3. MATERIALI E METODI
3.1
Analisi morfometrica preliminare per valutare
l'affidabilità
della colorazione Diff Quik per il rilievo
dei MCs.
Prima di iniziare lo studio, è stata valutata l’affidabilità della colorazione rapida Diff Quik® (DQ) nel rilevare la presenza di mastociti, dal momento che la
visualizzazione dei granuli citoplasmatici propri dei MCs con la colorazione DQ potrebbe risultare scarsa (Scott e Stckham 2000). E’ noto infatti che le colorazioni metacromatiche, come la colorazione May Grünwald Giemsa (MGG) e la Wright, così come la colorazione Blu di Toluidina, rappresentano la prima scelta per il riconoscimento dei MCs in preparati citologici. L'utilizzo di una colorazione non metacromatica come il DQ potrebbe non essere in grado di evidenziare i granuli dei mastociti, che potrebbero così essere confusi con altri tipi cellulari quali ad esempio i macrofagi. Nei preparati citologici trattati con un colorante a base acquosa come il DQ i MCs sono spesso poco riconoscibili per la scarsa granulosità. Tale fenomeno è legato alla natura dei granuli citoplasmatici contenuti nei MCs che sono solubili in acqua (Raskin 2001). Tuttavia il DQ rappresenta il metodo di colorazione più rapido che si trova in commercio ed il più comunemente utilizzato nella pratica clinica. Il metodo di colorazione MGG viene usato di routine in ematologia e si compone di una prima colorazione con May Grünwald (eosinato di blu di metilene), disponibile già pronto in commercio, e di una seconda colorazione con Giemsa, soluzione che
invece deve essere preparata giornalmente a partire da eosina giallastra, blu di metilene, azzurro A e B e violetto di metilene. La sua preparazione è pertanto più complessa.
Nei vetrini colorati con MGG, i MCs sono riconoscibili rapidamente oltre che sulla base della loro morfologia, soprattutto per la presenza di granuli metacromatici color viola scuro. Negli strisci citologici colorati con DQ, i MCs sono sempre riconoscibili per la loro morfologia (cellule rotonde e/o poligonali con nuclei centrali) e i granuli intracitoplasmatici appaiono color rosso-porpora (Scott e Stckham 2000) (Figura 1).
Per questo studio preliminare sono stati colorati 10 campioni citologici ottenuti da LN di 5 differenti cani e colorati con MGG e DQ. L'analisi morfometrica è stata eseguita con l’analizzatore computerizzato Quantimet 500 (Leica, Microsystem spa, Milano, Italia) ad opera di un investigatore esperto (relatore della tesi: Prof.ssa Francesca Abramo). Iniziando da un’area selezionata di 1x1 cm2 situata nella parte
superiore del preparato, sono stati esaminati sistematicamente campi consecutivi verticali attraverso un obiettivo 40x e sono state contate almeno un totale di 2000 cellule. Sono stati valutati da 5 a 13 campi in base alla densità della popolazione cellulare di ogni singolo preparato. I MCs sono stati identificati in entrambe le colorazione sulla base della loro morfologia cellulare nonché della presenza dei granuli (viola scuro nel MGG e rosso porpora nel DQ). Per ciascun campo valutato è stato stimato oltre al numero di MCs osservati, il numero totale delle cellule. Il numero di MCs è stato espresso sotto forma di percentuale rispetto al totale delle cellule contate.
FIGURA 1
MCs in strisci citologici colorati con Diff Quik A= cane con MCT stadio IV; B= cane con Erlichiosi
L’indagine retrospettiva è stata condotta sulla base del materiale raccolto nel periodo di tempo compreso tra Gennaio 2006 e Gennaio 2007, ottenuto da una popolazione di 62 cani.
I pazienti sono stati suddivisi in 3 distinti gruppi secondo le loro caratteristiche cliniche: animali clinicamente sani (Gruppo 1); animali con evidenza clinica di malattie infiammatorie o infettive non neoplastiche (Gruppo 2); animali con MCT cutaneo solitario indipendentemente dal suo grado istologico (Gruppo 3). Il Gruppo 3 è stato a sua volta suddiviso in 3 sottogruppi secondo i risultati della valutazione citologica dell’aspirato linfonodale:
• Sottogruppo 3.1 composto da cani con assenza di MCs nel LN drenante (Stadio clinico I);
• Sottogruppo 3.2 comprendente cani in cui l’esame citologico dei LR è risultato inconcludente per la diagnosi di metastasi a causa della presenza occasionale di singoli MCs (stadiazione clinica dubbia);
• Sottogruppo 3.3 costituito da cani con evidenti metastasi ai LR (con significativa presenza di MCs; Stadio clinico II e IV).
