės mechanizmus. To galima pasiekti formuluojant liposomines DHK formuluotes, kurios padidintų DHK tirpumą ir padidintų jo pasiskirstymą tiksliniuose audiniuose – odos epidermyje ir dermoje.
1.2.2. Augalinių aliejų pritaikymas apsaugai nuo UV spinduliuotės poveikio ir dihidrokvercetino skvarbos į odą gerinimui
Augaliniai aliejai gali būti naudojami, kaip pagalbinės medžiagos priemonių, apsaugančių nuo UV spinduliuotės, formulavimui. Brazilijos mokslininkai pademonstravo, jog kavos pupelių aliejus, sudaro sinergiją su fiziniais UV filtrais, padidindami jų apsaugines savybes [42, 128]. Badea su kolegomis nustatė, jog ryžių branduolių ir aviečių kauliukų aliejų nano–struktūrinės formuluotės gali apsaugoti nuo UV spinduliuotės ir pasižymi stipriomis antioksidacinėmis savybėmis [14]. In vitro ir in vivo tyrimų duomenys rodo, jog silpnomis fotoapsauginėmis savybėmis gali pa-sižymėti avokado (lot. Persea americana Mill.) [186], kokosų (lot. Cocos nucifera L.) [103], sojų pupelių (lot. Glycine max L.) [22], alyvuogių (lot. Olea europaea L.) [103], aviečių kauliukų (lot. Rubus idaeus L.) [145] ir šaltalankių pulpos (lot. Hippophae rhamnoides L.) [216] aliejai. Augalinių aliejų fotoapsauginis poveikis yra silpnas, nes pagrindiniai juos sudarantys komponentai yra lipidai, o fotoapsauginėmis savybėmis pasižyminčių medžiagų kiekiai yra santykinai maži. Formuluotėse aliejai dažniau naudojami dėl lipidinių komponentų savybių modeliuojant dermatologinius produktus ir nano–struktūrinius nešiklius ar siekiant padidinti veikliosios medžiagos skvarbą į odą [124, 204]. Dėl technologinių savybių ir galimo papildomo apsauginio poveikio apsaugant nuo UV spinduliuotės, tikslinga ištirti paminėtų aliejų DHK skvarbos į odą skatinimo savybes bei pritaikyti juos formuluojant nano–struktūrinius nešiklius.
1.3. Liposomos ir jų pritaikymas veikliųjų medžiagų pernašai į odą
Liposomos yra lipdinių nano–struktūrinių nešiklių forma. Tai nano– dydžio (1 – 100 nm arba pasižyminčios nano medžiagų savybėmis) sferinės formos pūslelės, sudarytos iš lipidinio dvisluoksnio, apgaubiančio hidrofilinį branduolį ir pasiskirsčiusios dispersinėje terpėje [15, 157]. Toliau diser-taciniame darbe liposomos, lipidiniai nano nešikliai ir nano–struktūriniai lipidiniai nešikliai yra vartojami kaip sinonimai.
1.3.1. Liposomų privalumai ir trūkumai
Liposomos yra efektyvi veikliųjų medžiagų nano–nešiklio forma dėl specifinių savybių, kurias galima panaudoti vaisto įterpimui, pernašai ir pasiskirstymui. Vienas dažniausių naujai sukurtų ir augalinės kilmės medžiagų trūkumų yra prastas tirpumas vandeniniuose tirpaluose [163]. Tai itin apsunkina įprastų vaisto formų kūrimą ir sukelia problemas, norint
pasiekti terapines vaisto koncentracijas tikslinėse organizmo vietose. Veikliosios medžiagos įterpimas į liposomas, laikomas vienu iš būdu page-rinti veikliosios medžiagos tirpumą [183]. Į liposominius nešiklius galima įterpti visų tipų veikliąsias medžiagas, nepaisant jų hidrofilinių–hidrofobinių savybių, molekulinės masės ar struktūros [58]. Liposominiai nešikliai leidžia padidinti veikliosios medžiagos terapinį indeksą, kryptingai nutaikant prepa-ratą į taikinio vietą. Aktyvus ir pasyvus liposomų taikymas į taikinio vietą yra pasiekiamas įterpiant specifinius ligandus į liposomų išorinį sluoksnį, paden-giant jas apsauginėmis medžiagomis (pvz. PEG) arba įterpiant liposomų savybes modifikuojančias ir skvarbą gerinančias medžiagas [70]. Liposomos yra sudarytos iš fosfolipidų, todėl jos pilnai biodegraduoja patekusios į orga-nizmo terpes ir nesukelia toksinių reakcijų. Itin svarbus liposomų privalumas yra veikliosios medžiagos stabilumo pagerinimas [158]. Įterpus medžiagą į liposomas, galima kontroliuoti jos skvarbą į odos sluoksnius ir sumažinti veikliųjų medžiagų toksiškumą [174]. Dėl išvardintų privalumų, liposominiai nešikliai yra perspektyvi forma gaminant plataus spektro preparatus, skirtus vartoti ant odos.
