VANDENINIŲ IR NEVANDENINIŲ PROPOLIO TIRPALŲ PRIEŠVĖŽINIO POVEIKIO TYRIMAS

VAISTŲ TECHNOLOGIJOS IR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA

RITA ŽADEIKYTĖ

VANDENINIŲ IR NEVANDENINIŲ PROPOLIO TIRPALŲ

PRIEŠVĖŽINIO POVEIKIO TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovė: Prof. dr. Daiva Majienė

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

FARMACIJOS FAKULTETAS

VAISTŲ TECHNOLOGIJOS IR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis Data:

VANDENINIŲ IR NEVANDENINIŲ PROPOLIO TIRPALŲ

PRIEŠVĖŽINIO POVEIKIO TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas:

TURINYS

ĮVADAS ... 8

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9

1.1. Fizinės propolio savybės ... 10

1.2. Cheminė propolio sudėtis ... 10

1.3. Propolio tirpalų gamyba ... 12

1.4. Propolio biologinis poveikis ... 13

1.4.1. Antimikrobinis aktyvumas ... 14

1.4.2. Antioksidacinis poveikis ... 15

1.4.3. Priešuždegiminis aktyvumas ... 16

1.4.4. Priešvėžinis aktyvumas ... 17

2. METODIKA ... 18

2.1. Naudotos medžiagos ir aparatūra ... 18

2.1.1. Naudotos medžiagos ... 18

2.1.2. Naudota aparatūra ... 19

2.2. Propolio tirpalų gamyba ... 19

2.3. Fenolinių junginių kiekybinis nustatymas Folin- Ciocalteu metodu ... 20

2.4. Ląstelių sėjimo metodika ... 20

2.5. Ląstelių tankio nustatymas ... 21

2.6. Ląstelių gyvybingumo nustatymas MTT testu ... 22

2.7.Ląstelių gyvybingumo nustatymas propidžio jodido/Hoechst metodu ... 23

2.8.Ląstelių proliferacijos tyrimas ... 23

2.9.Statistinė duomenų analizė ... 23

3. DARBO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 24

3.1. Skirtingų propolio tirpalų fenolinių junginių kiekio nustatymas... 24

3.2. MTT metodu skirtingų propolio tirpalų poveikis C6 ląstelių gyvybingumui ... 25

3.3. Propodžio jodido/Hoechst 33528 metodu nustatytas propolio tirpalų poveikis C6 ląstelių gyvybingumui ... 30

3.4. Skirtingų propolio tirpalų poveikis C6 ląstelių proliferacijai ... 34

LIETUVIŲ KALBA

SANTRAUKA

PROPOLIO TIRPALŲ PRIEŠVĖŽINIO POVEIKIO TYRIMAS

R.Žadeikytės magistro baigiamasis darbas/ mokslinė vadovė Prof. dr. Daiva Majienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Vaistų technologijos ir socialinės farmacijos katedra – Kaunas.

Raktiniai žodžiai: propolis,C6 ląstelių kultūra, gyvybingumas, antipoliferacinis aktyvumas.

Tyrimo tikslas – ištirti ir palyginti skirtingų propolio tirpalų poveikį C6 ląstelių kultūros gyvybingumui ir

proliferacijai.

Metodai: Bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas Folino Ciocalteu metodu pagal galo rūgšties

ekvivalentą. Ląstelių gyvybingumas tirtas spektrofotometriniu metodu, naudojant MTT dažą. Ląstelių

gyvybingumas bei proliferacija įvertinta fluorescentinio mikroskopavimo metodu, naudojant dažus propidžio jodidą ir Hoechst 3325.

Tyrimų uždaviniai:

1. Pagaminti propolio tirpalus, naudojant skirtingus tirpiklius, ir nustatyti bei palyginti fenolinių junginių kiekį juose.

2. Ištirti ir palyginti skirtingų koncentracijų propolio tirpalų poveikį ląstelių gyvybingumui. 3. Įvertinti ir palyginti skirtingų koncentracijų propolio tirpalų poveikį ląstelių proliferacijai.

Tyrimų rezultatai: Atlikus tyrimus buvo nustatyta, jog PEG propolio tirpale fenolinių junginių buvo 57,

75 % daugiau lyginant su PVE tirpalu. Tuo tarpu PEE tirpale buvo nustatytas net 10 kartų didesnis fenolinių junginių kiekis lyginant su PEG propolio tirpalu. Visi tirti propolio tirpalai priklausomai nuo koncentracijos mažino C6 ląstelių gyvybingumą. Paveikus ląsteles 5-6 μl PEE tirpalu, ląstelių gyvybingumas sumažėjo 94 %, paveikus 20 μl PEG tirpalu gyvybingumas sumažėjo 85,86%, o paveikus 15 μl PVE tirpalu, ląstelių gyvibingumas sumažėjo iki 30 %. Atliktas propidžio jodido/Hoechst tyrimas patvirtino, jog ,didinant propolio tirpalų koncentracijas, efektyviai sumažėja gyvybingų ląstelių ir padidėja negyvybingų ląstelių skaičius. Ląsteles žūsta nekrozės būdu. Taip pat visi tirti propolio tirpalai slopino C6 ląstelių proliferaciją. Statistiškai reikšmingas antiproliferacinis poveikis nustatytas, naudojant 1-2 μl PEG propolio tirpalą, 0.4 μl PEE propolio tirpalą ir 3- 4 μl PVE propolio tirpalą po 48 h inkubacijos.

Išvados: Skirtingi propolio tirpalai priklausomai nuo koncentracijos mažina C6 ląstelių proliferaciją ir

SUMMURY

PROPOLIS SOLUTIONS ANTI-CANCER EFFECT INVESTIGATION

R.Žadeikytės master's thesis / Scientific leader prof. dr. Daiva Majienė; Lithuanian University of Health Sciences Faculty of Pharmacy, Pharmaceutical Technology and Social Pharmacy Department - Kaunas.

Key words: C6 cell culture viability, propolis, antiproliferative

The aim of research: to investigate and compare the effect of different concentrations of different solutions of propolis on rat glioblastoma cell culture viability, and assess their impact to the cell proliferation.

Methods: Phenolic compounds investigated by the Folin-Ciocalteu method. Cell viability was evaluated

using propidium iodide and Hoechst 33258 assay, additionally cell viability was assessed by measuring the ability of cells to metabolize MTT dye. Cell staining with propidium iodide and Hoechst 33258 also was used to investigate anti-proliferative effect.

Tasks of the study:

1. To prepare different solutions of propolis, to indentify and compare content of phenolic compounds presented in solutions.

2. To investigate and compare the effect of different concentrations propolis solutions on cell viability.

3. To evaluate and compare the effect of different concentrations propolis solutions on cell proliferation.

Results: Results of our experiments showed that content of phenolic compunds was higher 57,

75% in PEG solution if compare with PVE solution. Meanwhile EEP solution had 10 times higher content of phenolic compounds if compare with the PEG solution of propolis.

Our results have shown that investigated solutions of propolis induced dose-dependent reduction in viability of C6 cells. Affected cells with 5- 6 μl of EEP solution cell viability decreased by 94%, affected cells with 20 μl of PEG solution viability decreased 85.86%, and affected 15 μl of PVE solution cells viability dropped to 30%. Furthermore, propidium Jodide/Hoechst assay confirmed that increased concentrations of propolis solutions have effectively lowered content of viable cell and increased non-viable cell ratio. Cells die by necrosis. Our results have shown that propolis solutions in a concentration-dependent mannier inhibit C6 cell proliferation. Statistically significant anti-proliferative effects we founded when used propolis 1-2 μl of PEG solution, 0, 4 μl of EEP solution and 3 -4 μl of PVE solution after 48 h incubation.

Conclusions: Different solutions of propolis included a dose-dependent reduction in viability and

SANTRUMPOS

DC-MS - dujų chromatografija– masių spektrometrija.

DMSO - tirpiklis, lengvai tirpinantis įvairias vaistines medžiagas, taip pat gerai maišosi su vandeniu, etanoliu ir kitais tirpalais.

FBS - fetalinis veršelio serumas (angl. Fetal bovine serum).

GMB – multiforminė glioblastoma.

PBS- fosfatinis druskos buferis (angl. Phosphate Buffer Saline).

PEE – propolio etanolinis ekstraktas.

PEG- propolio ekstraktas su propilenglikolio tirpikliu.

PVE – propolio vandeninis ekstraktas.

ROS – reaktyviosios deguonies formos (angl. reactive oxygen species).