Sebbene nella classificazione clinica WHO sia previsto uno Stadio clinico III della malattia nel quale sono inclusi i tumori di forma multipla e i tumori grandi infiltrati (con o senza interessamento linfonodale), in questa indagine tali forme sono state escluse nello studio. Come già accennato nella parte introduttiva della tesi, Murphy et al (2006) avevano messo in dubbio la validità del sistema di stadiazione nei confronti dello Stadio III della malattia. Infatti mancano i criteri attraverso i quali definire un tumore ‘grande infiltrato’ e, fattore ancor più determinante, è stato dimostrato che non esiste alcuna differenza statisticamente significativa tra tempo di sopravvivenza di cani che presentano tumori singoli senza interessamento dei LN
(stadio I) e cani che presentano tumori multipli, senza interessamento dei LN (considerato però dal WHO come stadio III).
La diagnosi di MCT è stata formulata sulla base dei rilievi citologici, successivamente confermati dalla valutazione istopatologica.
Per gli animali inclusi nel Gruppo 3 la diagnosi è stata ottenuta osservando le dimensione del tumore, la sua localizzazione e lo stadio clinico della malattia, così come descritto nel sistema di stadiazione clinica WHO del MCT (Owen 1980). Ciascun animale affetto da MCT canino è stato sottoposto ad un'accurata stadiazione della neoplasia. A tale scopo in primo luogo è stata valutata in maniera approfondita l’anamnesi e successivamente i pazienti sono stati sottoposti ad esame fisico completo con particolare attenzione allo stato del LR, stimato attraverso l’esecuzione di un’accurata palpazione, a partire del quale poi è stata effettuata la biopsia con ago sottile sempre valutata contestualmente alla biopsia del tumore cutaneo. Sono stati inoltre eseguiti un esame emocromo citometrico, un esame radiografico del torace, un'ecografia addominale e una valutazione citologica del midollo osseo. Sono stati registrati tutti i risultati ottenuti dalla gestione clinica e chirurgica della malattia, nonché i dati ottenuti dai follow-up. Il tasso di sopravvivenza a 6 mesi dopo la diagnosi iniziale, lo sviluppo della malattia metastatico a distanza, oltre che l’esito dell’ecografia addominale mensile, della radiografia toracica e la valutazione citologica del midollo osseo, sono stati utilizzati come criteri per il comportamento biologico del tumore.
L’aspirazione percutanea del LN effettuata su tutti i cani oggetto dello studio è stata eseguita applicando la tecnica di Fine Needle Biopsy (FNB), utilizzando un ago sottile di calibro 21 o 23 gauge.
Sono stati sottoposti a FNB: nel Gruppo 1, i LNs normali clinicamente esplorabili; nel Gruppo 2, i LNs che alla palpazione risultavano aumentati di volume; nel Gruppo 3, i LR drenanti la regione cutanea interessata dalla neoplasia primaria, anche se non aumentati di volume.
Il materiale ottenuto è stato utilizzato per allestire i preparati citologici. A tal fine il materiale è stato delicatamente strisciato su un vetrino, fissato all’aria e infine colorato con DQ. La qualità di ogni striscio realizzato è stata valutata indipendentemente dalla presenza o l’assenza di MC. I campioni sono stati inclusi nello studio solo se negli strisci era contenuta almeno un’area di 1x1 cm2 costituita
da cellule distribuite uniformemente in un monostrato, senza formazione di “clumping”, al fine di rendere più facile la certa identificazione di ogni singolo MC.
La valutazione del preparato citologico dei 62 casi inclusi nello studio e la successiva formulazione della percentuale di MCs contenuti nello striscio ottenuto dall’aspirazione del LR, è stata eseguita da un operatore che non aveva alcuna conoscenza dei pazienti seguendo la metodologia già descritta per la valutazione comparativa tra DQ e MGG.
