MODULATORI DEI CANALI BK

(1)

(2)

BK

BK----Blockers di origine naturale e sintetica

Blockers di origine naturale e sintetica

I più potenti e selettivi inibitori dei canali al potassio che oggi si conoscano sono le tossine peptidiche isolate dal veleno degli scorpioni. Esse vengono genericamente denominate “short neurotoxins” o “simply peptides”, in quanto sono piccoli polipeptidi di 30-40 amminoacidi, legati da tre o quattro ponti disolfuro che si distinguono dalle “long

neurotoxins” che sono state scoperte nel veleno degli scorpioni fin dagli anni ’60 del secolo scorso, sono costituite da 60-70 residui amminoacidici e conosciute come potenti inibitori dei canali del sodio.

La più semplice e soddisfacente classificazione delle tossine scorpioniche ad alta selettività sui canali del potassio, le raggruppa in tre famiglie sulla base della analogia nella struttura primaria [1].[1].[1].[1].

La caribdotossina (ChTX) ed l’iberiotoxin (IbTX) (fig.1.) sono i più potenti e selettivi BK-blockers.

Fig. 1

La caribdotossina, tossina peptidica costituita da 37 amminoacidi e isolata dal veleno dello scorpione

Leiurus quinquestriatus

(var. hebraeus) [2],[2],[2],[2], è

(3)

stato il primo potente e selettivo bloccante dei canali BK in grado di occludere il poro esterno del canale.

La caribdotossina possiede proprietà bloccanti anche verso i canali calcio-dipendenti a piccola conduttanza (small-conductance calcium-activated K+

channels o SK channels) ed altri sottotipi di canali al potassio voltaggio-dipendenti, cosa che rappresenta un grave limite per il suo impiego sperimentale [3].[3].[3].[3].

L’ iberiotossina, anch’essa tossina peptidica costituita da 37-amminoacidi, ha un meccanismo d’azione analogo alla caribdotossina, è stata isolata dal veleno dello scorpione

Buthus tamulus

e identificata come il primo

potente inibitore ad alta selettività per i canali BKCa [4].[4].[4]. [4].

Tali bloccanti, sono considerati dei validi mezzi per studiare la struttura del poro ionico, il meccanismo di permeazione e il ruolo fisiologico dei canali BK, oltre che strumenti indispensabili per saggiare la potenziale selettività e l’ utilità farmacologica degli agenti modulatori.

Le sostanze di origine naturale,non peptidiche, riportate in letteratura per le loro proprietà BK bloccanti, appartengono a poche classi strutturali chimiche.

La prima classe potente e selettiva ancora oggi è rappresentata da una serie di diterpeni indolici di origine naturale, facenti parte di una famiglia di micotossine tremogeniche appartenenti al genere

Penicillium

,

Aspergillus

e

Claviceps

.

Tale serie include la paxillina, il verruculogen, la non tremogenica paspalicina, il paspalitrem C, il penitrem A (noto anche come tremortin A), l’aflatrem e la paspalinina, identificati grazie alla loro abilità di

modulare il binding della caribdotossina radiomarcata al canale BK su membrane sarcolemmatiche della muscolatura liscia aortica bovina [5].[5].[5].[5].

(4)

Tra queste, la più studiata ed utilizzata a fini sperimentali, è la paxillina, potente e selettivo BK-blocker il cui recettore è sito sulla subunità α ed è differente dal sito recettoriale della caribdotossina ma allostericamente accoppiato ad esso ed è accessibile dal lato citoplasmatico, come studiato in excised inside-out patches [6][6][6][6] e isometric tension recordings [7].[7].[7]. [7].

Anche la tetrandrina, un alcaloide bis-benzil-isochinolinico, isolato dalle radici di un’erba medicinale cinese (

Stephania tetrandrae

) e utilizzata per il trattamento di ipertensione ed angina [8],[8],[8],[8], possiede un profilo

farmacodinamico BK bloccante [9, 10][9, 10][9, 10][9, 10], anche se in merito esistono risultati contrastanti [11].[11].[11]. [11].

Tra i BK-blockers sintetici si possono includere il tetreaetilammonio (TEA) [12[12[12----15][1215]15]15] e la 4-amminopiridina [16].[16].[16].[16].