Liposominiai nešikliai turi ir reikšmingų trūkumų, kurie daugiausiai susiję su jų stabilumu biologinėse matricose ir ilgalaikio laikymo sąlygose. Svar-biausios su stabilumu susijusios problemos yra: fizikinis ir cheminis nestabilumas bei mikrobiologinė tarša [198].
Remiantis fizikiniais liposomų tyrimais, buvo nustatyta, kad liposomos, kaip koloidinė sistema, nėra mažiausios energijos būsenoje [114]. Tai lemia, kad mažindamos laisvąją energiją sistemoje, liposominių nešiklių sistemos yra linkusios aglomeruoti,. Fizikinis stabilumas gali būti užtikrinamas kontroliuojant dalelių dydį ir paviršiaus ζ (dzeta) potencialą. Liposominės sistemos laikomos stabiliomis, jei sistemoje esančių dalelių dydis vienodai pasiskirstęs (mažai išsibarstęs į frakcijas), o ζ potencialas yra ribose nuo |30| iki |60| mV.
Cheminis liposomų nestabilumas atsiranda dėl fosfolipidų oksidacijos ir hidrolizės. Nustatyta, kad šie procesai vyksta dėl fosfolipidų grandinių, kuriose yra nesočiosios riebalų rūgštys [80]. Šios problemos galima išvengti naudojant gerai išgrynintus fosfolipidus, kurių sudėtyje nėra nesočių riebalų rūgščių, arba į formuluotę pridedant antioksidantų. Cheminio ir fizikinio stabilumo problemas padeda spręsti ir liposomų liofilizacija. Britų moks-lininkai pademonstravo, kad liposomines vakcinas galima sėkmingai liofi-lizuoti, papildant jų sudėtį krio–apsaugine medžiaga trehaloze ir padidinti jų fizikinį–cheminį stabilumą [134]. Tačiau Payton ir kiti nustatė, jog ilgainiui liofilizuotos formuluotės išlaiko tik fizikines liposomų savybes, o lipidų oksidacijos procesai yra tik sulėtinami [149]. Tai rodo, jog tikslinga vengti fosfolipidų su nesočių riebalų rūgščių grandinėmis liposomų kompozicijose.
Mikrobiologinė liposomų tarša yra dažnai pasitaikantis nestabilumo atvejis, nes dėl palankios lipidinių membranų sudėties, liposomų sistemose gerai dauginasi įvairūs mikroorganizmai. Dėl fizikinio ir cheminio sistemų jautrumo, pagamintų liposomų negalima sterilizuoti autoklavuojant sausu karščiu ir garais. Kiti sterilizavimo būdai, tokie kaip sterilizavimas UVC spinduliais, etileno oksidu ir gama spinduliuote – sukelia lipidų peroksidaciją, o mikrofiltracijos metodas neužtikrina pakankamo sterilumo [199]. Visiškas sterilumas gali būti užtikrinamas tik kontroliuojant žaliavas ir gaminant liposomas aseptinėmis sąlygomis arba būdais, kurie užtikrina pagamintos formuluotės stabilumą.
Prie liposomų trūkumų verta paminėti išlaidas, patiriamas jas gaminant. Liposomos yra inovatyvi nešiklių forma, kurios gamybai reikalingi aukšto grynumo komponentai ir specifinės technologijos, o tai padidina liposomų kainą lyginant su įprastomis farmacinėmis formomis.
Nepaisant paminėtų trūkumų, liposomos yra itin efektyvi ir perspektyvi veikliųjų medžiagų nešiklio forma. Formuluojant šiuos nešiklius yra itin svarbu atkreipti dėmesį į pagamintų sistemų stabilumą.