ĮVADAS

Propolis tai sakinga medžiaga, kurią bitės surenka iš augalų. Šis natūralus produktas tarnauja kaip apsauginis barjeras, siekiant apsaugoti avilius nuo parazitų, bakterijų ir virusų. Propolio spalva gali būti įvairi, priklausomai nuo kokių augalų jis buvo rinktas. Propolis cheminiu požiūriu labai sudėtinga gamtinės kilmės medžiaga. Propolio cheminę sudėtį sudaro 50% dervų (fenoliniai junginiai: flavonoidai, fenolinės rūgštys ir kt.) 30% vaškas, 10% eteriniai aliejai ir aromatiniai junginiai, 5% žiedadulkių ir 5% įvairių mineralų. Taip pat jame gausu įvairių cukrų bei vitaminų. [1], [2].

Propolio biologinis veikimas platus. Jis pasižymi antibakterinėmis [3], antivirusinėmis [4], priešgrybelinėmis [5], antioksidacinėmis [6], priešuždegiminėmis [7], priešvėžinėmis [8] ir kt. savybėmis. Daugiausia dėmesio skiriama antimikrobinio, priešuždegiminio, antioksidacinio, bei priešvėžinio poveikio tyrimams.

Nustatyta, jog pagrindiniai komponentai veikiantys prieš vėžio ląsteles yra: kofeino rūgšties esteris, chrizinas, artepillinas C, galanginas ir kt. In vitro/in vivo tyrimais su etanoliniu propolio tirpalu įrodyta, kad jis gali slopinti vėžinių ląstelių augimą. Įrodytas ir citotoksinis propolio veikimas in vitro prieš daugelį žmogaus ląstelių linijų: gaubtinės žarnos vėžio ląstelės, prostatos vėžio ląstelės, burnos bei nosiaryklės vėžio ląstelės ir kt. [9]

Populiariausia propolio ekstraktų gamyba yra su etanoliu. Šiuo metodu galima išgauti didesnį biologiškai aktyvių junginių kiekį iš mažo kiekio žaliavos. Tačiau šis metodas turi daug minusų: stiprus ir nemalonus skonis vartoti peroraliai, apribojimai kosmetikos bei farmacijos pramonės taikyme, netinkamas gydyti oftalmologijoje ir pediatrijoje. Todėl remiantis įvairių autorių literatūra, propolio neetanolinių tirpalų gamyba yra labiau pageidautina. Biologiškai aktyvių medžiagų vandeniniuose tipraluose randama 10 kartų mažiau, nei etanoliniuose ekstraktuose. Tačiau į vandeninį tirpalą įdėjus tam tikrus tirpiklius, galime padidinti biologiškai aktyvių junginių kiekį ir sustipritni jo biologinį aktyvumą. [10], [11]

Darbo naujumas ir praktinė reikšmė

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas ir uždaviniai:

1. Pagaminti propolio tirpalus, naudojant skirtingus tirpiklius, ir nustatyti bei palyginti fenolinių junginių kiekį juose.

2. Ištirti ir palyginti skirtingų koncentracijų propolio tirpalų poveikį ląstelių gyvybingumui. 3. Įvertinti ir palyginti skirtingų koncentracijų propolio tirpalų poveikį ląstelių proliferacijai.

Tyrimo tikslas – ištirti ir palyginti skirtingų propolio tirpalų poveikį C6 ląstelių kultūros gyvybingumui ir

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Fizinės propolio savybės

Propolio spalva gali būti geltona, žalia, raudona, šviesiai ar tamsiai ruda. Spalva priklauso nuo augalų, iš kurių jis surinktas. Kuo pikis senesnis, tuo propolio spalva intensyvesnė. Tai sakinga medžiaga - malonaus, stipraus kvapo bei kartoko, aštraus ar deginančio skonio.

Esant kambario temperatūrai, propolis būna kietas. Esant žemesnei nei 15°C temperatūrai, propolis tampa trapus, o 36-38°C jis palieka lipnus, klampus ir plastiškas. Propolio lydimosi temperatūra nuo 80 iki 104°C. Jo tankis – 1,112-1,180 g/cm3. Vandenyje praktiškai netirpus. Tirpumas vandenyje siekia iki 10 %, tačiau gerai tirpsta etanolyje, metanolyje. Geriau tirpsta pašildytuose tirpikliuose. [1]

Etanolyje veikliosios medžiagos tirpsta gerai, tačiau tokio ekstrakto naudojimas yra ribotas. Jis negali būti naudojamas gydant tam tikras ligas, su kuriomis susiduriama oftalmologijoje ar pediatrijoje. Visgi pagrindinės biologiškai aktyvios medžiagos gerai tirpsta ir vandenyje, tik turi būti derinamos kartu su tam tikrais tirpikliais.

Naujausiais tyrimais įrodyta, kad neetanolinis tirpiklio kompleksas PEG leidžia iš propolio išskirti biologiškai aktyvių junginių daugiau lyginant su vandeniniu ar aliejiniu ekstraktu. [11]

1.2. Cheminė propolio sudėtis

Propolis cheminiu požiūriu labai sudėtinga gamtinės kilmės medžiaga. Nuo senų laikų ji žinoma kaip stipri antimikrobinė medžiaga prieš įvairius patogeninius organizmus.

Propolio žaliavą sudaro apie 50% dervų (fenoliniai junginiai: flavonoidai, fenolinės rūgštys ir kt.) 30% vaškas, 10% eteriniai aliejai ir aromatiniai junginiai, 5% žiedadulkių ir 5% įvairių mineralų (Ca, Mg, K , Na , Fe, Zn, Fe, Mn , Zn ir Cu.). Taip pat jame gausu įvairių cukrų bei vitaminų. [2]

Daug dėmėsio sulaukia propolio mėginiai iš įvairių tropinių regionų, kaip Brazilija, Kuba, Venesuela ir Čilė. P-kumaro, diterpeninių ir kt. rugščių gausu propolio mėginiuose iš Brazilijos pietryčių regiono. Šiaurės rytų Brazilijos regiono pikio mėginiuose nustatytos didelės koncentracijos fenolinių rūgščių bei flavonoidų. Kubos pikis turi savitą benzofenonų sudėtį ir chemiškai skiriasi nuo Europos ir Brazilijos propolio tipo. Propolį iš Venesuelos taip pat sudaro papildomi benzofenonai ir kita būdinga sudėtis tropiniams regionams. [12]

1 lentelė. Propolio tipai ir cheminė sudėtis pagal geografinę kilmę [13] Propolio rūšis Regionas, kuriame

rinktas

Pagrindiniai augalai, nuo kurių surenkamas

Pagrindinės biologiškai aktyvios medžiagos Europos („tuopų”) tipo

propolis

Europa, Šiaurės Amerika, Azija

tuopos flavonai, flavanonai, fenolinės rūgštys ir jų

esteriai Rusijos („beržų”) tipo

propolis

Rusija beržai flavonai, flavonoliai

Žaliasis propolis Brazilija varva p-kumaro rūgštys,

diterpeninės rūgštys Raudonasis

(„kluzijos”― tipo) propolis

Kuba, Venesuela kluzija benzofenonai

Ramiojo vandenyno― tipo propolis

Ramiojo vandenyno regionas

nežinomi flavanonai

Kanarų― tipo propolis Kanarų salos nežinomi furofurano lignanai

Pastaruoju metu labai intensyviai pradėtas tirti ir Europoje surinktas propolis. Šiame regione bitės medžiagas propoliui dažniausiai renka nuo tuopų, beržų, kaštonų, alksnių ar pušų nektaro. [14]

Tyrimais įrodyta, kad Europoje ir Šiaurės Amerikoje pagrindinis dervų šaltinis yra įvairių rūšių tuopos, kurios turi flavonoidų ir kitų fenolinių junginių.

Taip pat buvo įrodyta, jog mūsų šalyje pagrinde vyrauja fenolinės rūgštys – galo, vanilo, kavos, p-kumaro, ferulo, chlorogeno, rozmarino, cinamono rūgštis ir feno-linis, bei aldehidas – vanilinas. [16]

1.3. Propolio tirpalų gamyba

Tuopų propolis buvo surinktas Lietuvoje per 2015 m. iš bityno šalia lapuočių miško. Prieš analizę, propolio mėginiai buvo laikomi kambario temperatūroje, tamsioje vietoje. Pikis buvo susmulkintas ir užpiltas skirtingais tirpikliais. Po ekstrahavimo, propolio ekstraktai buvo filtruojami per filtrinius popierius. [11]

Propolio etanolinių tipralų gamyba.

Propolio etanoliniai tirpalai yra plačiai tiriami, propolio etanolinių tirpalų gamyba įprastai ruošiama tokia tvarka: atitinkamas kiekis propolio žaliavos užpilamas su 70- 95% etanolio tirpalu, paliekama 6-24 valandoms tamsioje vėsioje vietoje ekstrahuotis, tirpalas filtruojamas. Jeigu gaminamas sausas ekstraktas tuomet jis koncentruojamas, saugomas nuo šviesos ir laikomas užšaldytas −20°C.

Propolio neetanolinių tirpalų gamyba.