Questi ultimi hanno una scarsa utilità come tools farmaceutici per i canali BK, in quanto possono bloccare molti altri sottotipi di canali al potassio [17

[17 [17

[17----19]19]19] tuttavia, grazie alla facile reperibilità commerciale e al prezzo 19] contenuto, sono ampiamente usati nelle valutazioni farmacologiche preliminari di potenziali BK-openers.

L’attività BK-bloccante è una proprietà farmacologica anche di alcuni farmaci commerciali, tra cui la trifluoroperazina dicloridrato (aaaa) [20],[20],[20],[20], il troglitazone (bbbb) e un derivato indolico brevettato (cccc) (fig. 2) [21].[21].[21]. [21].

(5)

S N F₃C N N CH3 2 HCl CH₃ C H₃ O H CH₃ O CH3 O _NH S O O N CH₃ a a a a b b b b c c c c Fig. 2

BK

BK----Openers

Openers

Numerose reviews hanno esplorato e discusso l’ampio range di classi strutturali a cui appartengono il grande numero di attivatori, di origine naturale e sintetica, dei canali BK [22, 23][22, 23][22, 23][22, 23].

BK

BK–

–

–openers di origine naturale

–

openers di origine naturale

I BK-openers di origine naturale appartengono a poche ed eterogenee classi strutturali. I più noti sono alcuni composti isolati dal

Desmodium

adscendens

(Papilionaceae), un’erba medicinale molto popolare in Ghana

ed utilizzata come rimedio terapeutico per l’ asma ed altri stati patologici associati a disfunzioni delle risposte contrattili della muscolatura liscia. La potente modulazione dell’ipereccitabilità muscolare indotta dagli estratti di tale erba e lo studio del coinvolgimento dei canali BK sono ben documentati.

(6)

Tali effetti sono promossi da tre triterpeni glicosilati, chiamati

deidrosoyasaponina-I (DHS-I) (1111)(fig. 3), soyasaponina I e III ma la DHS-I ha dimostrato essere la più efficace.

Tuttavia, le sue proprietà BK attivanti, studiate per la prima volta sulla muscolatura liscia tracheale bovina [24][24][24][24], sono evidenti solo quando viene somministrata a livello del lato citoplasmatico del canale e quindi data la sua scarsa permeabilità membranale, è estremamente difficile studiarne l’ attività farmacologica sulla muscolatura liscia in vitro.

In vivo, invece, la DHS-I è probabilmente metabolizzata ad altri agenti attivi che penetrano più facilmente all’interno delle cellule, inoltre è chiaro che siccome la DHS-I incrementa la probabilità di apertura del canale solo quando le subunità α e β sono coespresse, il suo sito di azione è associato oppure allostericamente accoppiato alla subunità β [25, 26].[25, 26].[25, 26].[25, 26]. Al contrario, il maxikdiol (2222)(fig.3), un 1,5-diidrossi-isopimarano diterpenoide, ottenuto dalla fermentazione di un non identificato

coelomycete, oltre alla limitata permeabilità membranale e alla abilità di attivare i canali BK sulla muscolatura liscia aortica bovina solo quando applicato al lato citoplasmatico del canale, ha dimostrato di attivare la subunità α senza la coespressione della subunità β [27].[27].[27].[27].

(7)

Fig. 3

Recentemente, le proprietà BK attivanti dell’acido pimarico (PiMA)(3333) (fig.3), un diterpene strutturalmente correlato al maxikdiol ed ampiamente espresso nella resina del genere

Pinus

, così come di altri correlati derivati pimaranici (quali acido isopimarico, acido sandaracoisopimarico , acido diidropimarico, acido diidroisopimarico e diidroisopimarinolo), sono state studiate ed evidenziate su canali BK umani [28][28][28][28].

Il PiMA, in modo analogo al maxikdiol, pare agire solo sulla subunità α, ma a differenza di questo agisce da entrambi i lati della membrana cellulare.

Altri analoghi terpenici, quali acido abietico, sclareolo, e metil pimarato, nonostante le modeste differenze strutturali, non mostrano altrettante proprietà farmacodinamiche BK attivanti e ciò ha suggerito ad alcuni autori uno studio sulle possibili relazioni struttura-attività [28][28][28]. [28]

Tra i composti di natura polifenolica il più significativo è probabilmente il trans-resveratrolo (6666) (fig.4) oggi ben noto grazie alle numerose azioni farmacologiche che è in grado di promuovere.