1.3.2. Liposomų skvarbos į odą mechanizmai
Modeliuojant išoriškai vartojamą formuluotę, veikiančią į UV spindu-liuotės sukeliamus patogenezės mechanizmus, nešiklio sistema turi užtikrinti veikliosios medžiagos pasiskirstymą visuose odos sluoksniuose. Mokslinėje literatūroje aprašoma daug atvejų, kai skirtingų veikliųjų medžiagų skvarba buvo pagerinta naudojant liposominio tipo nešiklius [11, 21, 28, 57, 74, 95]. Verma su kolegomis pademonstravo, kad standartinės (nemodifikuotos) liposomos gali pagerinti hidrofilinių medžiagų, tokių kaip karboksi-fluoresceinas skvarbą į odą [202]. Reikšmingai pagerintą raloksifeno hidro-chlorido, inkorporuoto į Transfersomas® (elastinio tipo liposomas), skvarbą į odą pademonstravo Joshis ir kiti [100]. Tuo tarpu, Shahas su kolegomis pade-monstravo, kad invasomos pagerina azelainės rūgšties skvarbą į žmogaus odą ex vivo [180]. Skirtingų liposominių nešiklių tyrimų rezultatai veda prie bendros išvados, jog skvarbą į odą lemia lipidinių nešiklių kompozicija ir į juos įterptos veikliosios medžiagos savybės.
Liposominių nešiklių ir odos sąveika yra plačiai tyrinėjamas objektas. El Maghrabis su kolegomis pasiūlė, kad liposominiai nešikliai gali pernešti veikliąją medžiagą keletu mechanizmų: 1) atpalaidavus ją iš liposomų, kaip laisvą medžiagą; 2) liposomai suirus ir jos komponentams veikiant, kaip skvarbą gerinančiai medžiagai ir skverbiantis kartu su veikliąja medžiaga; 3) liposomai susiliejant su raginiu sluoksniu ir taip pagerinant veikliosios medžiagos pasiskirstymą odos sluoksniuose; 4) nesuirusioms liposomoms
prasiskverbiant pro odos sluoksnius; 5) nesuirusioms liposomoms skver-biantis pro plaukų svogūnėlius ar odos liaukutes [120]. Su pirmais trimis mechanizmais sutinka dauguma mokslininkų, tyrinėjančių odos preparatų skvarbą į odą. Ashtikaro ir kitų nuomone, neišspręsta diskusija yra dėl nesuirusių liposomų skvarbos pro raginį odos sluoksnį [11]. Ši diskusija iškilo pademonstravus, jog liposominiai nešikliai, tokie kaip transfersomos, etosomos ir invasomos, reikšmingai skatina veikliųjų medžiagų skvarbą pro raginį odos sluoksnį iki dermos. Cevcas su kolegomis atliko transfersomų skvarbos pro pusiau pralaidžią membraną ir pelių odą tyrimus, naudodamas konfokalinę mikroskopiją [39]. Tyrimų rezultatai parodė, jog transfersomos gali prasiskverbti pro odą nesuirusios [39]. Šis metodas buvo sukritikuotas, dėl prastos skiriamosios gebos, pagalbinių komponentų – fluorescencinių žymenų naudojimo ir formuluočių be veikliosios medžiagos vertinimo. Dreieris ir kiti, naudodami super–rezoliucijos fluorescencinę mikroskopiją nenustatė liposomų ar transfersomų komponentų prasiskverbusių pro raginį sluoksnį [54]. Fluorescencinių žymų naudojimas neleidžia tiksliai vertinti pagamintų sistemų skvarbos ir mokslinė diskusija vyksta toliau. Norint ją išspręsti reikalingi metodai, kurie leistų vaizdinti liposominius nešiklius odoje, nenaudojant papildomų žymenų. Tokias galimybes gali pasiūlyti masių spektrometrijos vaizdinimo technologijos, tačiau jų raiška dar neper-žengė 100 nm ribos [53]. Kol technologiniai apribojimai neleidžia tiksliai įvertinti liposominio tipo nešiklių skvarbos į odą mechanizmų, lipidinių nešiklių įtaką veikliosios medžiagos skvarbai galima įvertinti pagal veiklio-sios medžiagos pasiskirstymą odos sluoksniuose.
Veikliosios medžiagos, skirtos odos apsaugai nuo tiesioginio ir netiesioginio UV spinduliuotės poveikio, turi skverbtis pro raginį odos sluoksnį iki dermos. Mokslinės literatūros duomenys parodė, jog liposominės formuluotės gali užtikrinti veikliosios medžiagos skvarbą pro raginį odos sluoksnį. Disertacinio darbo rengimo metu buvo pasirinkta pritaikyti modifikuotą liposominę lipidinių nano–nešiklių formuluotę, kuri užtikrintų DHK skvarbą į epidermio ir dermos sluoksnius.