Propolio neetanolinių tirpalų gamyba reikalauja sudėtingesnių tehnologijų ir turi mažai mokslinės literatūros apie jų gamybą. Yra mažai mokslinės literatūros apie šį gamybos metodą dėl blogo veikliųjų medžiagų tirpumo.

Tirpiklių įvedimas labai svarbus, norint išgauti didesnį biologiškai aktyvių junginių kiekį. Papildomai įvesti tirpikliai gali pagerinti tirpumą: izopropilo miristatas, glicerolis, propilenglikolis ir kt. [17],[18 ]

Ekstrakcijai turi įtakos tirpiklio savybių pakeitimas. Keičiama tirpiklio pH gali pagerinti ekstrahuojamų medžiagų tirpumą. Kaip pavyzdys: didinant pH, gali geriau ekstrahuotis rūgštinių savybių turintys junginiai. [19]

Norint sukurti efektyvią ekstrakto technologiją svarbu parinkti ir tinkamą ekstrakcijos trukmę. Labai ilgas ekstrahavimo laikas bus neekonomiškas, nes ekstrahavimo greitis laikui bėgant mažėja, o jam sumažėjus, tolesnis ekstrahavimas bus nenaudingas. [20]

Tiriant temperatūros įtaką, buvo atliktas tyrimas, kurio metu LSMU ir VDU mokslininkai, tirdami kambario, 70 °C ir 100 °C temperatūros įtaką propolio veikliųjų medžiagų ekstrakcijai nustatė, jog pakėlus temperatūrą iki 70 °C, reikšmingai padidėjo išsiskyręs veikliųjų medžiagų kiekis. Keliant temperatūrą nuo 70 °C iki 100 °C, reikšmingo polifenolinių junginių kiekio padidėjimo nustatyta nebuvo. [21]

Standartiniai vandeniniai propolio tirpalai ruošiami tokia tvarka: atitinkamas kiekis propolio žaliavos užpilamas išgrynintu vandeniu iki bendro tūrio, paliekama apie 1-2 paras maceruotis, nufiltruojama, laikoma tamsaus stiklo talpyklėse, vėsioje vietoje.

Šis gamybos būdas išekstrahuoja mažai biologiškai aktyvių medžiagų, todėl mokslininkai ieško vis naujesnių tirpiklių pagerinančių neetanolinių tirpalų savybes.

1.4. Propolio biologinis poveikis

Propolio veikimo spektras yra labai platus. Jam būdingos tokios farmakologinės savybės kaip: antibakterinės, antivirusinės, priešgrybelinės, antioksidacinės, priešvėžinės, taip pat skausmą malšinančios, priešuždegiminės, skatinančios audinių regeneraciją ir t.t.

Dėl stipraus antimikrobinio poveikio propolis dažnai literatūroje vadinamas natūraliu antibiotiku. Propolis veikia prieš daugelį mikroorganizmų, grybelių bei virusų. Tokį jo poveikį įtakoja būtent cheminė sudėtis. Įrodyta, kad stipriau veikia gramteigiamas bakterijas (Staphylococcus aureus, Streptococus faecalis), silpniau – gramneigiamas bakterijas (Escherichia coli). Tyrimais buvo įrodyta, kad propolis veikia prieš tuberkuliozę sukeliančias bakterijas: Mycobactrium tuberculosis, Mycobacterium avium, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus piogenes ir Klebsiella pneumoniae [22]. O sukombinuotas kartu su sintetiniais vaistais (streptomicinu, rifamicinu, isoniazidu) ar kitais antibiotikais (chloramfenikoliu, gentamicinu, vankomicinu, tetraciklinu, clindamicinu) veikdamas kartu sinergistiškai sustiprina jų poveikį. [23]

Propolis pasižymi ir stipriomis antivirusinėmis savybėmis. Tokie biologiškai aktyvūs junginiai kaip flavonoidai chrizinas ir kemferolis gerai inhibuoja A ir B tipo gripo, herpes virusus, rotavirusus. [4]

Įrodytas propolio veikimas į širdies ir kraujagyslių sistemą. Nustatyta, kad propolis stimuliuoja kraujodarą, mažina kraujo krešėjimą, neleidžia formuotis trombams. Propolyje esantys flavonoidai kvercetinas, kempferolis ir kt. blokuoja kalcio transportą per ląstelių membranas taip sumažindamas kraujagyslių elastingumą. [22], [23]. Polifenoliai taip pat gali daryti teigiamą įtaką širdies vainikinėm kraujagyslėm. Nustatytas polifenolių hipotenzinis poveikis, kurį lemia panaši cheminė struktūra į sintetinius vaistus priklausančius beta-blokatorių grupei [25]. Taip pat, veikdami į azoto oksido sintazės veiklą, jie slopina ir angiotenziną konvertuojantį fermentą. [23],[24]. Dėl to tinka vartoti širdies ir kraujagyslių ligų profilaktikai.

Propolis skatina audinių regeneracijos procesus. Jame esantys sterinai, triterpeninės rūgštys ir kt. skatina epitelio ląstelių dalijimąsi. Aktyvina kraujo apytaką pažeidimo vietoje. Todėl stebimas efektyvus gydomasis rezultatas, gydant odos žaizdas, terminius pažeidimus.

Flavonoidai chrizinas ir galanginas taip pat kaip flavonai gali sumažinti estrogenų biosintezę. Įrodyta propolio veikla, aktyvuojant etrogenų receptorius. Todėl galima skirti hormonų terapijai vietoj sintetinių estrogenų. [26]

Flavonoidai, esantys propolyje, ne tik užkerta kelią cukraus kiekiui pakilti kraujyje, bet ir gali apsaugoti nuo šio sutrikimo metabolinių procesų. Buvo įrodyta, kad kvercetinas slopina aldozės reduktazes ir dalyvauja sorbitolio sintezėje. Todėl tinkamas diabeto profilaktikai. [27]

1.4.1. Antimikrobinis aktyvumas

Propolio antibakterinis poveikis priklauso nuo sudėtyje esančių fenolinių junginių. Jie efektyvūs tiek prieš gramteigiamias, tiek prieš gramneigiamas bakterijas. [28]

Antimikrobiniam propolio veikimui turi įtakos vietovė, kurioje jis rinktas. Propolis, surinktas Čilės centriniame slėnyje, yra veiksmingesnis nei iš pakrantės zonos. [29]. Europos klimato zonoje propolis rinktas nuo kaštonų buvo mažiau aktyvesnis, nei rinktas nuo tuopų, beržų ar kt. [30]. Propolis surinktas iš šiaurės ir centro Portugalijos turėjo didesnį aktyvumą prieš S. aureus bakteriją ir t.t. [12]

O ekstraktai pagaminti vandens ar aliejaus forma kambario temperatūroje turėjo 5-10 kartų mažesnį fenolių kiekį, bet taip pat parodė antimikrobinį aktyvumą. [11]

Nauji tyrimai įrodė ir propolio ekstrakto veiksmingumą prieš H.pylori bakteriją. [31]

Taip pat buvo nustatyta, kad propolio deriniai su kitais antibiotikais stiprina jų poveikį ir leidžia sumažinti vartojamų antibiotikų dozes. Sinergistinis propolio su antibiotikais veikimas buvo nustatytas Italijos mokslininkų- propolio PEE mėginys žymiai padidino ampicilino, gentamicino ir streptomicino poveikį. [12]

1.4.2. Antioksidacinis poveikis

Mažos aktyvių deguonies formų (ROS) koncentracijos būdingos aerobinės ląstelės normaliai būsenai. Jos susidaro, vykstant mitochondrijų kvėpavimo grandinės elektronų pernašos reakcijoms, ir peroksisomose. Kai tarp ROS susidarymo ir antioksidantų sutrinka pusiausvyra, atsiranda oksidacinis pažeidimas. Esant karščio, traumų, infekcijų ar kitų neigiamų aplinkos veiksnių, ROS koncentracija ląstelėse padidėja tiek, kad prasideda oksidacinis stresas, kuris gali sukelti ląstelės mirtį. Daugumos ligų patogenezei ROS yra svarbūs. ROS yra glaudžiai susijęs su įvairiomis ligomis: uždegiminės ir degeneracinės ligos, išemija, aterosklerozė, katarakta, vėžys, organizmo senėjimas. [32]

Tokie radikalai kaip: superoksido radikalas (O2•-), hidroksilo radikala (•OH), azoto monoksidas (NO•), peroksilo radikalas (ROO•), vandenilio peroksidas (H2O2) ir kt. sukelia laisvųjų radikalų reakcijas.

[33]

Radikalai formuojasi keliais mechanizmais. Formuojasi veikiant vidiniams ir išoriniams faktoriams. Vidiniai veiksniai, skatinantys laisvųjų radikalų susidarymą, yra audinių kvėpavimas, fermentinės, autooksidacijos ir fagocitozės reakcijos. [34]. Laisvųjų radikalų susidarymui turi įtakos net ir kai kurie ksenobiotikai. Paprastai natūrali organizmo gynybinė sistema šiuos laisvuosius radikalus neutralizuoja, paversdama juos nežalingais. Neigiamas išorinės aplinkos poveikis: UV spinduliavimas, aplinkos teršalai, rūkymas ir alkoholis.