O OH O O O O O O COOH OH OH OH OH CH3 OH HOHO OH OH OH 2 COOH 3 4 HO HO H 5 O O HO HO H 1

(8)

Fig. 4

In particolare, assieme ai suoi derivati glucosidici, è ritenuto uno dei principi attivi di numerosi rimedi erboristici, tra cui il

Polygonum

cuspidatum

, le cui radici, seccate ed infuse, sono usate nella medicina

popolare cinese e giapponese nel trattamento di patologie cardiache e vascolari [29][29][29]. [29]

Recentemente, è stato dimostrato che il trans-resveratrolo può stimolare le cellule vascolari endoteliali, come osservato mediante patch-clamp technique [30][30][30]. [30]

La patch-clamp technique è stata applicata dagli stessi autori su cellule muscolari lisce della trachea umana anche per evidenziare le proprietà BK attivanti del magnololo (7)7)7) (fig.4) [31]7) [31][31][31], un metabolita secondario isolato dalla corteccia della

Magnolia

officinalis

.

E’ considerato uno dei maggiori responsabili degli effetti terapeutici del Saiboku-to, una miscela di dieci differenti estratti di piante medicinali, tra cui la

Magnolia

officinalis

, la

Glycyrrhiza

glabra

, la

Scutellaria

baicalensis

ecc., utilizzata nei paesi asiatici come rimedio terapeutico dell’asma. Tuttavia, non è stato ancora dimostrato che l’azione BK modulatoria del magnololo sia il principale meccanismo antiasmatico del Saiboku-to e del magnololo stesso. In questo chemiotipo, può essere incluso anche l’acido nordiidroguaiaretico (NDGA) (8888) (fig. 4), presente in buone quantità nelle

OH HO OH 6 OH HO 7 HO HO OH HO H H 8

(9)

foglie e nei piccoli rami della

Larrea

Tridentata

Cav.

, una pianta

appartenente alla famiglia delle

Zygophyllaceae

, comunemente nota come chaparral o croesote bush o greasewood il cui infuso fu descritto nella Farmacopea Americana come rimedio per la tubercolosi, l’artrite e il cancro [32].[32].[32].[32].

Tale catecolo, che è un ben noto inibitore della lipoossigenasi (un target biologico chiave per numerose patologie, tra cui asma, aterosclerosi e cancro), accanto al suo ampio range di attività farmacologiche, tra cui l’attività antiossidante, possiede un profilo farmacodinamico di BK attivatore, come rivelato da autori giapponesi, mediante tecnica patch clamp [33][33][33] su cellule muscolari lisce dell’arteria coronaria porcina. [33] Alcuni degli stessi ricercatori, più recentemente, hanno pubblicato due studi inerenti il meccanismo e il sito d’ azione sul canale BK dell’NDGA : dal primo studio emerge che le proprietà BK attivanti sono indipendenti dall’inibizione dell’attività lipoossigenasica e dall’attività antiossidante [34],

[34], [34],

[34], mentre nel secondo viene dimostrato il coinvolgimento diretto della subunità α [35][35][35][35].

Un’altra importante classe strutturale di BK-openers naturali è

rappresentata dai flavonoidi, come dimostrato dalla possibile equivalenza farmacoforica e sovrapposizione strutturale del nucleo fenil-benzopiranico con il prototipo NS004 [36][36][36]. [36]

In questo studio, tale correlazione è confermata, mediante test

elettrofisiologici su canali BK clonati, dalle effettive proprietà BK attivanti della apigenina(9999) e del kaempferolo (10101010) (fig. 5).

Anche la naringenina (11111111) [37][37][37][37], l’hesperetina (12)12)12), la luteolina (13)12) 13)13)13), e il 5-idrossiflavone (141414),riportati in figura 5, hanno mostrato effetti 14

(10)

Fig. 5

Altri flavonoidi, quali il 5-metossiflavone, il 7-idrossiflavone, e il 4’-idrossiflavanone, inducono effetti vasosorilascianti non iberiotossina-sensibili (e quindi indipendenti dai canali BK), indicando che la presenza del gruppo ossidrilico in posizione 5 sul nucleo benzopiranico è un requisito strutturale importante per l’attivazione dei canali BK.

In tale classe chimica può essere inclusa anche la floretina (15151515)(fig. 5), le cui proprietà BK-attivanti sono state studiate sulle fibre nervose dello

Xenopus

laevis

[38].[38].[38].[38].

