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3. DISEGNO DELLO STUDIO
3.1 OBIETTIVO
Forti evidenze derivanti da metanalisi di dati clinici dimostrano che i livelli periferici di BDNF sono significativamente ridotti durante le fasi maniacale e depressiva del Disturbo Bipolare, mentre ciò non si registra nelle fasi di eutimia (Lin, 2009; Fernandes e coll., 2011). I livelli di BDNF aumentano dopo l’instaurazione di trattamenti che conducono alla remissione clinica delle fasi acute di mania e depressione. Presi insieme questi dati proporrebbero i livelli periferici di BDNF come potenziale biomarker degli episodi di entrambe le polarità dei disturbi dell’umore e come potenziale predittore di efficacia del trattamento antidepressivo.
Ciononostante in Letteratura non sono a tutt’oggi disponibili dati riguardo i livelli di BDNF durante gli stati misti in pazienti bipolari.
L’obiettivo di questo studio è quello di valutare, in un campione di pazienti con episodio misto, i livelli plasmatici di BDNF e di confrontarli con quelli di pazienti in fase depressiva e di controlli sani.
3.2 MATERIALI E METODI
3.2.1Pazienti
Presso la Clinica Psichiatrica del Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale dell’Università di Pisa sono stati selezionati 18 pazienti (9 uomini e 9 donne, con
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età media di 44.9 ± 17 anni) che soddisfano i criteri del DSM-IV-TR (APA, 2000) per Episodio Depressivo Maggiore (EDM), con o senza sintomi psicotici (16 con disturbo bipolare e 2 con disturbo depressivo maggiore) e 19 pazienti (10 uomini e 9 donne, con età media di 38.2 ± 9.96 anni) affetti da Episodio Misto (EM) con o senza sintomi psicotici in accordo ai criteri del DSM-IV-TR. I criteri di esclusione per la scelta del campione sono stati: età minore di 18 anni, pazienti affetti da importanti disturbi neurologici o internistici, diagnosi di abuso di sostanze negli ultimi 6 mesi, stato di gravidanza, pazienti non in grado di sottoscrivere un consenso informato. Sia i pazienti affetti da EDM che i pazienti con EM sono stati mantenuti con lo stesso trattamento farmacologico per almeno 4 settimane prima del prelievo di sangue venoso, per evitare un possibile effetto del trattamento farmacologico sulle variazioni dei livelli centrali e periferici di BDNF.
Sono stati reclutati come gruppo di controllo 15 soggetti sani (3 uomini e 12 donne, con età media di 36.9 ± 9.2 anni) secondo i seguenti criteri di esclusione: età minore ai 18 anni, anamnesi positiva per disturbi mentali o per importanti disturbi internistici pregressi, cronici o ricorrenti, consumo elevato di sigarette, trattamenti farmacologici regolari e abuso di sostanze.
A tutti i soggetti coinvolti sono stati approfonditamente spiegati la procedura e lo scopo dello studio, ed è stato richiesto ed ottenuto un consenso informato scritto. Lo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell’Università di Pisa in conformità alla Dichiarazione di Helsinki (1996).
3.2.2 Valutazione clinica del campione
La diagnosi clinica di disturbo dell’umore è stata confermata tramite la somministrazione della Mini International Neuropsychiatric Interview (M.I.N.I.) (Sheehan e coll., 1998). La MINI è una breve intervista strutturata ideata per identificare, in modo semplice e rapido, i principali disturbi psichiatrici dell’Asse I secondo i criteri del DSM-IV e dell’ICD-10. Confrontata ad interviste
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diagnostiche molto più ampie e complesse (SCID-P, CIDI) la MINI ha ottenuto elevati punteggi di validità e affidabilità (Sheehan e Lecrubier e coll., 1998) pur richiedendo per la sua applicazione meno di un terzo del tempo rispetto alle altre interviste. L’intervista è divisa in moduli, ciascuno dei quali corrisponde ad una categoria diagnostica (16 in tutto di cui 3 opzionali oltre alla valutazione del rischio di suicidio). Alla fine della somministrazione delle domande di un determinato modulo, il clinico è in grado di determinare se i criteri per quella categoria sono stati o meno soddisfatti.
La gravità dei sintomi depressivi è stata valutata secondo la Hamilton Rating Scale for Depression a 21 item (HRSD-21) (Hamilton, 1960). Essa esamina la presenza e gravità di sintomi depressivi dagli ultimi giorni fino ad una settimana prima dell’intervista. La scala consente la stima delle modificazioni della sintomatologia durante il trattamento. L’HRSD-21, nella versione più diffusa e utilizzata nel presente studio, è composta da 21 items, di cui i primi 17 sono considerati quelli nucleari della depressione. Il cut-off di gravità può essere così schematizzato: - ≥25 depressione grave
- 18-24 depressione moderata - 8-17 depressione lieve - ≤7 assenza di depressione
La gravità dei sintomi maniacali è stata determinata attraverso la Young Mania Rating Scale (YMRS) (Young e coll., 1978). È una scala di 11 items che esplorano i sintomi chiave della mania, quelli che sono generalmente presenti per tutto il decorso della mania, dalle fasi più modeste a quelle più gravi. Gli items esplorano l’umore, l’attività motoria, i disturbi quantitativi e formali del pensiero, la capacità critica, l’aggressività, la libido, il sonno e l’atteggiamento generale. Essi sono valutati in parte (item 1, 2, 3, 4, 7, 8, 10 e 11) in base ad una scala a 5 punti (da 0-1-2-3-4) ed in parte (item 5, 6, 8 e 9) in base ad una scala con punteggio doppio (0-2-4-6-8) perché i sintomi interessati sono di più difficile valutazione per la scarsa cooperazione dei pazienti in grave stato maniacale. La valutazione della
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gravità è fatta sulla base di ciò che il paziente riferisce circa le proprie condizioni nelle ultime 48 ore e dell’osservazione del comportamento fatta dal clinico durante l’intervista (con una relativa priorità per quest’ultima). La scala deve essere usata solo come uno strumento di valutazione quantitativa della mania e non come uno strumento diagnostico, ed è stata specificamente creata per la valutazione della sintomatologia maniacale e delle sue modificazioni sotto trattamento. Il periodo valutato è quello dei due giorni immediatamente precedenti l’intervista e soprattutto l’osservazione clinica effettuata durante la valutazione.