1.3.3. Liposomas sudarantys komponentai ir liposomų tipai
Liposomos yra sferinės formos pūslelės, sudarytos iš lipidinio dvisluoks-nio apgaubiančio hidrofilinį branduolį. Klasikinių liposomų struktūriniai komponentai yra fosfolipidai arba sintetinės amfifilinės molekulės, tarp kurių įterpiami steroliai, tokie kaip cholesterolis, reguliuojantys membranos pralai-dumą [15]. Vystant liposominius nešiklius, skirtingi jų tipai, tokie kaip etosomos, Transfersomos®, invasomos ir kiti, gaunami keičiant lipidinio
dvisluoksnio komponentus [11]. Liposomų komponentai yra vienas iš pagrin-dinių faktorių lemiančių jų skvarbos į odą savybes.
Pagrindinis liposominius nešiklius sudarantis komponentas yra fosfolipidai, kurie, sudarydami dvisluoksnę membraną, suformuoja lipo-somos pūslelę. Fosfolipidai – tai amfipatinės lipidinės molekulės, sudarytos iš dviejų riebalų rūgščių, glicerolio ir fosfatinės grupės. Riebalų rūgštys suda-ro hidsuda-rofobinę uodegėlę, o fosfatinė grupė, prijungta per glicesuda-rolio molekulę, sudaro hidrofilinę molekulės galvutę [117]. Suformuotos liposominės sis-temos savybės tiesiogiai priklauso nuo fosfolipidų kokybės ir grynumo. Liposomų gamyboje dažniausiai naudojami natūralūs fosfolipidai, kurie yra išgaunami iš pieno, augalinių aliejų ar kiaušinio trynio. Šiuolaikinėse formu-luotėse naudojami itin gryni natūralios kilmės fosfolipidai, kurie būna neutralaus krūvio, cviterjoniniai arba anijoniniai. Dažniausiai aptinkami natū-ralūs fosfolipidai yra: fosfatidilcholinas, sfingomielinas ir fosfatidiletanol-aminas. Žmogaus organizme šie fosfolipidai yra pagrindiniai ląstelių mem-branų komponentai, reguliuojantys memmem-branų stabilumą ir medžiagų pralai-dumą [7]. Liposomų gamybai pasirinkus fosfolipidus, kurių struktūra yra panaši į žmogaus ląstelių membranų struktūrą, pagamintos formuluotės yra gerai toleruojamos ir nesukelia šalutinių reakcijų.
Fosfolipidai gali būti gaunami ir sintetiniu keliu arba modifikuojami, siekiant pakeisti liposominių nešiklių savybes. Fosfolipidų gavyba sintezės keliu stipriai padidina liposomų gamybos savikainą, tačiau gaunami itin gryni fosfolipidai, užtikrinantys kokybišką gamybos procesą. Sintetinių fosfolipidų naudojimas leidžia: pagaminti liposomas, „apgaunančias“ imuninę sistemą ir ilgiau cirkuliuojančias sisteminėje kraujotakoje; prie liposomų prijungti ligandus, padedančius aktyviai nukreipti jas į taikinį; padidinti liposomų skvarbą dėl teigiamo krūvio; pagaminti termo–jautrias bei jautrias pH pokyčiui liposomas [89]. Katijoniniai fosfolipidai padeda padidinti liposomų skvarbą į ląsteles. Ląstelių membranų krūvis yra neigiamas, todėl jos yra labiau linkusios prisijungti teigiamo krūvio liposomas. Šio tipo liposomos daugiausiai naudojamos kaip DNR ir RNR produktų vektoriai [65]. Katijoninių liposomų trūkumas – didesnis toksiškumas dėl jungimosi ne tik prie taikinio vietos, bet ir prie kitų audinių bei organizmo komponentų, kurių krūvis yra neigiamas. Sintezės keliu pagaminti fosfolipidai gali būti derinami tarpusavyje, taip suteikiant specifines savybes ir pagerinant liposomų pate-kimą į taikinio vietą per sisteminę kraujotaką. Vietinio poveikio liposomų gamyboje šio tipo fosfolipidai naudojami rečiau.
