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SCOPO DELLA TESI
Le Cellule Staminali Mesenchimali (MSCs) sono cellule adulte multipotenti capaci di differenziare in differenti tipi cellulari del tessuto mesenchimale, tra cui adipociti, osteociti e condrociti. Le MSCs, negli ultimi tempi, hanno suscitato grande interesse nell’ambito della medicina rigenerativa per le loro proprietà biologiche e la facile accessibilità. Tuttavia, per un loro utilizzo ottimale è necessaria un’approfondita conoscenza dei meccanismi che regolano processi quali l’espansione e la differenziazione che sono ancora poco conosciuti, soprattutto durante le fasi precoci del
commitment verso uno specifico lineage. Nel midollo osseo, i meccanismi che regolano
la differenziazione delle MSCs verso il lineage adipogenico sopprimono quello osteogenico e viceversa, indicando che i due processi differenziativi sono mutualmente esclusivi. Il signalling che regola la differenziazione delle cellule progenitrici a cellule totalmente differenziate è stato a lungo oggetto di studio, tuttavia si conoscono ancora poco i meccanismi molecolari che dirigono il commitment delle cellule staminali. Prep1, membro della famiglia TALE (Three Aminoacidic Loop Extension), è un fattore trascrizionale ad omeodominio che svolge molteplici funzioni. È fondamentale per il corretto sviluppo ematopoietico, dal momento che contribuisce alla regolazione del
self-renewal delle Cellule Staminali Ematopoietiche (HSCs). Le MSCs e le cellule che
derivano da esse, sono elementi essenziali della nicchia ematopoietica poiché regolano la sopravvivenza, la crescita e la differenziazione delle HSCs. All’interno della nicchia esiste un intenso cross-talk tra le MSCs e le HSCs. Studi precedentemente condotti nel laboratorio dove ho svolto il mio tirocinio di tesi sono stati mirati ad indagare se Prep1 svolgesse un ruolo anche nella regolazione delle MSCs. Nostri risultati preliminari hanno dimostrato che Prep1 è espresso nelle MSCs murine (mMSCs) e che la sua espressione cambia nel corso della loro differenziazione verso il lineage adipocitico e quello osteogenico. In particolare i livelli di espressione diminuiscono già a partire dal terzo giorno dopo l’induzione adipogenica, viceversa aumentano durante il processo osteogenico. Lo scopo del mio lavoro di tesi è lo studio di funzione di Prep1 nelle MSCs murine. La prima fase del lavoro è stata diretta allo studio degli effetti dell’inattivazione del gene, tuttavia, poiché la sua totale perdita di funzione è letale, ho utilizzato una linea di topi ipomorfi (Prep1i/i) che esprimono livelli ridotti di proteina, compresi dal 2 al 20% rispetto alla controparte wild-type. A tal fine ho allestito colture di mMSCs wt ed
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ipomorfe e le ho confrontate a livello cellulare e molecolare, sia allo stato indifferenziato che durante la differenziazione adipogenica. Questi esperimenti hanno riguardato colorazioni citochimiche, cosi’ come analisi a livello trascrizionale e post-trascrizionale. I topi ipomorfi sono rari, pertanto ho effettuato anche esperimenti di downregolazione in
vitro utilizzando uno short hairpin contro Prep1. Infine, durante la fase terminale del mio
lavoro, ho clonato la sequenza murina di Prep1 all’interno di un costrutto lentivirale e ho infettato le MSCs al fine di indagare gli effetti del guadagno di funzione di Prep1 in