È stata inoltre somministrata la Clinical Global Impressions – Severity of Illness scale (CGI-S) (Guy, 1976). La CGI è stata sviluppata per uno studio di vaste dimensioni sulla schizofrenia (PRB Collaborative Schizophrenia Studies). Ha lo scopo di valutare il rapporto rischio/beneficio (cioè l’efficacia) del trattamento in pazienti psichiatrici. È applicata dallo psichiatra il quale valuta ripetutamente, nel corso del trattamento, la gravità della malattia, le sue variazioni nel tempo e l’efficacia terapeutica, cioè il rapporto fra effetto terapeutico ed effetti indesiderati. La CGI è una scala “universale” che può essere impiegata per tutte le categorie di pazienti. Il primo item valuta la Gravità con un punteggio che va da 0 a 7 (0 = non è stato valutato, 1 = normale, 2 = solo marginalmente ammalato, 3 = lievemente ammalato, 4 = moderatamente ammalato, 5 = patologia psichica grave, 6 = patologia psichica molto grave, 7 = patologia psichica gravissima). Nel secondo item, che valuta il Miglioramento, viene espresso un punteggio compreso da 0 a 7 (0 = non è stato valutato, 1 = molto migliorato, 2 = moderatamente migliorato, 3 = lievemente migliorato, 4 = nessun cambiamento, 5 = lievemente peggiorato, 6 = moderatamente peggiorato, 7 = molto peggiorato). Il periodo valutato è, per la Gravità della Malattia, la settimana precedente, per il Miglioramento Globale il tempo trascorso dall’inizio del trattamento.
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Le interviste sono state condotte da un’equipe di valutatori che ha eseguito un training di preparazione per la conoscenza degli strumenti da impiegare, al fine di ottenere la massima attendibilità ed omogeneità delle valutazioni.
3.2.3 Valutazione dei livelli plasmatici di BDNF
Tutti i prelievi venosi sono stati eseguiti al mattino (tra le ore 8:00 e le ore 9:00, a digiuno) poiché da uno studio precedente è emersa la presenza, per il sesso maschile, di una possibile fluttuazione circadiana nel plasma (ma non nel siero) dei livelli di neurotrofina, con una riduzione significativa della quota plasmatica del BDNF alle ore 20:00; nel sesso femminile, al contrario, non sono state osservate variazioni circadiane (Piccinni e coll., 2006). Sono stati raccolti 10 ml di sangue venoso in provette contenenti EDTA, e i campioni sono stati trasportati in ghiaccio, centrifugati per 10 minuti a 2000xg a 4 °C e conservati a -20 °C (Lommatzsch e coll., 2005; Begliuomini e coll., 2007).
Successivamente i campioni sono stati sottoposti ad acidificazione e conseguente neutralizzazione, prima di procedere con l’enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), secondo le linee guida del produttore del kit (Promega, Wallisellen, Switzerland). Alcune piastre a 96 pozzetti sono state ricoperte con un film di anticorpi monoclonali anti-BDNF ed incubate a 4°C per 18 ore. Le piastre sono state poi poste in un blocking buffer per un’ora a temperatura ambiente e successivamente su ognuna di esse è stato aggiunto il campione. In seguito il preparato è stato tenuto a temperatura ambiente ed agitato per 2 ore, poi lavato con un apposita soluzione. Le piastre sono state successivamente incubate per 2 ore con un anticorpo policlonale anti-BDNF umano a temperatura ambiente, lavati, ed incubate con un anticorpo anti-IgG coniugato con una perossidasi di rafano per un’ora a temperatura ambiente. Le piastre sono state incubate in una soluzione di tetrametilbenzidina contenente un substrato per la perossidasi per ottenere un viraggio di colore. La reazione è stata interrotta con 1 mole di HCl.
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L’assorbimento a 450 nm è stato misurato con un microplate reader (Model 550, Bio Rad Laboratories) per determinare i livelli di BDNF, espressi in ng/ml.
3.2.4 Analisi Statistiche
I dati raccolti sono stati registrati in un database digitale costruito appositamente, quindi sono stati elaborati mediante lo Statistical Package for the Social Science (SPSS) versione n.17. Poiché i livelli di BDNF e i punteggi delle scale di valutazione avevano una distribuzione normale, sono stati eseguiti test statistici parametrici. In particolare, il confronto dei livelli plasmatici di BDNF tra i tre gruppi (controlli, pazienti con EDM, pazienti con EM) è stata usata l’analisi della varianza con il test unidirezionale ANOVA, seguito dal test post-hoc di Bonferroni. L’ANOVA è stata inoltre usata per testare l’omogeneità della variabile indipendente “età” tra i gruppi. I punteggi delle scale di valutazione, il numero degli episodi e l’età d’esordio tra i gruppi di pazienti sono stati confrontati per mezzo del test T di Student per campioni indipendenti. La distribuzione delle variabili categoriali (genere, comorbidità) è stata analizzata con tabelle crociate 2x2 e con il test chi-quadrato. Una probabilità (p-value) inferiore a 0.05 è stata considerata come statisticamente significativa.