Cholesterolis liposomų membranų sudėtyje veikia fosfolipidų dvisluoks-nio fluidiškumą ir pralaidumą, taip darydamas tiesioginę įtaką liposomų stabilumui [106]. Codercho ir kitų tyrimas pademonstravo, kad kai liposomos yra laikomos žemiau fazių virsmo temperatūros, cholesterolis padidina
dvisluoksnio fluidiškumą, o viršijus fazių virsmo temperatūrą – sumažina dvisluoksnio fluidiškumą [50]. Tai rodo, kad cholesterolis pasižymi buferi-nėmis savybėmis liposomų membranose. Jei cholesterolis yra naudojamas liposomų gamyboje, jo kiekis yra apskaičiuojamas pagal molekulinį santykį lyginant su fosfolipidų kiekiu. Molekuliniai santykiai, kuriais cholesterolis vartojamas yra nuo 1:5 iki 1:1, lyginant su liposomas sudarančiais fosfolipi-dais. Briuglia ir kitų mokslininkų duomenimis, cholesterolis taip pat daro įtaką tiriamųjų molekulių įterpimui į fosfolipidų dvisluoksnius ir atpalaida-vimui iš jų: pagreitindamas hidrofilinių molekulių, tokių kaip atenololio hidrochloridas, ir sulėtindamas hidrofobinių molekulių, tokių kaip kvetiapi-nas, atpalaidavimą [25]. Minėtame tyrime dėmesys buvo atkreiptas tik į mole-kulės, esančios lipidų dvisluoksnyje atpalaidavimą. Įterpiant dihidrokver-cetiną (hidrofobinę molekulę) į liposominius nešiklius ir siekiant, kad jo atpalaidavimas nebūtų papildomai ribojamas, tikslinga nenaudoti cholestero-lio.
Vystantis liposomų technologijoms, buvo siekiama pritaikyti liposomas veikliųjų medžiagų pernašai į odą, gilesnius jos sluoksnius ir pro odą. Šių tikslų padėjo pasiekti medžiagų, didinančių liposominės formuluotės elastin-gumą ar gerinančių skvarbos savybes, įterpimas ir mažinamas cholesterolio kiekis formuluotėse. Remiantis Gomperio ir Krolo simuliacijomis, buvo padaryta išvada, kad padidinus nano struktūrinių nešiklių elastingumą, padidėtų ir nešiklių skvarba [77]. Išsamius tyrimus, siekiant padidinti lipidi-nio dvisluokslipidi-nio elastingumą, atliko vokiečių mokslininkas Gregoris Cevcas, kuris padedamas įmonės IDEA AG užpatentavo elastinių liposomų formuluotę ir pavadino jas transfersomomis („Transfersomes®“) [38].
Vaiz-dinimo tyrimai, parodę, kad transfersomos gali prasiskverbti pro odos barjerą, išpopuliarino šią lipidinių nešiklių sistemą ir sukėlė susidomėjimą mokslinėje bendruomenėje [38]. Padidintas transfersomų elastingumas siejamas su į lipidinį dvisluoksnį įterpta paviršiui aktyvia medžiaga (PAM). PAM kontro-liuojamai destabilizuoja membranas ir leidžia liposomoms pralįsti pro mažesnes nei pačių liposomų dydis poras. Dažniausiai elastinių liposomų gamyboje naudojamos PAM yra polisorbatai, tulžies druskos, glikolipidai, aklil– ar acil–polioksietilenai [37]. PAM koncentracijos, užtikrinančios pa-kankamą elastingumą yra vertinamos atliekant empirinius tyrimus. Daž-niausiai, PAM sudaro iki 1 proc. visos formuluotės kompozicijos masės arba iki 10 proc. lipidų, sudarančių formuluotę, masės. Į elastinių liposomų sudėtį taip pat įterpiami nedideli kiekiai etanolio (1–10 proc.), padedantys padidinti dvisluoksnio elastingumą.
Liposomų skvarbos į odą savybės buvo gerinamos į jas įterpiant gerai žinomas skvarbą gerinančias medžiagas, tokias kaip terpenai ir riebalų rūgštys. Liposomos, į kurių dvisluoksnį yra įterpta skvarbą gerinanti
medžiaga, vadinamos invasomomis [112]. Į šias sistemas įterpiama apie 1 proc. terpenų mišinio, kuris padidina liposomų ar jose esančių komponentų skvarbą į odą. Vietoje terpenų mišinio galima įterpti ir kito tipo skvarbą gerinančias medžiagas. Kontraversiška sistema su skvarbą gerinančia me-džiaga yra etosomos. Jų sudėtyje yra nuo 20 iki 45 proc. etanolio, kuris veikia kaip skvarbą gerinanti medžiaga, bet nesuardo pačių etosomų lipidinio dvisluoksnio [203]. Modifikuojant liposomų dvisluoksnį papildomais kom-ponentais arba jų pakaitais sukuriama vis daugiau naujo tipo formuluočių, papildant klasifikaciją naujais pavadinimais, atspindinčiais įterpto kom-ponento kilmę ar pritaikymą. Nepaisant papildomai įterptų komponentų, visų šių sistemų struktūra ir pagrindinės sudedamosios dalys yra fosfolipidai, todėl jos gali būti vadinamos liposomomis arba liposominio tipo nešikliais.