Infine, vale la pena menzionare anche un derivato semisintetico, la vinpocetina, nota anche come etil apovincaminato, le cui ben note proprietà farmacologiche di neuroprotettivo, anticonvulsivante e vasodilatatore cerebrale, sono state ampiamente applicate in ambito

clinico in sindromi cerebro-vascolari anche se non sono state approvate da nessun organismo regolatorio [39].[39].[39]. [39].

O OH O OH HO 9 O OH O OH HO 10 OH O OH O OH HO 11 O OMe O OH HO OH 12 O OH O OH HO OH 13 O O OH 14 OH HO OH O OH 15

(11)

Tale alcaloide, sintetizzato dalla vincamina [40][40][40] (a sua volta isolata da [40] foglie di

Vinca

Minor

) ha mostrato la capacità di attivare i canali BK di alcune linee cellulari di ratto [41][41][41][41]; tuttavia, resta da chiarire se l’azione BK attivante sia responsabile anche degli effetti terapeutici.

Recenti studi hanno dimostrato l’efficacia di altre sostanze di origine naturale che stimolano l’attività dei canali BK.

Un esempio è la squamocina (fig. 6), una acetogenina estratta da piante appartenenti alla famiglia delle

Annonaceae

, provoca un cambiamento dei livelli intracellulari di Ca₊2

su cellule della muscolatura liscia coronarica e possiede un potente effetto citotossico sulle cellule tumorali di cui induce l’apoptosi.

Fig. 6

Entrambi gli effetti si manifestano a valori di EC50 pari a 4 µM; tale dato sembra rivestire un ruolo importante nel determinare quando i

cambiamenti citotossici o apoptotici indotti dalle acetogenine sono associati all’ effetto sull’ attività dei BKCa.

Un’altra sostanza è il CAPE (estere dell’ acido fenetil-caffeico) (fig. 7), un antiossidante di origine naturale che si ritrova nella propoli.

OH OH O OH OH O OH HO CN O O

(12)

Questo acido presenta una doppia azione inibitoria sia sul fattore NFKB di trascrizione nucleare, sia sulla crescita cellulare di diversi tipi di cellule tumorali e la sua funzione specifica sui canali BKCa è quella di prolungare il tempo di apertura del canale.

Infine, citiamo il cilostazolo (fig. 8), una droga trombolitica e

vasodilatatrice implicata nell’ inibizione della fosfodiesterasi nucleotidica ciclica di tipo 3A.

N H O O(CH₂)₄ N N N N Fig. 8

Tale sostanza è in grado di variare la conduttanza del singolo canale BKCa sia nel neuroblastoma umano, dove stimola la corrente del calcio, sia nelle cellule pituitarie GH3 e nel feocromocitoma, dove ha la capacità di

stimolare direttamente i BKCa.

L’azione del cilostazolo sembra correlata alla possibilità di apertura dei canali e al conseguente innesco di un potenziale di azione spontaneo che determina un’ iperpolarizzazione della membrana diminuendone

(13)

BK

BK–

–

–openers di

openers di

openers di origine sintetica

openers di

origine sintetica

L’interesse per piccole molecole capaci di attivare i canali BK Ca2+

-dipendendenti è enormemente cresciuto a partire dalla sintesi di derivati benzimidazolonici come NS004 e NS1619 [42, 43][42, 43][42, 43][42, 43]. F₃C _NH N O OH Cl NS004 F₃C _NH N O OH F₃C NS1619

Queste strutture sono caratterizzate da un nucleo benzimidazolonico, generalmente sostituito con un gruppo elettronattrattore, e da un anello cloro – fenolico.

La loro azione è stata studiata in dettaglio sia in vitro che in vivo [44[44[44[44----47]47]47]47] mentre la relazione struttura-attività non è stata descritta ma nonostante questo, ancora oggi rappresentano molecole di riferimento per la sintesi di potenziali BK attivatori.

Usando come template il nucleo benzimidazolonico, negli anni successivi sono state sintetizzate una serie di molecole con variazioni strutturali per migliorarne l’attività.

Una prima modifica fu l’introduzione di un ponte metilenico tra il nucleo biciclico e quello cloro - fenolico [48][48][48][48] (fig. 9).

(14)

N H N R O O H R Fig. 9

La maggior parte di tali composti presentò un’attività farmacologica

comparabile a quella di NS1619 mostrando che una certa flessibilità nella molecola è ben tollerata dalla regione del recettore implicata nel

meccanismo di legame.