Tyrimais įrodyta, jog propolio ir jo PEE ekstraktų antioksidantinis aktyvumas priklauso nuo fenolinių junginių ir jų aktyvumas netgi didesnis už tokius antioksidantus, kaip vit C ar vit E. [35]

Per pastaruosius metus, buvo atlikta daug tyrimų, siekiant įvertinti antioksidancinį pajėgumą iš natūralių produktų. Buvo įrodyta, jog propolio ekstraktai sudaryti iš įvairių polifenolių gali turėti stiprų antioksidacinį aktyvumą dėl fenolio rūgščių ir flavonoidų cheminės struktūros. [34],[36]

Polifenolių veikimo mechanizmas:

 slopina fermentų aktyvumą ir tokiu būdu slopina (ROS);

 Chelatiniai metalų jonai dalyvauja laisvųjų radikalų kūrimo procese;  sinergistiškai veikia su kitais antioksidantais.

Nors dažnai pabrėžiamas fenolinių junginių antioksidacinis veikimas, esant tam tikroms sąlygoms jie gali elgtis ir kaip prooksidantai, t.y. virsti cheminėmis medžiagomis, sukeliančiomis oksidacinį stresą. [34]. Tačiau prooksidacinis poveikis gali būti ne tik žalingas, bet ir naudingas. Jis sukelia lengvo laipsnio oksidacinį stresą, suaktyvina ląstelių antioksidacinę apsaugą ir netgi gali padidinti ksenobiotikus metabolizuojančių fermentų kiekį, o šių veiksnių pasekoje, ląstelė apsaugoma nuo žalingo aplinkos poveikio.

Lyginant antiradikalinį aktyvumą tarp vandeninių ir etanolinių propolio ekstraktų, vandeninis propolio tirpalas buvo 10 kartų aktyvesnis surišant H2O2 radikalus, nei etanolinis propolio ekstraktas [37].

(mg14). Tai įrodo, kad PVE pasižymi geresnėmis antioksidacinėmis savybėmis nei PEE.

1.4.3. Priešuždegiminis aktyvumas

Priešuždegiminės propolio savybės pasireiškia dėl jo sudėtyje esančių įvairių veikliųjų komponentų. Yra keletas tyrimų, parodančių, jog kavos rūgšties fenetilo esteris slopina uždegimo procesus. Propolio veikimo mechanizmui ištirti buvo paimti propolyje randami junginiai (CAPE, kavos rūgštis ir kvercetinas) ir nustatytas jų poveikis arachidono rūgšties metabolizmui. Buvo įrodyta, jog propolis veikia prieš uždegimą slopindamas prostaglandinų ir leukotrienų sintezę. Taip pat buvo nustatyta, jog propolis reikšmingai slopina ir lipooksigenazinį arachidono rūgšties metabolizmo kelią, o stipriausiu aktyvumu pasižymi būtent junginys CAPE. [38,39]

slopinimo ir prostaglandinų sintezės procese [41]. Įrodyta, kad priešuždegiminis propolio poveikis yra toks pat, kaip ir gydant nesteroidiniais priešuždegiminiais vaistais tik be šalutinio vaistų poveikio [42].

Atlikus tyrimus su tuopų tipo propolio etanoliniais ir vandeniniais ektraktais in vivo su žiurkėmis, buvo gauti rezultatai, jog PEE ir PVE turėjo teigiamą poveikį šių ligų gydyme, sumažindami prostaglandinų kiekį. O PVE pasižymėjo net geresniu poveikiu ir turėjo dar mažiau šalutinių poveikių. [43].

1.4.4. Priešvėžinis aktyvumas

Pastaruoju metu mokslininkus labai sudomino propolio potencialas vėžinių ligų gydymui. Buvo įrodyta, jog keletas propolio komponentų stimuliuoja vėžinių ląstelių apoptozę (programuotą ląstelių mirtį) bei skatina šių ląstelįų pašalinimą iš organizmo. Taip pat buvo nustatyta, kad propolio preparatai gali padėti slopinti vėžinio proceso vystymąsi ir taip pagerinti išgyvenamumą. [44]

Atlikti tyrimai parodė, jog priešvėžinės propolio savybės labai priklauso nuo skiriamos dozės ir jame esančių junginių. Skirtingi propolio junginiai skirtingai veikia įvairias vėžio formas. O jo priešvėžinis aktyvumas nepriklauso tik nuo vieno komponento. [8]. Buvo stebėta antiproliferacinė propolio veikla ant ląstelių U937 ir, naudojant skirtingas metanolinio propolio ekstrakto koncentracijas, buvo nustatyta, jog stipriai slopino U937 ląstelių augimą priklausomai nuo tirpalo dozės. [45]

Chrizinas - tai vienas iš propolio komponentų pasižymintis dideliu biologiniu aktyvumu. Jis natūralus flavanoidas randamas augaluose. Chrizinas turi antioksidacinių ir priešuždegiminių savybių. Taip pat jau įrodyta, kad turi ir stiprų priešvėžinį aktyvumą. Būtent flavonoidai įtakoja apoptozės procesą daugelio tipų ląstelių linijose. Buvo nustatya, kad chrizinas mažomis koncentracijomis indukuoja apoptozę U937 ląstelių tipui. Taip pat stimuliuoja kaspazė-3, kuri atlieka svarbų vaidmenį ląstelių mirčiai. [45]. Kiti tyrimai parodė, jog chrizinas įtakojo ir žmogaus žarnos, kepenų bei nosiaryklės vėžio apoptozę. [46]

pažaidos. Kadangi CAPE labai mažai arba visai neturi šalutinių poveikių yra siūloma kaip gero ir saugaus vaisto alternatyva vėžiui gydyti, kuri ne tik slopintų naviko augimą, bet ir apsaugotų pacientus nuo chemoterapijos ar spindulinio gydymo nepageidaujamo poveikio.

Tai pat buvo įrodyta, kad tuopų propolyje esantis kavos rūgšties fenetilo esteris (CAPE) ir kvercetinas geba sumažinti plaučiuose esančias vėžines ląsteles. Manoma, jog tuopų tipo propolio priešvėžinis aktyvumas užtikrinamas dėl propolyje esančių polifenolinių junginių sinerginio poveikio, o ne atskirų jo sudedamųjų dalių [48].

Neseniai Lenkijos mokslininkai įrodė, kad TMZ ir propolio PEE tam tikrų koncentracijų tirpalai, sustiprino sintetinio vaisto TMZ poveikį. Buvo stebimas laipsniškai mažėjantis ląstelių gyvybingumas ir poliferacijos pokytis. Priešnavikinis poveikis TMZ su propolio PEE buvo stipresnis nei lyginant kiekvieną atskirai. Taip pat ,vartojant juos kartu, buvo nustatytas ir mažesnis toksinis poveikis organizmui. [49]

Turkijoje atlikus tyrimus, paiškėjo, kad, tiriant DMSO ir vandeninį propolio ekstraktą kartu, buvo sustiprintas priešvėžinis poveikis prostatos vėžio ląstelėms. [50]

Propolio priešvėžinis aktyvumas plačiai ištirtas su propolio etanoliniais tirpalais. Tačiau biologinio poveikio tyrimų su neetanoliniais tirpalais yra labai mažai arba nėra visai.

2. METODIKA

2.1. Naudotos medžiagos ir aparatūra

2.1.1. Naudotos medžiagos

1) Ląstelių auginimo terpė (DMEM) (Sigma-Aldrich Sigma Aldrich, D5796) 2) Fetalinis veršelio serumas (FBS) (Sigma-Aldrich)

3) Fosfatinis druskos buferis (PBS) (Sigma-Aldrich)

5) Tripano mėlio dažų tirpalas (0,4%) (Sigma-Aldrich) 6) C2H5OH – etanolis (UAB ,,Stumbras”)

7) 0,25% tripsino/EDTA tirpalas (Sigma, T4049)

8) Organinis tirpiklis - dimetilsulfoksidas (DMSO; Sigma Aldrich, 34943) 9) HBSS (Hanks’ balanced salt solution; Sigma Aldrich, H8264)

2.1.2. Naudota aparatūra

1) Spektrofotometras ,,UNICOM UV/VIS”

2) Laboratorinės analizinės svarstyklės (0,0001 tikslumo) HF-1200 GD, A&D Company 3) Fluorescencinis mikroskopas (OLYMPUS IX71S1F-3)

4) Centrifuga Eppendorf

2.2. Propolio tirpalų gamyba

2 lentelė. Skirtingų propolio ištraukų gamybos sąlygos [11]

Mėginys Sudėtis Ištraukos temperatūra Ekstrakcijos laikas Bendras fenolių kiekis μg/ml GAE PVT Propolis 10 g, vanduo iki 100 ml. Kambario temperatūra 5 h 1207.9 PEG Propolis 10 g, PEG 400 20 g, vanduo iki 100 ml. 70° C 15 min. 2149.5 EEP Propolis 10 g, etanolis70 % iki 100 ml Kambario temperatūra 5 h 20791.3

2.3. Fenolinių junginių kiekybinis nustatymas Folin- Ciocalteu metodu

Bendras fenolinių junginių kiekis nustatomas Folin-Ciocalteu metodu. Į tiriamąjį propolio tirpalą pilame 0.2N Folin- Ciocalteu reagento ir neutralizuojame reakciją su natrio karbonatu (75g/L). Po 2 val. inkubacijos tirpalus dedame į spektofotometrą ir 760 nm bangos ilgyje nustatome tirpalų optinį tankį, naudojant palyginamąjį tirpalą. Fenolinių junginių kiekis nustatomas pagal galo rugšties kalibracinę kreivę. Fenolinių junginių koncentracija pateikta pagal galo rūgšties ekvivalentą. Kiekvieno pavyzdžio ekperimentų skaičius n = 3.