Liposomų komponentų santykiai dažniausiai parenkami empirinių ekspe-rimentų keliu arba remiantis tyrėjų komandose sukaupta patirtimi. Vis daž-niau komponentų parinkimui pritaikomos eksperimentinio planavimo ir statistinio sudėties optimizavimo sistemos. Kaip rodo Josepho ir kitų bei Vu ir kitų darbai, optimizavimo sistemos padeda sumažinti galimų empirinių eks-perimentų kiekį bei pagaminti liposomas, pasižyminčias optimaliu numatytų savybių deriniu [99, 211]. Abu komponentų parinkimo metodai leidžia paga-minti kokybiškas liposomines sistemas, o geriausias rezultatas gaunamas suderinus sukauptą patirtį ir pritaikius statistinį optimizavimą.
Šiuolaikiškos liposominės sistemos yra orientuotos į tikslingą veikliųjų medžiagų pernašą, todėl į jų lipidinį dvisluoksnį gali būti įterpiami specifiniai ligandai, modifikuoti lipidai, liposomų elastingumą ir skvarbą gerinančios medžiagos. Norint suformuluoti liposominę sistemą, skirtą DHK pernašai į gilesnius odos sluoksnius, reikia parinkti tokius lipidinio dvisluoksnio kom-ponentus, kurie pasyviai padidintų skvarbą. Formulavimui tikslinga pasirinkti išgrynintus gamtinės kilmės fosfolipidus ir modifikuoti lipidų dvisluoksnio kompoziciją, modeliuojant invasomas arba elastinio tipo liposomas.
1.3.4. Liposomų gamybos metodai
Liposomų gamybai yra naudojami dviejų tipų procesai: dalelių smulki-nimo (angl. top–down) ir didismulki-nimo (angl. bottom–up). Dalelių smulkismulki-nimo metodai yra pagrįsti stambių agregatų ir multilamelinių sistemų smulkinimų iki unilamelinių liposomų, o dalelių didinimo metodai – liposomų surinkimu iš pavienių lipidų [152]. Gamybos metodų pasirinkimas yra ribotas, norint pagaminti nano dydžio, atkartojamas ir kokybiškas lipidines sistemas. Dalelių smulkinimo metodai yra naudojami seniausiai ir plačiausiai. Referenciniu gamybos metodu laikomas plono lipidų sluoksnio drėkinimo metodas (angl. thin–film hydration), kurį aprašė Banghamas ir kiti [15]. Šio metodo principas
pagrįstas lipidų ir veikliosios medžiagos tirpinimu organiniame tirpiklyje, kuris vėliau pašalinamas rotaciniu garintuvu, suformuojant ploną lipidų sluoksnį. Plonas lipidų sluoksnis drėkinamas vandeniniu tirpalu ir sufor-muojamos stambios multilamelinės liposomos. Siekiant pagaminti unilame-lines nano dydžio liposomas, toliau taikomi dispergavimo metodai: homogenizuojant, veikiant aukštu slėgiu ir išstumiant pro membraną (angl. membrane extrusion), sonikuojant ultragarso zondu ar keletą kartų cikliškai užšaldant ir atšildant multilamelines sistemas [6]. Išvardinti dispergavimo metodai yra paremti fizikinėmis dispersijų gamybos taisyklėmis: norint pa-gaminti stabilią dispersinę sistemą, disperguojant jai reikia suteikti tiek energijos, kad pagamintos sferinės dalelės būtų vienodo dydžio ir pasiektų mažiausią laisvos energijos būseną [86, 114]. Visais minėtais dispergavimo būdais galima pagaminti numatytų savybių, nano dydžio, stabilias liposomas inkorporuojant hidrofilines ir hidrofobines medžiagas. Taikant plono lipidų sluoksnio hidratavimo metodą susiduriama su nepilnai išgarinamų organinių tirpiklių problema ir technologiniais iššūkiais bandant padidinti gamybos kie-kius.