In tale lavoro, inoltre, veniva descritta per la prima volta una relazione struttura-attività che ha stabilito l’importanza della natura elettronattrattrice del sostituente sul nucleo eterociclico.

Un altro elemento importante ai fini dell’attività si dimostrò essere l’OH fenolico, potenziale donatore di legame ad idrogeno.

Una ottimizzazione derivò da una modifica ulteriore che prevedeva la sintesi di un bioisostero dell’NS004 cioè dell’ossindolo [49, 50][49, 50][49, 50] (d[49, 50] dd, ed eee, fig. 10), caratterizzato dall’introduzione di un centro stereogenico nella posizione 3 del nucleo indolico.

N H O OR R₂ R₁ F N H O F₃C OCH₃ F Cl d e d e d e d e Fig. 10

(15)

In questi lavori emerge la prima evidenza di una possibile discriminazione chirale all’interno del recettore BK, dimostrando che l’attività di apertura del canale è sensibile alla natura del sostituente sull’anello aromatico ma anche alla configurazione assoluta del centro chirale.

In particolare veniva nuovamente confermata l’importanza di un

sostituente elettronattrattore sul nucleo ossindolico e la presenza dell’OH fenolico.

Sulla base di tali risultati furono sintetizzati una serie di 3 - fluorossindoli [51]

[51] [51]

[51] (fig. 11), aventi una migliore stabilità metabolica ed una maggiore lipofilicità che rendeva loro possibile un più facile attraversamento della BEE rendendoli dei potenziali farmaci d’elezione nel trattamento dell’ ischemia cerebrale acuta.

N H O OR R₂ R₁ F N H O F₃C OCH₃ F Cl BMS-204352 Fig. 11

In tali composti, in analogia ai 3-arilossindoli, erano fondamentali per l’attività sia la posizione che la natura dei sostituenti sugli anelli aromatici. Sebbene la maggior parte di tali composti non fosse particolarmente attiva, uno di essi, BMS-204352 (fig. 11), mostrò una buona attività anche in vivo, divenendo il primo BK-opener utilizzato nella sperimentazione clinica.

(16)

Chimicamente tali composti possiedono sull’anello aromatico il gruppo metossilico che probabilmente in vivo viene trasformato nel gruppo fenolico, sottolineando nuovamente l’importanza dello stesso ai fini dell’attività biologica.

Un’ulteriore modifica portò all’ ampliamento dell’anello eterociclico da cinque a sei termini; i nuclei chinolonici variamente sostituiti [52, 55][52, 55][52, 55] [52, 55] erano caratterizzati da sostituenti diversi in posizione 3.

All’inizio furono sintetizzati una serie di 4-aril-3-idrossi-chinolin-2-oni [52]

[52] [52]

[52] (ffff, fig. 12) che pur dimostrando una buona attività in vitro, in vivo non erano in grado di raggiungere il SNC a causa della presenza di una

porzione ionizzabile [53][53][53].... [53]

Per ovviare a tale inconveniente furono allora sintetizzati una serie di 4-aril-3-ammino-sostituiti-chinolin-2-oni [54][54][54][54] (gggg, fig. 12) nei quali il gruppo NH in posizione 3 rappresentava la sostituzione bioisostera del gruppo ossidrilico [55][55][55][55] mentre la porzione p-clorofenolica in posizione 4 (gruppo caratteristico dei benzimidazoloni) era mantenuta fissa.

3 N H 4 Cl Cl OH O OH Cl 3 N H 4 R₄ NHR O OH Cl R₁ R₃ R₂ f g f g f g f g Fig. 12

(17)

Le relazioni struttura-attività per tale serie di composti mostravano che l’introduzione di un ulteriore gruppo amminico nella catena R

comportava un’ incremento della penetrabilità della barriera, ma anche una capacità di attivare i canali BK di gran lunga superiore ad NS1619. Con l’obiettivo di ottenere composti disponibili per OS capaci di indurre il rilasciamento della muscolatura liscia, furono sintetizzati una serie di 4-aril-3-(idrossialchil)-chinolin-2-one derivati [56][56][56] (fig. 13). [56]

6 3 N H 4 OR Cl F₃C O (CH₂)nOH Fig. 13

Tutti questi composti generalmente mostravano una buona attività; veniva modificato il sostituente in posizione 3 del nucleo chinolinico tenendo fissi il gruppo trifluorometilico in posizione 6 ed il gruppo arilico in posizione 4 come p-clorofenolo o p-cloroanisolo.