2.4. Ląstelių sėjimo metodika

Ląsteles atskirti naudojau 0, 25% tripsino/EDTA tirpalą. Tripsinas - tai fermentas, ardantis tarpląstelines jungtis, kurį uždėjus ant auginimo flakone esančių ląstelių ir palikus keletą minučių, ląsteles galime atskirti nuo auginimo flakonų. Atsiskyrusios ląstelės buvo centrifuguojamos penkias minutes 1500 apsisukimų per minute greičiu, 25°C temperatūroje.

2.5. Ląstelių tankio nustatymas

Ląstelėms skaičiuoti naudojome hemocitometrą (1 pav.) bei triptano mėlio dažų tirpalą. 20 μl triptano mėlio dažų tirpalo sumaišoma su 20 μl ląstelių suspensijos, tada patalpinama ant hemocitometro kameros po dengiamuoju stikleliu. Stebima pro šviesinį mikroskopą ir skaičiuojamas ląstelių skaičius keturiuose langeliuose. Jei ląstelių membrana buvo pažeista triptano mėlis lengvai praėjo pro jas, todėl mėlynai nusidažiusos ląstelės skaičiuojamos nebuvo, jos buvo negyvos.

1 pav. Hemocitometro kamera. Ši kamera yra padalinta į devynis kvadratus 1.0 mm x 1.0 mm, kiekvinas kvadratas atskirtas vienas nuo kito trigubomis linijomis. Kiekvienas kvadratas yra 1 mm²

ploto.

Ląstelių skaičius 1 mililitre apskaičiuojamas pagal formulę: n = (a+b+c+d)*4*2*5000, kurioje:

n – ląstelių skaičius 1 ml;

2 – skiedimų skaičius.

Reikiamas ląstelių kiekis pasėjamas į plokštelę su 96 šulinėliais.

2.6. Ląstelių gyvybingumo nustatymas MTT testu

MTT arba 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromidas, yra saugus ir plačiai naudojamas dažas. MTT kolometrinis metodas skirtas ląstelių gyvybingumui bei citotoksiškumui nustatyti. MTT yra labiau žinomas kaip metodas siekiant nustatyti mitochondrijų dehidrogenazės aktyvumą gyvose ląstelėse. Naudojant šį metodą, MTT virsta netirpiais purpuriniais formazano kristalais ((E,Z)-5-(dimetiltiazol-2-il)-1,3-difenilformazanas) veikiant nuo NAD(P)H priklausomomis oksoreduktazėmis (2 pav.). Todėl, prieš matuojant absorbciją, šiuo metodu būtinai reikalingas organinis tirpiklis, kad ištirpintų susidariusius kristalus. Mūsų tyrime buvo naudojamas organinis tirpiklis - dimetilsulfoksidas.

2 pav. Geltonos spalvos MTT veikiamas mitochondronei reduktazei redukuojasi į violetinės spalvos formazaną.

tamsoje. Tuomet atlikti matavimai su spektrofotometru. Absorbcija buvo matuojama prie 550 nm bangos ilgio ir 620 standartinio bangos ilgio.

2.7. Ląstelių gyvybingumo nustatymas propidžio jodido/Hoechst metodu

Ląstelių gyvybingumą papildomai vertinome fluorescencinės mikroskopijos metodu, veikdami ląsteles propidžio jodido ir Hoechst 33342 dažais. Į kiekvieną iš 24 šulinėlį buvo pasėta po 20 000 ląstelių ir jos inkubuotos 24 h., po inkubacijos šulinėliai buvo papildyti įvairiais kiekias tiriamų tirpalų ir inkubuota 24 h. Praėjus inkubacijos terminui, į šulinėlius buvo sudėta propidžio jodidas, kuris nekrozinius ląstelių branduolius nudažo raudona spalva, ir Hoechst 33258, kuris gyvybingų ląstelių branduolius nudažo mėlyna spalva. Fluorescenciniu mikroskopu (OLYMPUS IX71S1F-3) fotografuoti 4 laukeliai kieviename šulinėlyje. Ląstelės, kurių blanduoliai UV šviesoje švytėjo mėlynai, buvo vertinamos kaip gyvybingos. Ląstelių branduoliai UV šviesioje švytintys raudonai, buvo vertinami kaip nekroziniai.

2.8.Ląstelių proliferacijos tyrimas

Šio tyrimo metu stebėjome ląsteles, paveiktas tokiomis propolio neetanolinių ir etanolinio tirpalo koncentracijomis, kurios dar nesukelia ląstelių žūties ir lyginome su kontrole. Pokyčius vertinome fluorescencinės mikroskopijos metodu, jas veikdami pripidžio jodido ir Hoechst 33342 dažais. Ląsteles fotografavome fluorescenciniu mikroskopu. Kiekviename šulinėlyje buvo daroma po 4 nuotraukas ir skaičiuojamos ląstelės.

2.9.Statistinė duomenų analizė

3. DARBO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1. Skirtingų propolio tirpalų fenolinių junginių kiekio nustatymas

Pirmose eksperimentų serijose buvo norima nustayti fenolinių junginių kiekį skirtinguose propolio tipraluose. Šiuos tyrimus atlikome Folin-Ciocalteu metodu. Rezultatai pateikti 3 paveiksle.

Propolio tirpalai

PVE PEG PEE

F e n o lin iu j u n g in iu k ie k is mi k ro lit ra is 0 5000 10000 15000 20000 25000

*

*

3 pav. Fenolinių junginių kiekis skirtinguose propolio tirpaluose n=3, *p < 0.05 vs kontrolė

Tyrimai parodė, kad pagamintame vandeniniame propolio tirpale yra 1207.9 µg/ml fenolinių junginių. Pagamintame vandeniniame propolio tirpale su PEG nustatėme fenolinių junginių 57,75 proc. daugiau (2090.9 µg/ml) lyginant su vandeniniu tirpalu. Tuo tarpu etanoliniame propolio tirpale buvo nustatytas net 10 kartų didesnis fenolinių junginių kiekis lyginant su PEG tirpalu (20791.3 µg/ml).

Kadangi mūsų tirtame propolio etaloniniame tirpale rasta 20791.3 µg/ml fenolinių junginių, galime teigti, kad nustatytas fenolių kiekis buvo didesnis lyginant su kitų mokslininkų pagamintais PEE tirpalais.

B. Rocha, P. Bueno ir kt. tyrė vandeninį propolio tirpalą ir jame nustatė 2300.0 µg/ml (p < 0.05) fenolinių junginių kiekį; tuo tarpu, mūsų tyrime jų buvo mažiau 1207.9 µg/ml. [37]

J. Jasaitytė savo darbe nustatė, kad naudojant propolio ekstrakcijai vandeninius makrogolio ir propilenglikolio tirpiklius gauti fenolinių junginių kiekiai buvo reikšmingai didesni, nei tirpikliu naudojant vien tik vandenį. Mūsų pagamintame vandeniniame tirpale su PEG fenolinių junginių kiekis taip pat buvo 80% didesnis lyginant su tik vandeniniu tirpalu.

Kituose darbuose taip pat buvo nustatytas geresnis PEG poveikis lyginant su vandeniniu tirpalu. L. Kubiliene, D. Majiene ir kt. savo tyrime nustatė, kad jų pagamintas vandeninis tirpalas su PEG tirpikliu turėjo fenolinių junginių 10.7 mg/ml, vos mažiau už etanolinį tirpalą 12.7 mg/ml, bet reikšmingai didesnį už vandeninį propolio tirpalą 1.6 mg/ml. [11]

Lyginant mūsų gautą vandeninį tirpalą su PEG ir anksčiau gautus rezultatus, įdėjus į vandeninį tirpalą PEG, tirpiklio veikliųjų junginių kiekis padidėjo lyginant tik su vandeniniu, tačiau buvo statistiškai reikšmingai mažesnis lyginant su PEE.

