Introduzione ………....pag. I

Indice

I I n n d d i i c c e e

Introduzione ………....pag. I

Capitolo I : Connettività Cerebrale

I.1 Introduzione e Definizioni ………...…..……….pag. 1

I.2 Considerazioni Metodologiche generali ...….….…..………...pag. 4

Capitolo II : Cenni di Anatomia, Fisiologia e Connettività del Sistema Olfattivo Umano

II.1 Introduzione ………...….…...pag. 8

II.2 Il Sistema Olfattivo nell’uomo ……….….………...pag. 10

II.2.1 Il Sistema Olfattivo Periferico………..…………...…….……...…..pag. 10

II.2.2 Bulbo Olfattivo e Sistema Olfattivo Centrale………...……...….pag. 13

II.2.3 Connettività delle stazioni Olfattive………...…………...…pag. 16

Indice

Capitolo III : Metodi di Analisi di Connettività Funzionale ed Effettiva

III.1 Neuroimaging tramite tecnica fMRI …………..……..…….pag. 20 III.1.1 Cenni di Risonanza Magnetica (MRI)……….………..pag. 22 III.1.2 Principi di fMRI………...…….pag. 29 III.1.3 fMRI per l’Olfatto………....…….pag. 36

III.2 Studi di Connettività Cerebrale su dati fMRI …...…...pag. 37 III.2.1 Metodi di Analisi di Connettività Funzionale………..pag. 41 III.2.2 Metodi di Analisi di Connettività Effettiva: DCM………...…pag. 62

Capitolo IV : Structural Equation Modeling

IV.1 Introduzione ……….………...………...…..pag. 68

IV.2 Modello Strutturale e Metodi di Stima dei suoi

parametri ………..…....…pag. 70 IV.2.1 Stima del Modello attraverso il Maximum Likelihood

Extimator……….………pag. 78 IV.2.2 Bontà del modello : il test- χ

………...………...pag. 81 IV.2.3 Violazione delle Ipotesi………..………..…...pag. 84

IV.3 Il software: LISREL ……….………....…pag. 87

Capitolo V : Simulazioni e Test del modello SEM

V.1 Introduzione ……….………pag. 94

Indice

V.2 Generazione dei Dati Simulati ………...pag. 95 V.2.1 Modello di Connettività………...………..…………...……….pag. 99 V.2.2 Definizione dei Segnali e dei Parametri del modello………...pag. 101 V.2.3 Inserimento del Rumore: Modello di Misura…..……….……pag. 105

V.3 Scelta del Modello di Stima ………..pag. 113 V.3.1 Considerazioni sul significato ed il contenuto

del termine di rumore ζ ˆ ………pag. 118

V.4 Simulazioni sul modello di connettività a quattro

regioni ………...………pag. 121 V.4.1 Modello di stima standard: influenza dell’ SNR e del numero di

campioni………..……….….pag. 122 V.4.2 Modello di stima senza variabile Esogena………..….….……pag. 130 V.4.3 Modello di stima con variabile esogena ideale…….………....pag. 135 V.4.4 Valutazione dei risultati………...……pag. 140

V.5 Estensione del modello di connettività a cinque

regioni ……….……..pag. 142

Capitolo VI : Applicazione del SEM ai dati reali

VI.1 Introduzione ……….………..pag. 149

VI.2 Descrizione dell’Esperimento ……….…….pag. 150 VI.2.1 L’Olfattometro……….……….pag. 152 VI.2.2 Individuazione dei parametri dell’esperimento e acquisizione dei

dati………..pag. 155

VI.3 Analisi GLM per l’individuazione delle aree

olfattive ………...……….pag. 160

Indice

VI.4 Analisi di Connettività ………...……pag. 167

Conclusioni ……….………...………..pag. 177

Bibliografia ………...……pag. i

Appendice A : Maximum Likelihood ………..…pag. iv

Appendice B : Statistica ^χ

e test - ^χ

per LR ……….…..………pag. vii

Appendice C : Least Squares e Weighted Least Squares ...……pag. xii

Ringraziamenti

Introduzione

I

I I n n t t r r o o d d u u z z i i o o n n e e

Il lavoro di questa tesi si inquadra all’interno di una ricerca, svolta presso l’Istituto di Fisiologia Clinica dell’area della ricerca di Pisa, che si pone l’obiettivo di individuare attraverso la Risonanza Magnetica funzionale (fMRI) le regioni cerebrali coinvolte nell’attività olfattiva: in particolare viene affrontato il problema dello studio e dello sviluppo di modelli di connettività effettiva, con l’obiettivo di applicarli ai segnali fMRI delle aree olfattive, cercando di individuare e di risolvere le principali problematiche che si possono incontrare nell’affrontare uno studio di questo tipo.