Sorprendentemente in questi casi quasi tutti gli eteri metilici esibivano una buona efficacia a differenza di quanto visto nei corrispondenti eteri

metilici chinolonici sintetizzati in precedenza [57, 58][57, 58][57, 58][57, 58] (fig. 14).

N H F₃C SR O O H Cl Fig. 14

(18)

In tutti i composti delle due serie veniva valutata la sostituzione del gruppo mercapto in posizione 3, il sostituente in 4 era mantenuto come 5-cloro – 2 - idrossifenile oppure come 5 – cloro – 2 – metossifenile, mentre in posizione 6 veniva mantenuto il gruppo trifluorometilico.

Tutti questi composti risultavano particolarmente attivi rispetto alle precedenti molecole, dimostrando che l’ apertura dei canali era favorita dall’ introduzione del gruppo mercapto in posizione 3.

La compresenza di un accettore di legami ad idrogeno e di un ulteriore gruppo amminico sulla catena in posizione 3 (fig. 15) venne indicata come la causa dell’incrementata attività in quanto rappresentava la caratteristica comune dei composti più attivi.

N H F₃C O O H Cl S (CH₂)n N R₁ R₂ O Fig. 15

Con l’aumentare del numero di BK-openers aumentarono i tentativi di razionalizzazione dei risultati.

Poiché non è ancora conosciuta la reale struttura tridimensionale del recettore, un ipotetico modello farmacoforico potrebbe essere di enorme utilità nella progettazione di nuovi attivatori.

In un interessante lavoro di Coghlan [58][58][58][58] fu descritto per la prima volta un possibile farmacoforo costituito da due anelli aromatici sostituiti

simmetricamente o asimmetricamente ed uniti tra loro da uno spaziatore denominato linker.

(19)

Uno dei due anelli aromatici spesso era sostituito con una funzione

fenolica in posizione 2 mentre lo spaziatore eterociclico, in alcuni casi, era fuso ad uno degli anelli aromatici come nei benzimidazoloni; molti dei composti più recenti corrispondono al suddetto farmacoforo.

Un chemiotipo più flessibile derivò dalla deannulazione del nucleo benzimidazolonico che portò ad un template monoeterociclico di natura bifenilica, dibenzilica o fenilbenzilica.

Per esempio, vennero preparati una serie di triazoloni e ossazolidindioni disostituiti mantenendo fisso il gruppo arilico come p-clorofenolo già presente nel prototipo NS004.

La maggior parte delle molecole dimostrava una buona efficacia, nuovamente l’attività dipendeva dalla natura del sostituente sull’ anello fenilico e precisamente dalla presenza di un gruppo elettronattrattore. In uno studio di Starrett [59][59][59][59] su piccole molecole BK-openers, una

comune caratteristica osservata era la posizione del gruppo idrossifenilico rispetto alla porzione eteroatomica-linker della molecola.

Una serie di 4,5 – difenil - 1,2,4 – triazol – 3 - oni, sintetizzati da Romine [60]

[60] [60]

[60], (fig. 16) dimostrava che la presenza di un donatore di legame ad idrogeno sull’anello eterociclico e una sua relazione spaziale con l’orto-fenolo erano basilari per l’attività dei BK-openers.

X R OH Cl X = 1,2,4 Triazolone Fig. 16

(20)

In particolare la distanza tra l’ossigeno fenolico e l’ idrogeno dell’NH sull’anello eterociclico-linker doveva essere compresa tra 4,0-5,6 A°; inoltre veniva introdotto uno spaziatore metilenico tra l’eterociclo e gli altri anelli, sulla base dell’osservazione che tale introduzione era ben tollerata [47, 61][47, 61][47, 61][47, 61].

Quando l’ unità spaziatrice metilenica veniva introdotta tra l’eterociclo e l’anello fenolico l’attività decresceva, se invece lo spaziatore era inserito tra il linker e l’altro anello aromatico l’attività era mantenuta, confermando che la distanza tra l’anello eterociclico e il fenolo è importante per l’attività.

Oltre a ciò questi dati suggeriscono che l’anello eterociclico caratterizzato da una deficienza elettronica, impartita dal sistema aromatico, non è importante ai fini dell’attività, ma piuttosto sembra essere parte di una tasca lipofila di legame che può interagire con l’anello aromatico variamente sostituito.