Manconi su kolegomis išvengė organinių tirpiklių naudojimo tiesioginio sonikavimo metodu [124]. Liposomų komponentai yra sumaišomi, paliekami drėkinimui ir tiesiogiai sonikuojami ultragarso zondu nustatytais ciklais. Šio gamybos metodo trūkumai: galimos titano dalelių, atskylančių nuo sonika-toriaus zondo, nuosėdos; didesnis pagamintų dalelių dydis, polidispersišku-mas; mažesnis veikliosios medžiagos įterpimo į nešiklius efektyvumas. Nepaisant trūkumų, tiesioginio sonikavimo metodas yra itin našus ir lengvai pritaikomas pramoninėje liposomų gamyboje.
Dalelių didinimo metodai – daugiausiai paremti naujomis technologijomis ir jų taikymu. Šiuo metu itin aktyviai vystomos mikrofluidinės ir superkritinių skysčių savybėmis pagrįstos liposomų gamybos sistemos. Teisingai parinkus komponentus, šie metodai leidžia suformuoti pavienes liposomas. Itin akty-viai mikrofluidines sistemas vysto Kanados įmonė Precision NanoSystems Inc., gaminanti įrangą, kurios dėka galima gaminti tiek eksperimentinius, tiek pramoninio dydžio liposomų kiekius. Mikrofluidinių sistemų principas – lipi-dų tirpalo ir buferinio tirpalo sumaišymas mikrokapiliarinėje sistemoje [214]. Kurį laiką šių sistemų pagalba buvo galima pagaminti tik dideles unilamelines sistemas, tačiau vystant mikrofluidines sistemas buvo pasiektas nano dalelių dydis. Joshio ir kitų tyrimas pademonstravo, kad naudojant mikrofluidinę sistemą galima suformuoti nano dydžio (55–81 nm) liposomas ir įterpti tiek hidrofilines, tiek hidrofobines molekules (metformino hidrochloridą ir glipizidą), kartu ir atskirai [101]. Šio tyrimo metu gautos itin homogeniškos dalelės, tačiau mažesnis nei 50 procentų vaistų įterpimo į nešiklius efektyvu-mas rodo, kad metodas dar turėtų būti tobulinaefektyvu-mas. Carugo su kolegomis,
pademonstravo mikrofluidinių sistemų gamybos metodo pranašumą prieš lipidų injekcijos į dispersinę terpę metodą [35]. Lipidų injekcijos metodas, kitaip dar vadinamas etanolio injekcijos metodu, yra vienas iš seniausių dalelių didinimo metodų. Jo principas – etanolyje ar kitame organiniame tirpi-klyje ištirpintų lipidų injekcija į vandeninę terpę. Fosfolipidai patekę į vandeninę terpę spontaniškai suformuoja liposomas. Pagaminamų dalelių dy-dis kontroliuojamas parenkant organinį tirpiklį, lipidinės fazės formuluotę, injekcijos tūrį ir lipidinės injekcijos fazės klampą [177].
Vieni perspektyviausių liposomų gamybos metodų yra paremti superkritinių skysčių technologijomis. Dažniausiai kaip superkritinis skystis yra pritaikomos anglies dvideginio (CO2) dujos esančios superkritinėje fazėje
t.y. kai dėl temperatūros ir slėgio poveikio dujos viršija kritinį tašką, kuris skiria dujų ir skysčio fazę. Šiuo metu yra gausu superkritinių skysčių platformų ir metodikų, skirtų liposomų gamybai [172]. Metodas paremtas lipidinių komponentų tirpinimu superkritiniame CO2, toliau aukštame slėgyje
jie sumaišomi su vandeniu ir gaunamos kontroliuojamo dydžio liposomos. Šiose liposomose gali būti įterptos hidrofilinės ar hidrofobinės molekulės [33]. Reikšmingas, superkritiniais skysčiais paremtų, sistemų privalumas yra didelis našumas ir galimybė pagaminti sterilias formuluotes, nenaudojant pa-pildomų sterilizavimo priemonių. Šios sistemos taikomos retai, nes vis dar yra vystymo fazėje. Inovatyvūs ir tikslūs dalelių didinimo metodai yra santy-kinai brangūs, lyginant su tiesioginio sonikavimo ar organinio tirpiklio in-jekcijos metodais. Išvysčius technologijas ir atsiradus daugiau alternatyvų, galima tikėtis, kad metodai, paremti mikrofluidinėmis ar superkritinių skys-čių sistemomis, užims reikšmingą vietą liposomų ir kitų lipidinių nešiklių ga-mybos rinkoje.