3.2. MTT metodu skirtingų propolio tirpalų poveikis C6 ląstelių gyvybingumui

PVE propolio tirpalo koncentracija mikrolitrais Kontrole 3 µl 5 µl 10 µl 15 µl 20 µl 30 µl C 6 l a s te liu g y vy b in g u ma s p ro c e n ta is 0 20 40 60 80 100 120

*

*

*

*

_*

4 pav. PVE propolio tirpalo poveikis C6 ląstelių gyvybingumui po 24 valandų 1µl yra 1, 2 µg fenolinių junginių; n=3; *p < 0.05 vs kontrolė

.

PEG propolio tirpalo koncentracija mikrolitrais Kontrole 3µl 5µl 10µl 15µl 20µl 30µl C 6 l a s te liu g y vy b in g u ma s p ro c e n ta is 0 20 40 60 80 100 120

*

*

*

*

*

*

5 pav. PEG propolio tirpalo poveikis C6 ląstelių gyvibingumui po 24 valandų 1µl yra 2, 1µg fenolinių junginių ; n=3; *p < 0.05 vs kontrolė

.

PEE propolio tirpalo koncentracija mikrolitrais Kontrole 1µl 2µl 3µl 4µl 5µl 6µl C 6 l a s te liu g y vy b in g u ma s p ro c e n ta is 0 20 40 60 80 100 120

*

*

*

*

*

6 pav. PEE tirpalo poveikis C6 ląstelių gyvybingumui po 24 valandų 1µl yra 2 µg fenolinių junginių; n=3; *p < 0.05 vs kontrolė

.

D.Sawicka ir. kt. tyrė propolio etanolinio tirpalo priešvėžinį poveikį U87MG žmogaus gliobastomos ląstelėse ir nustatė, kad po 24 valandų 30 μg/ml etanolinis propolio tirpalas taip pat statistiškai reikšmingai sumažino ląstelių gyvibingumą.

D.Sawicka ir kt. tyrime kombinuotas PEE propolio tirpalas su TMZ paveikus ląsteles nuo -žemiausios iki aukščiausios koncentracijos sumažino ląstelių gyvibingumą nuo 74 iki 34 %. [49]

U.Czyzewska, K.Siemionow ir kt. atliko tyrimus su žmogaus liežuvio vėžinėm ląstelėm CAL-27. Ir nustatė, kad paveikus CAL-27 ląsteles 54.1 μg/ml etanolinio propolio tirpalu buvo fiksuotas stipriausias citotoksinis veikimas. [51]. Kiti mokslininkai tyrė ta pačią ląstelių liniją ir nustatė, kad 34.27 μg/ml koncentracija etanolinio propolio tirpalo taip pat stipriai sumažino ląstelių gyvybingumą. [52]

Mūsų tyrimo rezultatai parodė, jog visi tirti propolio tirpalai mažina C6 ląstelių gyvybingumą. Didžiausiu ląstelių gyvybingumą mažinančiu poveikiu pasižymėjo etanolinis propolio tirpalas ir vandeninis propolio tirpalas su PEG , silpniau gyvibingumą sumažino vandeninis propolio tirpalas. Taip pat anksčiau atlikti tyrimai su propolio etanoliniu tipralu patvirtino poveikį C6 ląstelių gyvybingumuo mažinimui po 24 valandų inkubacijos. [49]. O atlikti papildomi tyrimai su grynu etanoliniu tirpikliu parodė, kad eksperimente naudoti jo kiekiai poveikio lastelių gyvibingumui neturėjo.

3.3. Propodžio jodido/Hoechst 33528 metodu nustatytas propolio tirpalų poveikis

C6 ląstelių gyvybingumui

Tolimesnėse eksperimentų serijose vertinome propolio tirpalų poveikį ląstelių gyvybingumui fluorescencinės mikroskopijos metodu. Citotoksiniam propolio tirpalų poveikiui įvertinti buvo naudojama ląstelių dažymo metodika. Dažymo metu naudojamas propidžio jodidas, paveikdamas DNR, nekrozinius glioblastomos ląstelių branduolius nudažo raudona spalva. O naudojamas Hoechst 33258 dažas pereidamas per membraną ir paveikdamas ląstelės DNR, gyvybingų ląstelių branduolius nudažo mėlyna spalva.

7 pav. Tipinės nuotraukos, parodančios citotoksinį vandeninio propolio tirpalo poveikį po 24 h. A nuotraukoje matome 3 μl vandeninio propolio tirpalo poveikį C6 ląstelėms, B – 3 μl ląstelių nuotrauka be fluorescencijos. C – 30 μl vandeninio propolio tirpalo poveikį C6 ląstelėms, D - 30 μl

Tyrimų rezultatai pateikti 8, 9 ir 10 paveiksluose vertinant gyvybingų ir negyvybingų ląstelių skaičius išreikštas procentais po 24 valandų.

PVE propolio tipralo koncentracija mikrolitrais

kontrole 3 µl 5 µl 10 µl 15 µl 20 µl 30 µl G y vy b in g u / N e g y vy b in g u l a s te liu s k a ic iu s p ro c e n ta is 0 20 40 60 80 100 120

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

8 pav. Vandeninio propolio tirpalo poveikis C6 ląstelių gyvybingumui po 24 valandų. 1µl yra 1,2 µg fenolinių junginių; n=3; *p < 0.05 vs kontrolė.

PEG propolio tipralo koncentracijos mikrolitrais Kontrole 3 µl 5 µl 10 µl 15 µl 20 µl G y vy b in g u /N e g y vy b in g u C 6 l a s te liu s k a ic iu s p ro c e n ta is 0 20 40 60 80 100 120

*

*

* *

*

*

*

*

9 pav. Vandeninio propolio tirpalo su PEG poveikis C6 ląstelių gyvybingumui po 24 valandų. 1µl yra 2, 1µg fenolinių junginių; n=3; *p < 0.05 vs kontrolė.

PEE propolio tirpalo koncentracija mikrolitrais Kontrole 1 µl 2 µl 3 µl 4 µl 5 µl G y vy b in g u / N e g y vy b in g u C 6 l a s te liu s k a ic iu s p ro c e n ta is 0 20 40 60 80 100 120

*

*

*

*

*

*

*

*

10 pav. Etanolinio propolio tirpalo poveikis C6 ląstelių gyvybingumui po 24 valandų. 1µl yra 2 µg fenolinių junginių; n=3; *p < 0.05 vs kontrolė.

Grafike pateikti duomenys gyvybingų/negyvybingų ląstelių skaičius išreikštas procentais. Paveikus ląsteles 1 μl PEE, gyvybingų ląstelių skaičius nepakito (90,9%). Ląsteles paveikus 2 μl PEE propolio tirpalu, gyvybingų ląstelių skaičius sumažėjo perpus, o nekrozinių ląstelių skaičius išaugo dvigubai (53,33% gyvybingų ląstelių ir 46,67% negyvybingų ląstelių). Paveikus ląsteles 3 – 5 μl etanoliniu propolio tirpalu, gyvybingų ląstelių skaičius sumažėjo (38,18% - 1,21%), o negyvybingų ląstelių skaičius išaugo (61,82 – 98,79%).

D.Sawicka ir. kt. taip pat tyrė propolio etanolinio tirpalo priešvėžinį poveikį U87MG žmogaus gliobastomos ląstelėse ir nustatė, kad po 24 valandų 30 μg/ml etanolinis propolio tirpalas statistiškai reikšmingai sumažino ląstelių gyvibingumą. Šių mokslininkų gauti rezultatai yra labai panašūs į mūsų tyrimų, atliktų su C6 ląstelių kultūra, rezultatus. Abiejų tyrimų gauti rezultatai, patvirtina, kad propolio etanolinis tirpalas efektyviai mažina vėžinių ląstelių gyvybingumą. [49]

tiesiosios žarnos). Jie nustatė, jog paveikus ląsteles 250 μg/ml PEE, ląstelių mirtingumas padidėjo daugiau kaip 50%. Taip pat įrodė, kad citotoksinis veikimas priklauso nuo laiko, tačiau statistiškai reikšmingi pakitimai vyksta būtent per pirmąsias 24h. [53]

3.4. Skirtingų propolio tirpalų poveikis C6 ląstelių proliferacijai

Proliferacija - tai ląstelių populiacijos augimas dalijimosi būdu. Viena ląstelė („motininė ląstelė“) auga ir dalijasi į dvi „dukterines lasteles“. Proliferacijos sutrikimai gali sukelti ligas, tokias

kaip vėžį, leukemiją, proliferacinę vitreoretinopatiją ir t. t. Jei audinys yra pažeidžiamas, normalios

ląstelės gauna signalą iš kaimyninių ir pradeda dalintis, taip pakeisdamos žuvusias ląsteles. Tačiau šis procesas navikinėse ląstelėse yra sutrikęs, jos praranda dalijimosi kontrolę. Tai puikiai atsispindi ląsteles auginant mitybinėje terpėje, kai flakone susidaro monosluoksnis, normalių ląstelių dalijimosi greitis sulėtėja dėl aplinkos dirgiklių, o navikinės ląstelės dalijasi toliau. [54]

Trečiose eksperimentų serijose, vertindami propolio tiprakų poveikį ląstelių proliferacijai, pasirinkome mažesnes tiriamųjų junginių koncentracijas, kurios neįnicijuoja ląstelių žūties. Gautų tyrimų rezultatus pateikėme 11 – 18 paveiksluose.