Differenti modificazioni del linker eterociclico suggerivano che modifiche opportune risultavano ben tollerate dal recettore; anche cambiamenti più drastici dell’unità linker, come l’apertura dell’eterociclo [62][62][62] (fig. 17) o una [62] sua scomparsa [63][63][63] spesso producevano composti ugualmente funzionali. [63]

NH NH O H Cl F₃C O NS1608 Fig. 17

(21)

Più recentemente, per alcune di queste molecole è emersa l’ipotesi di un farmacoforo simmetrico e in accordo con questo modello, se l’ idrogeno acido del gruppo - NH ammidico benzimidazolonico, viene considerato bioisostero dell’OH fenolico, anche l’ NS004 può essere considerato una molecola simmetrica in termini di siti donatori di legami ad idrogeno (fig. 18). N H N F₃C OH O H O Cl OH OH F₃C L _OH C H₃ R₃ R₁ OH R₃ R₂ R₁ Fig. 18

Anche per composti che possedevano tali caratteristiche di simmetria, i sostituenti elettronattratori su ciascun anello fenolico erano importanti per le proprietà BK attivanti, mentre la natura del linker poteva

indifferentemente variare (metilene, tioetere, bifenolo) senza decremento dell’attività [64][64][64][64].

Un insieme di molecole che non possono essere facilmente ricondotte ai leads fino ad ora esaminati, è costituito da un gruppo di composti

(22)

N N N NHCH₃ Br CN S N H₃CO NH₂ O N OH Cl N N H N CN R₁ R₂ X R₁ Z COR2 Riluzolo Clorossazone

azaindolo Acido 1-carbossilico

Fig. 19

Tali composti, riluzolo, clorossazone, azaindoli, spesso derivavano da modifiche strutturali di differenti leads come l’NS8 e alcuni ben conosciuti K-ATP-openers tra cui il cromakalim (fig. 20).

N H F NH₂ CN C H₃ N O NC CH₃ CH₃ OH O NS8 Cromakalim Fig. 20

Alcuni tra questi derivati come l’ acido 5,10 – diidro - indenol[1,2-b]indol-1-carbossilico [61][61][61] (fig. 19) ed una serie di 2-ammino-4-azaindoli [65][61] [65][65][65] (fig. 19) sono risultati particolarmente interessanti.

(23)

Malgrado essi fossero chimicamente molto differenti dai composti precedentemente analizzati, queste due serie mostravano di possedere alcune caratteristiche comuni anche agli altri BK-openers.

Studi di SAR sui benzofuroindoli mostrarono che erano di particolare importanza ai fini dell’attività tre principali elementi:

1) l’NH indolico

2) il protone acido carbossilico

3) il sostituente R1 con proprietà di elettronattrattore.

Anche nella serie dei 2-ammino-4-azaindoli si dimostrarono importanti per l’attività l’NH indolico libero e i sostituenti R1 in posizione 2

rappresentati preferenzialmente da cicli alifatici.

Sebbene all’interno di questo gruppo di molecole vi fossero differenze chimiche molto evidenti, ancora una volta veniva rimarcata l’importanza di alcuni fattori fondamentali :

- un potenziale donatore di legami ad idrogeno

- un sostituente idrofobico in grado di occupare un’area lipofila.

In questi ultimi anni tra le numerose molecole con attività BK attivante sono state riportate anche una serie di composti naturali tra cui derivati terpenici (deidrosoyasaponina I, maxikdiol, acido pimarico, CAF), composti polifenolici(trans-resveratrolo, magnololo, acido

nordiidroguaiaretico) e flavonoidi (apigenina, campferolo, norigenina, hesperetina, luteolina, floretina) [66][66][66][66].

Generalmente si tratta di composti con modesta attività ma l’interesse per queste molecole è cresciuto in seguito a degli studi recenti che hanno fornito importanti informazioni riguardo ai meccanismi responsabili dell’ apertura del canale e alla relazione struttura-attività [67, 68][67, 68][67, 68][67, 68].

(24)

Infine, hanno mostrato capacità di attivare i canali BK un buon numero di farmaci già esistenti quali antinfiammatori (fenamati), benzodiazepine e inibitori dell’anidrasi carbonica [69[69[69[69----72]72]72]72] che tuttavia rimangono composti non selettivi per tale target.

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