I campioni citologici allestiti a partire dall’aspirato linfonodale sono stati analizzati per la morfometria nucleare da un operatore che non era al corrente delle informazioni cliniche dei soggetti da esaminare. Al fine di stabilire se esistono differenze nei valori dei parametri nucleari tra MCs reattivi e MCs neoplastici, sono stati studiati i MCs provenienti da LNs aumentati di volume di cani con malattie infiammatorie e infettive, di origine non neoplastica (Gruppo 2) e da LR di cani con MCT cutaneo (Gruppo 3). I preparati citologici colorati mediante colorazione DQ sono stati valutati al microscopio ottico (ingrandimento 20x; Nikon Eclipse 80i, Nikon Instruments, Calenzano, Firenze, Italia) allo scopo di identificare MCs sia singoli che in gruppi. Questi venivano quindi fotografati ad un ingrandimento di 100x (a immersione). Poiché i granuli intracitoplasmatici dei MCs spesso tendono a disporsi sopra il nucleo, sono stati fotografati solo i MCs che presentavano un nucleo con margini chiaramente identificabili. Tale approccio spiega il motivo per cui i campioni sottoposti a morfometria nucleare sono inferiori al numero di casi totali inclusi nello studio.
I campi microscopici a 100x sono stati riprodotti come immagini digitali sullo schermo per mezzo di una videocamera posizionata sul microscopio ottico. Questo è stato reso possibile da uno speciale software di cui il computer è equipaggiato, ossia un sistema analizzatore di immagini (Lucia, Nikon Instruments, Calenzano, Firenze, Italia). Per ogni campione sono state catturate dall’operatore immagini di campi cellulari rappresentativi e per ogni nucleo sono stati facilmente delineati i margini sul monitor del computer mediante l’uso del mouse (Figura 2). Il processore ha poi calcolato automaticamente le variabili nucleari (perimetro, superficie, diametro maggiore e minore). Sono stati considerati i seguenti parametri nucleari:
- area nucleare media (MNA): numero dei pixel corrispondenti alla superficie interna nucleare e alla metà dei pixel equivalenti al perimetro;
- perimetro nucleare medio (MNP): misurato come la distanza intorno al margine nucleare tramite il calcolo dei pixel;
- fattore di forma nucleare medio (FF): calcolata sulla base della formula matematica perimetro2 / 4 π area;
- coefficiente di variazione dell’area nucleare (NACV): espresso dal rapporto tra deviazione standard di MNA (SDA) e MNA;
- rapporto LS: espresso dal rapporto tra lunghezza maggiore e lunghezza minore del diametro del nucleo, nel quale le lunghezze sono misurate dal segmento radiale passante per il centro della massa nucleare e che unisce ciascuno dei margini nucleari.
MNA e MNP sono stati calcolati al fine di determinare la dimensione nucleare. Invece FF e il rapporto LS rappresentano delle stime della regolarità della cellula che identificano la forma del nucleo. Per determinare il valore di FF è stato applicato un criterio che tiene conto della forma della cellula e che prevede l’attribuzione ad FF di un valore equivalente a 1 quando il nucleo descriveva un cerchio perfetto, mentre attribuisce ad FF un valore < a 1 quando il nucleo forma un’ellisse. Parallelamente il rapporto LS risulta ovviamente > a 1 quando il nucleo è ellittico e 0 quando è perfettamente circolare. NACV invece rappresenta la variazione nelle dimensioni del nucleo di un singolo caso.
Immagini di MCs catturati dall’aspirato linfonodale.
A: cane con Leishmaniosi (Gruppo 2); B: cane con MCT metastatico (Sottogruppo 3.3); C, D: nuclei dei MCs che sono stati delineati per l’esecuzione della morfometria nucleare (colorazione DQ, immersione olio).
3.5 Analisi dei dati
Le differenze tra i diversi metodi di colorazione (MGG a confronto di DQ) sono state studiate attraverso l’utilizzo dell’ANOVA ed i relativi contrasti sono stati valutati mediante l’applicazione del test di Tukey HSD.
Tutti i dati raccolti allo scopo di valutare le percentuali di MCs nei diversi gruppi sono stati trasformati in radici quadrate tramite la correzione di Bartlett, analizzati mediante ANOVA e i contrasti valutati secondo il test di Tukey HSD.
Le differenze tra i valori dei parametri nucleari nei distinti gruppi testati sono state determinate con ANOVA attraverso un modello semplice e le differenze sono state valutate dal test di Tukey HSD. Sono stati considerati significativi, in rispetto a tutte le analisi eseguite, i valori di p< 0,05.
Considerando il fatto che l’interesse principale di questo studio è stato quello di verificare se la comparsa di metastasi a distanza nel MCT canino potesse essere prevista attraverso l’utilizzo della morfometria, i dati ottenuti dalla morfometria nucleare computerizzata nel Sottogruppo 3 sono stati correlati al follow up clinico.