12 pav. Tipinės nuotraukos, parodančios antiproliferacinį PEG propolio tirpalo poveikį C6 ląstelėms, po 24h (A- kontrolė, B - 1.5 μl).

14 pav. PEG propolio tirpalas sumažina C6 ląstelių proliferaciją po 24 ir po 48 valandų inkubacijos

1µl yra 2, 1µg fenolinių junginių; n=3; *p < 0.05 vs kontrolė

15 pav. PVE propolio tirpalas sumažina C6 ląstelių proliferaciją po 24 ir po 48 valandų inkubacijos

1µl yra 1, 2 µg fenolinių junginių; n=3; *p < 0.05 vs kontrolė

16 pav. Tipinės nuotraukos, parodančios antiproliferacinį PEE propolio poveikį C6 ląstelėms, po 24h (A- kontrolė, B- 0.4 μl).

18 pav. PEE propolio tirpalas sumažina C6 ląstelių proliferaciją po 24 ir po 48 valandų inkubacijos

1µl yra 20 µg fenolinių junginių; n=3; *p < 0.05 vs kontrolė

18 paveiksle matyti, jog paveikus ląsteles 0.4 μl koncentracijos PEE propolio tripalu, po 24 valandų inkubacijos ląstelių skaičius statistiškai reikšmingai sumažėjo 40%. Paveikus ląsteles 0.8 μl – 1 μl PEE propolio tirpalu, antipoliferacinio poveikio nebuvo. Buvo stebima ląstelių žūtis. Paveikus ląsteles 0.4 μl PEE propolio tirpalu, po 48h inkubacijos jų skaičius sumažėjo 73%. O paveikus didesnėm 0.8 – 1 μl PEE propolio tirpalu ląstelės taip pat žuvo.

Kiti autoriai tyrinėjo PEE propolio tirpalą ant penkių vėžinių ląstelių linijų. Ir nustatė, kad nuo 41,3 iki 52,4 mg / ml propolis pasižymėjo stipriu antipoliferaciniu poveikiu. [55]. Buvo įrodytas ir PEE propolio tirpalo antipoliferacinis veikimas ant žmogaus prostatos vėžinių ląstelių. [56].

Buvo lyginamas sintetinio doksorubicino ir propolio junginių poveikis BT474 ląstelių linijai. Paveikus 10 µg/ml propolio junginiais buvo stebėtas antipoliferacinis poveikis. [57]

Paveikus vėžinių ląstelių linijas glioma (U251), melanoma (UACC-62), krūties (MCF-7) ir kt. 35 g / ml propolio PEE tirpalu, buvo stebimas ląstelių antipoliferacinis poveikis. [58]

Alikti tyrimų rezultatai atskleidė, jog propolio tirpalai ne tik slopina C6 ląstelių gyvybingumą, bet ir proliferaciją. Gyvybingumo bei proliferacijos tyrimuose didžiausiu aktyvumu pasižymėjo PEE propolio tirpalas, PEG propolio tirpalui ir PVE propolio tirpalui reikėjo didesnių koncentracijų, kad gauti panašų poliferaciją slopinantį poveikį.

IŠVADOS

1. Pagaminti propolio tirpalai turėjo skirtingą fenolinių junginių kiekį. Propolio tirpale, pagamintame naudojant tirpiklių mišinį (vanduo ir 20 proc. PEG), fenolinių junginių buvo 57, 75 % daugiau lyginant su propolio vandeniniu tirpalu. Propolio etanolinis tirpalas turėjo net 10 kartų didesnį fenolinių junginių kiekį. Mažiausias fenolinių junginių kiekis buvo nustatytas propolio vandeniniame tirpale. (p<0,05)

2. Visi propolio tirpalai priklausomai nuo koncentracijos mažino C6 ląstelių gyvybingumą. Stipriausiu ląstelių gyvybingumą mažinančiu poveikiu pasižymėjo propolio etanolinis tirpalas, žymiai silpnesniu poveikiu pasižymėjo neetanoliniai propolio tirpalai.

PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS

LITERATŪRA

1. Fokt H, Pereira A, Ferreira AM, Cunha A, Aguiar C. How do bees prevent hive infections? The antimicrobial properties of propolis. FORMATEX, 2010 m.

2. Park YK, Alencar SM, Aguiar CL. Botanical origin and chemical composition of Brazilian propolis. Journal of Agriculture and Food Chemistry. 2002 m.; 50:2502–2516.

3. Kujumgiev A, Tsvetkova I, Serkedjieva Y, Bankova V, Christov R, Popov S. Antibacterial, antifungal and antiviral activity of propolis from different geographic origins. Journal of Ethnopharmacology. 1999 m.; 64:235–40.

4. Wang HK, Xia Y, Yang ZY, Natschke SL, Lee KH. Recent advances in the discovery and development of flavonoids and their analogues as antitumor and anti-HIV agents. Adv. Exp. Med. Biol. 1998 m.; 439, 191–225.

5. Ota C, Unterkircher C, Fantinato V, Shimizu MT. Antifungal activity of propolis on different species of Candida. Mycoses. 2001m.; 44:375–378.

6. Russo A, Longo R, Vanella A. Antioxidant activity of propolis: role of caffeic acid phenethyl ester and galangin. Fitoterapia. 2002 m.; 73:S21–S29.

7. Barak V, Birkenfeld S, Halperin T, Kalickman I. The effect of herbal remedies on the production of human inflammatory and anti-inflammatory cytokines. The Israel Medical Association Journal. 2002 m.; 4:919–922.

8. Sawicka D, Car H, Borawska MH, Nikliński J. The anticancer activity of propolis. Folia histochemica et cytobiologica. 2012 m.; Vol. 50, No. 1,pp. 25–37.

9. Konishi, Y. Transepithelial transport of artepillin C in intestinal Caco-2 cell monolayers. Biochim. Biophys. 2005 m.; 1713, 138–144.

10. A.Gendrolis. Propolis. Kaip ilgai ir sveikai gyventi. Kaunas, 2010 m.

11. Kubiliene L, Laugaliene V, Pavilonis A , Maruska A, Majiene D, Barcauskaite K , Kubilius R, Kasparaviciene G, Savickas A. Alternative preparation of propolis extracts: comparison of their composition and biological activities. Alternative Medicine. 2015 m.;15:156

12. Silva R, Baltazar F, Almeida C. Propolis: A complex natural product with a plethora of biological activities that can be explored for drug development. Evidence-based complementary and alternative medicine volume. 2015 m.; Article ID 206439, 29 pp.

14. Marcucci MC, Ferreres F, Garcia-Viguera C, Bankova VS, De Castro SL, Dantas AP, Valente PH, Paulino N. Phenolic compounds from Brazilian propolis with pharmacological activities. J Ethnopharmacol. 2001 m.; 74(2):105.

15. Majiene D, Trumbeckaite S, Grunoviene D, Ivanauskas L, Gendrolis A. Investigation of chemical composition of propolis extract. Medicina (Kaunas) 2004 m.; 40(8)

16. Ramanauskienė K, Savickas A, Inkėnienė A, Vitkevičius K, Kasparavičienė G, Briedis V, Amšiejus A. Analysis of content of phenolic acids in Lithuanian propolis using high-performance liquid chromatography technique. Medicina (Kaunas) 2009 m.; 45(9)

17. Engelbrecht TN, Deme B, Dobner B, Neubert RHH. Study of the influence of the penetration enhancer isopropyl myristate on the nanostructure of stratum corneum lipid model membranes using neutron diffraction and deuterium labelling. Skin pharmacology and physiology. 2012 m.; 25(4), 200-207.

18. Savickas A., Briedis V., Švambaris L., Drakšienė G., Klimas R., Ramanauskienė K., Inkėnienė A. M. Vaistų technologija (V tomas). Kaunas: Universiteto vadovėlis; 2008 m.

19. Mello BC, Hubinger M. D. Antioxidant activity and polyphenol contents in Brazilian green propolis extracts prepared with the use of ethanol and water as solvents in different pH values. International Journal of Food Science and Technology. 2012 m.