Negli ultimi venti anni gli studi funzionali sul cervello, indirizzati soprattutto alla rilevazione e ricostruzione dei processi cerebrali cogniti e somatosensoriali, hanno avuto un larghissimo sviluppo grazie all’impiego di tecniche di indagine sempre più avanzate (EEG, MEG e a partire dagli anni ’90 anche PET e fMRI) e all’utilizzo di metodi di analisi statistica sempre più efficaci (GLM, PCA, ICA).

Le prime ricerche condotte in questo ambito affrontavano lo studio di quell’aspetto che comunemente viene indicato con il nome di segregazione funzionale, ponendosi l’obiettivo di riuscire ad individuare ed isolare le regioni funzionalmente specializzate nello svolgimento di determinati compiti cognitivi o attività sensoriali.

Più recentemente, soprattutto negli ultimi dieci anni, il punto di vista è cambiato e

l’interesse si è focalizzato anche sullo studio della cosiddetta integrazione funzionale,

cioè la rilevazione e la comprensione dei legami e dei meccanismi che permettono a

Introduzione

II

gruppi di neuroni, anatomicamente collegati e funzionalmente dedicati ad attività cerebrali specifiche, di interagire ed integrarsi tra loro secondo determinate architetture organizzative chiamate comunemente modelli di connettività.

Su quest’ultimo aspetto esiste una classificazione ben precisa dei vari tipi di connettività, anatomica, effettiva e funzionale, creata in funzione delle diverse tecniche di indagine e dei diversi metodi di analisi che vengono applicati a seconda del problema che si vuole affrontare.

La prima si fonda essenzialmente su studi in vivo su primati e solo più recentemente anche sull’uomo grazie all’innovativa tecnica non invasiva denominata DTI (Diffusion Tensor Imaging) che descrive l’insieme dei collegamenti fisici che esistono tra le varie aree cerebrali.

Per quanto riguarda gli altri due tipi di connettività, essi si riferiscono a due aspetti diversi ma complementari dell’organizzazione funzionale del cervello. La connettività funzionale riguarda la correlazione temporale fra due eventi neurofisiologici spazialmente distanti cioè prende in esame il “cosa fa” il cervello in risposta a determinati stimoli sensoriali o processi cognitivi, invece la connettività effettiva tenta di spiegare l’influenza che un sistema neurale esercita, direttamente o no, su un altro, ovvero vuole spiegare il “come” il cervello riesce a portare a termine la comunicazione fra tutte le regioni coinvolte in una certa risposta neurale.

E’ importante sottolineare che uno studio di connettività effettiva non può prescindere da ipotesi fondate circa la presenza di legami anatomici tra le diverse regioni; per questo motivo tali ricerche sono classificate come “hypothesis-driven”

mentre quelle di connettività funzionale sono denominate “model-free” perché caratterizzate attraverso un’analisi puramente statistica delle correlazioni presenti fra i dati.

Attualmente le tecniche di analisi più utilizzate per la ricerca di modelli di

connettività funzionale sono la PCA (Principal Component Analysis), la SVD

(Singular Value Decomposition) e la ICA (Indipendent Component Analysis); tutte

e tre sono tecniche di analisi multivariata basate su approcci descrittivi data-driven

Introduzione

III

che lavorano direttamente o indirettamente sulla matrice di covarianza dei dati osservati.

Invece per quanto riguarda l’analisi della connettività effettiva essa utilizza modelli statistici completamente diversi che lavorano su regioni selezionate e fa assunzioni sulle connessioni tra queste regioni in base a modelli di connettività anatomica.