Nauji liposomų gamybos metodai kuriami nuolat, siekiant sukurti tokį, kuris bus tinkamas gaminti tiek mažus liposomų kiekius, skirtus laboratorijai, tiek didelius – skirtus pramonei. Verta paminėti, kad nepaisant pasirinkto gamybos metodo, svarbiausias lipidinio nešiklio gamybos etapas yra liposo-mas sudarančių komponentų parinkiliposo-mas. Šiame skyrelyje buvo apžvelgti pa-grindiniai metodai, naudojami liposomų gamyboje veikliąją medžiagą į lipo-somas įterpiant pasyviai. Disertacinio darbo metu, formuluotės su dihidro-kvercetinu vystymo etape, tikslinga pasirinkti dalelių smulkinimo metodus, kurie užtikrintų efektyvų veikliosios medžiagos įterpimą į lipidinį dvi-sluoksnį.
1.3.5. Liposomų kokybės vertinimo kriterijai ir metodai
Pagrindiniai pagamintų liposomų vertinimo kriterijai yra dalelių dydis ir dalelių dydžio frakcijų pasiskirstymas, krūvis arba paviršiaus ζ potencialas ir
veikliosios medžiagos įterpimo į liposomas efektyvumas. Papildomai gali būti vertinamos reologinės savybės, stabilumas įvairiose sąlygose, veikliosios medžiagos atpalaidavimas iš formuluočių, paviršiaus charakteristikos (jei liposomos pagamintos su polimeriniu apvalkalu). Paminėtas savybes reko-menduojama tirti, remiantis Europos vaistų agentūros ir JAV Maisto ir vaistų agentūros rekomendacijomis liposominių produktų gamybai ir vertinimui [61, 201].
Dalelių dydis yra pagrindinis kriterijus, apibūdinantis nano struktūrines sistemas. Liposomos yra stabilios jas skiedžiant, tačiau gali būti suardytos keičiant temperatūrą, aplinkos pH ar džiovinant vakuumu. Šios savybės apriboja dalelių dydžio vertinimo metodų pasirinkimą. Tiksliausi liposomų dalelių dydžio matavimai atliekami elektronų mikroskopijos metodais. Atliekant matavimus elektronų mikroskopijos metodais (EM) turi būti sudaromas gilus vakuumas, todėl liposomos turi būti specifiškai paruošiamos: jų paviršius padengiamas auksu ar platina; naudojamos gilaus užšaldymo technikos; dalelių paviršius padengiamas neigiamo krūvio dažais, kurie susijungia su fosfolipidais [170]. Šie metodai yra brangūs, reikalauja specifi-nių žispecifi-nių, o matavimų trukmė yra ilga, todėl jie dažniausiai taikomi jau galu-tiniame formulavimo ir dalelių dydžio patvirtinimo etape. EM leidžia patvir-tinti liposomų morfologiją ir dalelių dydžio matavimus, atliktus kitais meto-dais.
Dalelių dydžio matavimui taip pat gali būti naudojama konfokalinė mikroskopija ir atominės jėgos mikroskopija. Šiais metodais negalima įver-tinti dalelių dydžio tiesiogiai, tačiau galima nustatyti morfologiją. Matuojant liposomas atominės jėgos mikroskopijos metodu, mėginys turi būti koky-biškai patalpinamas ant paviršiaus pagaminto iš žėručio (angl. mica), kuris absorbuoja liposomas. Mėginys išdžiovinamas, liposomos visiškai suardo-mos ir analizuojamas žėručio paviršius ir jo pokyčiai, kuriuos sukėlė liposo-mos [197]. Matavimus atliekant konfokalinės mikroskopijos metodu, į lipo-somas turi būti įterpiamas fluorescencinis žymuo, kuris ir yra registruojamas. Gautus vaizdus galima rekonstruoti ir padaryti trimates projekcijas. Šio metodo trūkumas yra maža raiška – galima nustatyti tik objektus, kurių dydis yra ne mažesnis nei 200 nm [170]. Paminėti metodai yra brangūs, reikalauja daug laiko, specifinės technikos, žinių ir personalo. Siekiant bekompro-misiškai nustatyti dalelių morfologiją ir dydį, dažniausiai iš šių metodikų pasirenkama transmisinės elektronų mikroskopijos technika, su gilaus šaldy-mo galimybe (krio–TEM) [111].
Praktikoje dažniausiai naudojami dalelių dydžio matavimo metodai yra dinaminės šviesos sklaidos (DLS) ir statinės šviesos sklaidos (SLS) mata-vimai. Šiais metodais negalima tiesiogiai išmatuoti dalelių dydžio, tačiau pritaikant matematines lygtis pagal liposomų išsklaidytą šviesos kiekį, jie
