0 20 40 60 80 100
0 20 40 60
Tempo di incubazione (min)
Concentrazione AA (% del tempo 0)
*
*
*
Figura 4.4 Ossidazione dell’AA in presenza di cisteinil-glicina (Cys-Gly). Le incubazioni (volume finale 2 ml) sono state effettuate in TRIS-HCl 100 mM, pH 7,4 a 37°C e contenevano AA (0,5 mM), GSH (0,5 mM), Gly-Gly (20 mM) e ADP- FeCl3 (200-20 µM di ADP e di FeCl3, rispettivamente). Le reazioni sono state fatte partire aggiungendo ADP-FeCl3 alle miscele di incubazione in presenza di GGT purificata (100 mU/ml) o di Cys-Gly (0,5 mM). () Controllo; (z) GGT purificata;
(∆) Cys-Gly.
I risultati sono la media ± d.s. di tre determinazioni indipendenti. I dati sono stati analizzati mediante il test di analisi della varianza a due vie. (*) p < 0,001 confrontato con il controllo.
121
0 25 50 75 100
0 30 60 90 120
Tempo di incubazione (min) Concentrazione GSH extracellulare (% del tempo 0)
*
*
*
(□) Controllo (▲) + Gly-Gly
A
0 25 50 75 100
0 30 60 90 120
Tempo di incubazione (min) Concentrazione AA extracellulare (% del tempo 0)
*
*
*
*
(□) Controllo (▲) + Gly-Gly
B
0 50 100 150 200
Controllo + Gly-Gly + Gly-Gly + AT125
Concentrazione AA intracellulare (120 min; nmol/mg di proteina) *
n.s.
C
122
Figura 4.5 Effetti dell’attività di GGT sulla captazione dell’AA da parte del clone di cellule di melanoma umano Me665/2/60 con alta attività di GGT. Le cellule sono state incubate in Hank’s buffer, pH 7,4 a 37°C per 120 minuti in presenza di AA (0,5 mM), GSH (0,5 mM) e ADP-FeCl3 (200-20 µM di ADP e di FeCl3, rispettivamente).
Le reazioni sono state fatte partire aggiungendo l’ADP-FeCl3 in presenza o in assenza di Gly-Gly (20 mM). Dove indicato, le cellule sono state trattate, prima dell’incubazione, con l’inibitore non competitivo della GGT acivicina (AT125; 1 mM). (A) Variazioni della concentrazione del GSH extracellulare; (B) variazioni della concentrazione dell’AA extracellulare; (C) concentrazione intracellulare di AA dopo 120 minuti di incubazione.
I risultati sono la media ± d.s. di tre determinazioni indipendenti. I dati delle concentrazioni extracellulari sono stati analizzati mediante il test di analisi della varianza a due vie, mentre i dati delle concentrazioni intracellulari finali sono stati analizzati mediante il test di analisi della varianza corredato con il test di Student- Newman-Keuls per confronti multipli. (n.s.) Non significativamente differente; (*) p
< 0,001 confrontato con il controllo.
123