Questo tipo di analisi è tanto più performante tanto più sono precise le informazioni sulle aree funzionali rilevanti. I più importanti metodi di ricerca di connettività effettiva sono il SEM (structural equation modelling) e il DCM (dynamic causal modelling); il primo, fino ad oggi maggiormente impiegato dell’altro, soprattutto su dati fMRI, è stato sviluppato nel campo dell’econometria mentre il secondo è nato appositamente per l’analisi delle serie temporali da imaging funzionale.

Questo lavoro si pone come obiettivo principale quello di studiare il SEM come metodo di analisi di connettività effettiva, quindi valutare i meccanismi e le potenzialità di tale metodo di stima in funzione delle condizioni sperimentali (in particolare SNR dei set di segnali) attraverso test specifici e simulazioni create ad hoc, infine tentare di applicarlo ai dati sperimentali cercando di interpretare i risultati ottenuti. Inoltre si prefigge anche la finalità di riuscire a capire quali sono i limiti applicativi di questo metodo, quali miglioramenti possano essere apportati al modello di stima ed eventualmente in che direzione dovrà svilupparsi la ricerca per ottenere risultati più soddisfacenti.

Preliminarmente, considerando il fatto che questa tesi si colloca in una fase di avvio della sperimentazione in cui una delle priorità è anche quella di valutare le possibili strade alternative, sono presentati anche i principi fondamentali su cui si basa il metodo DCM la cui applicazione richiede una modellizzazione basata su conoscenze anatomiche e fisiologiche molto dettagliate, purtroppo non disponibili per le zone cerebrali coinvolte nella funzione olfattiva.

Lo studio dello Structural Equation Modeling è affrontato in maniera molto

approfondita mettendo in evidenza tutte le particolarità del modello ed i significati

dei diversi termini delle equazioni costitutive, ma soprattutto cercando di capire

Introduzione

IV

come debbano essere interpretati i coefficienti di connessione previsti dal SEM, che ipotizza una modellizzazione statica e non dinamica (come il DCM) del cervello.

Inoltre è studiato il metodo di stima adottato dal SEM, cioè il Maximum Likelihood, con lo scopo di comprenderne l’applicabilità alla situazione sperimentale specifica.

In particolare il SEM lavora utilizzando un set di regioni ed un set di connessioni direzionali prestabilite, dove il significato di connessione tra A e B è inteso nel senso che A causa B. Le relazioni di causalità tra le varie regioni sono ipotizzate a priori in base ad informazioni di connettività anatomica. Il sistema cervello è considerato statico e le connessioni tra le regioni sono viste come legami di causalità istantanea.

Fissando i pesi da attribuire alla varie connessioni vengono automaticamente fissate le correlazioni che intercorrono tra i segnali delle varie regioni. Il principio su cui si basa la stima delle connessioni (e quindi dei loro pesi) è proprio quello di settare tali coefficienti in modo tale da minimizzare la differenza tra la matrice di covarianza ricavata dal modello e la matrice di covarianza dei dati sperimentali.

Un altro aspetto preso in considerazione nella tesi è la descrizione del software utilizato. Esistono diversi programmi che implementano il modello SEM tra cui quello più diffuso e completo si chiama LISREL, che oltre all’analisi di connettività offre anche tutta una vasta serie di applicazioni per l’analisi dei dati, proponendosi come pacchetto completo per il data-analysis. Tale programma è specializzato nella stima del modello di connettività secondo l’impostazione dello structural equation modelling, con l’unica variante che il modello prevede, oltre alle variabili osservate vere e proprie, anche un altro tipo di variabili, cosiddette latenti: queste vengono inserite nel modello per rappresentate i fattori di influenza dei legami di connettività non osservabili direttamente. Lo studio e l’approfondimento di questo tipo di modellizzazione è un altro punto fondamentale del lavoro e ci permette di capire come utilizzare il software per affrontare la ricerca di connettività che ci interessa.

La grande flessibilità del LISREL, che consente di settare completamente i vari

parametri del modello, garantisce la possibilità di mettere a punto numerose

simulazioni con cui testare varie forme del modello, per diversi valori del rapporto

Introduzione

V

segnale rumore, ed avere un quadro completo del comportamento dello stimatore nelle diverse condizioni sperimentali.