20. Kartal M, Yildiz S, Kaya S, Kurucu S. Antimicrobial activity of propolis samples from two different regions of Antolia. Journal of Ethnopharmacology. 2003 m.; 86 psl. 69 – 73.

21. Kubilienė L ir kt. The influence of technological processes on extraction of chemical compounds of propolis. Sveikatos mokslai. 2011m; Volume 21, Number 2, p. 105-108

22. Valcic S, Montenegro G, Mujica AM, Avila G, Franzblau S, Singh MP, Maiese WM, Timmermann BN. Phytochemical, morphological, and biological investigations of propolis from Central Chile. Z Naturforsch C. 1999 m.; 54(5-6):406-16.

23. Scheller S, Dworniczak S, Waldemar K, Rajca M, Tomczyk A, Shani J. Synergism between ethanolic extract of propolis (EEP) and anti-tuberculosis drugs on growth of mycobacteria. Z Naturforsch C. 1999 m.; 54(7-8):549-53.

24. Rohdewald P. A review of the French maritime pine bark extract (Pycnogenol), a herbal medication with a diverse clinical pharmacology. Int. J. Clin. Pharmacol. Ther. 2002m.; 40, 158– 168.

25. Yoko K, Keizo U, Kyokok K. Anti-hypertensive effects of propolis in spontaneosl hypertensive rats. Clin. Pharmacol. Physiol. 2004 m.; 32, 29–30.

26. Song YS, Jin C, Jung KJ, Park EH. Estrogenic effects of ethanol and ether extract of propolis. J. Ethnopharmacol. 2002 m.; 82, 89–95.

28. Kartal M, Yildiz S, Kaya S, Kurucu S, Topcu G. Antimicrobial activity of propolis samples from two different regions of Anatolia. J Ethnopharmacol. 2003 m.; 86(1):69-73.

29. Villanueva M, González M, Fernández H, Wilson M, Manquián N, Otth C, Otth L. In vitro antibacterial activity of Chilean propolis against Helicobacter pylori. Rev Chilena Infectol. 2015 m. spalis; 32(5):530-5.

30. Silva-Carvalho R, Baltazar F, Almeida-Aguiar C. A complex natural product with a Plethora of biological activities that can be explored for drugs development. Alternat Med. 2015m.; 2015:206439

31. Cui K, Lu W, Zhu L, Shen X, Huang J. Caffeic acid phenethyl ester (CAPE), an active component of propolis, inhibits Helicobacter pylori peptide deformylase activity. Biochem Biophys Res Commun. 2013 m. gegužės 31d.;435(2):289-94.

32. Weinstein E , Message D , Negri G , Stringheta AS. Seasonal Variation, Chemical Composition and Antioxidant activity of Brazilian Propolis Samples. Advance Access Publication. 2008 m. sausio 31d.; 2010;7(3)307–315.

33. Gulcin, I. Antioxidant activity of food constituents: An overview. Arch. Toxicol. 2012m.; 86, 345– 391.

34. Lapidot T, Walker MD, Kanner J. Antioxidant and prooxidant effects of phenolics on pancreatic beta-cells in vitro. J Agric Food Chem. 2002 m.; 50:7220–7225.

35. Ostrowska J, Skrzydlewska E. The biological activity of flavonoids. Post. Fitoter. 2005 m.; 3– 4,71–79.

36. Pietta, P.G. Flavonoids as antioxidants. J. Nat. Prod. 2000 m.; 63, 1035–1042.

37. Rocha BA, Bueno CP, Nascimento AP, Ferreira NU, Moreno G, Rodrigues MR, Barizon EA, Campos J, Francielli P de Oliveira, Acésio N, Martins S. Evaluation of a Propolis Water Extract Using a Reliable RP-HPLC Methodology and In Vitro and In Vivo Efficacy and Safety Characterisation. Alternative Medicine Volume 2013 m.; Article ID 670451, 11 psl.

38. Rossi A, Ligresti A, Longo R, Russo A, Borrelli F, Sautebin L. The inhibitory effect of propolis and caffeic acid phenethyl ester on cyclooxygenase activity in J774 macrophages. Phytomedicine 2002 m.; 9, 530–535.

39. Mirzoeva OK, Calder PC. The effect of propolis and its components on eicosanoid production during the inflammatory response. Prostaglandins Leucot. Essent. Fatty Acids. 1996 m.; 55, 441– 449.

40. Borrelli F, Maffia P, Pinto L, Ianaro A, Russo A, Capasso F, Ialenti A. Phytochemical compounds involved in the anti-inflammatory effect of propolis extract. Fitoterapia 2002 m.; 73, 53–63

42. Reis C.M.F, Carvalho J.C.T, Caputo L.R.G, Patrício K.C.M. Anti-inflammatory, anti-ulcer and subchronic toxicity ethanol extract of propolis. Rev. Bras. Farmacogn. 2000 m.; 9, 43–52.

43. Nolkemper S, Reichling J, Senschc KH, Schnitzler P. Mechanism of herpes simplex virus type 2 suppression by propolis extracts. Phytomedicine. 2010m.; 132–138.

44. Bankova V. Recent trends and important developments in propolis research. Evid Based Complement Alternat Med 2005 m.; 2(1): 29-32.

45. Woo KJ, Jeong YJ, Park JW, Kwon TK. Chrysin-induced apoptosis is mediated through caspase activation and Akt inactivation in U937 leukemia cells. Biochem Biophys Res Commun. 2004 m.; 325:1215–1222

46. Li X, Huang Q, Ong CN, Yang XF, Shen HM. Chrysin sensitizes tumor necrosis factor-alpha-induced apoptosis in human tumor cells via suppression of nuclear factor-kappaB. Cancer Lett. 2010 m.; 293:109–116.

47. Chen JH, Shao Y, Huang MT, Chin CK, Ho CT. Inhibitory effect of caffeic acid phenethyl ester on human leukemia HL-60 cells. Cancer Lett. 1996 m.; 108:211–214.

48. Nagaoka T, Banskota A.H, Tezuka Y, Harimaya Y, Koizumi K, Saiki I, Kadota S. Inhibitory effects of caffeic acid phenethyl ester analogues on experimental lung metastasis of murine colon 26-L5 carcinoma cells. Biol. Pharm. Bull. 2003 m.; 26, 638–641.

49. Żukowska RM, Borawska MH, Fiedorowicz A, Naliwajko SK, Sawicka D, Car H. Propolis changes the anticancer activity of temozolomide in U87MG human glioblastoma cell line. BMC Complementary and Alternative Medicine 2013 m.; 13:50

50. Barlak Y, Deger O, Çolak M ,Karatayl SK , Bozday AM, Yücesan F. Effect of Turkish propolis extracts on proteome of prostate cancer cell line. Proteome Science 2011m.; 9:74.

51. Czyżewska U, Siemionow K, Zaręba I, Miltyk W. Proapoptotic activity of propolis and their components on human tongue squamous cell carcinoma cell line (cal-27). Plos one. 2011m.; 11(6): e0157091.

52. Mendonça IC , Moraes ICC, Nascimento T ,Souza NS , Oliveira JM , Arruda RE ,Mousinho KC Santos AF , Basílio ID , Parolia, Barreto FS. Brazilian red propolis: phytochemical screening, antioxidant activity and effect against cancer cells. Complementary and Alternative Medicine. 2015 m.; 15:357

53. Milind K. Choudhari, Reihaneh Haghniaz, Jyutika M. Rajwade, and Kishore M. Paknikar. Anticancer Activity of Indian Stingless Bee Propolis: Complementary and Alternative Medicine Volume. 2013 m.

55. Teerasripreecha D, Phuwapraisirisan P, Puthong S, Kimura K, Okuyama M, Mori H, Kimura A, Chanchao C. In vitro antiproliferative/cytotoxic activity on cancer cell lines of a cardanol and a cardol enriched from Thai Apis mellifera propolis. BMC Complement Altern Med. 2012 m. kovo 30d.;12:27.

56. Li H, Kapur A, Yang JX, Srivastava S, McLeod DG, Paredes-Guzman JF, Daugsch A, Park YK, Rhim JS. Antiproliferation of human prostate cancer cells by ethanolic extracts of Brazilian propolis and its botanical origin. Int J Oncol. 2007 m. rugsėjo 31d.; (3):601-6

57. Kustiawan PM, Puthong S, Arung ET, Chanchao C. In vitro cytotoxicity of Indonesian stingless bee products against human cancer cell lines. Asian Pac J Trop Biomed. 2014 m. liepos 4d. 4(7):549-56.

58. Cunha MG, Franchin M , Galvão LC , Ruiz TG , Carvalho JE , Ikegaki M , Alencar SM, Rosalen HK. Antimicrobial and antiproliferative activities of stingless bee Melipona scutellaris geopropolis. BMC Complementary and Alternative Medicine 2013 m.