Le prove sono ideate in modo da ottenere risultati che possano essere estesi anche all’analisi dei dati sperimentali: i set di dati sono costruiti in modo che rispettino le caratteristiche dei dati reali (segnale bold con agggiunta di rumore gaussiano), e simulino il modello di connettività reale, prendendo a riferimento quello estrapolato dalla ricerca bibliografica sul sistema olfattivo; inoltre vengono testati diversi modelli di stima che propongono soluzioni diverse alle esigenze che si dell’analisi dei dati sperimentali.

I risultati delle simulazioni forniscono informazioni per individuare la struttura del modello più adatto alle caratteristiche dei dati a disposizione, date le conoscenze a priori sulla connettività delle aree coinvolte nelle funzioni olfattive. E’ inoltre possibile estrarre un metodo per quantificare la bontà nella stima del modello, in funzione delle condizioni sperimentali.

L’ultima parte della tesi, dopo un breve inquadramento dell’esperimento in cui sono descritti gli strumenti (l’Olfattometro) e le scelte che hanno permesso di avviare la sperimentazione, riguarda l’applicazione della modellizzazione SEM ai dati sperimentali. Tali dati, acquisiti attraverso la tecnica fMRI, si riferiscono a tre diverse sedute di acquisizione in cui è implementato lo stesso task di stimolazione ma utilizzando odoranti diversi.

Il lavoro è organizzato in sei capitoli. Il primo introduce i concetti fondamentali e le definizioni della connettività funzionale ed effettiva spiegando le differenze, soprattutto metodologiche, che stanno alla base di questa classificazione. Inoltre cerca anche di fornire un quadro generale sui problemi che occorre affrontare nell’impostazione di uno studio di connettività.

Nel secondo capitolo viene presentato lo studio dell’anatomia e della fisiologia del

sistema olfattivo e delle regioni cerebrali connesse a questo senso. Lo scopo è quello

di acquisire una documentazione il più possibile dettagliata, così da poter ricavare

un modello che descriva le probabili architetture di connettività che si sviluppano

tra le diverse regioni del cervello implicate nello sviluppo della risposta olfattiva.

Introduzione

VI

Questo è un punto molto importante poiché qualsiasi studio di connettività effettiva necessita di un modello di riferimento basato su informazioni strutturali reali.

L’unico problema è che, tra tutti i sensi umani, l’olfatto è quello evoluzionisticamente più antico e, nonostante rivesta un ruolo importante negli atteggiamenti psicologici e comportamentali dell’uomo, è anche quello meno studiato e conosciuto e quindi non sarà possibile creare un modello di connettività molto ampio e dettagliato.

Nel terzo capitolo vengono descritti i principi fondamentali su cui si basa la Risonanza Magnetica funzionale cercando di evidenziare i problemi legati all’impiego di questa tecnica per l’individuazione delle regioni olfattive. Inoltre viene presentata una panoramica completa dei vari metodi di analisi della connettività, sia funzionale che effettiva, fornendo un quadro completo dei metodi statistici più utilizzati in questo tipo di ricerche (PCA, SVD e ICA per la funzionale e DCM per l’effettiva). Per ogni tecnica di analisi vengono studiate le basi teoriche e i principi applicativi del metodo.

Il capitolo quattro è dedicato interamente alla descrizione e lo studio dello Structural Equation Modeling. Dopo una breve introduzione riguardo le origini di questa modellizzazione vengono presentate le equazioni descrittive del modello, i principi di stima applicati, i parametri di bontà con cui viene descritto solitamente il modello e le varie soluzioni adottate nel caso di ipotesi non verificate. Infine è descritto il software LISREL, le possibilità applicative che esso propone e le impostazioni da seguire per implementare l’analisi di connettività cerebrale.

Il capitolo cinque è quello più consistente ed affronta il problema della scelta, la messa a punto e l’attuazione delle prove di simulazione. I problemi affrontati sono quelli relativi alla creazione dei set di dati, alla scelta del metodo di stima con cui far lavorare il LISREL e alla scelta delle varie configurazioni di connettività da testare.

Il tutto tenendo sempre presente che l’obiettivo è quello di generare delle simulazioni che siano il più possibile aderenti alle condizioni sperimentali reali così da poter estendere i risultati ottenuti in questa parte all’analisi dei dati sperimentali.

Lo scopo principale di questa sezione è quello di capire il comportamento dello

Introduzione

VII

stimatore in funzione del rapporto segnale rumore dei dati e in funzione del modello di connettività testato. Inoltre a fine capitolo è presentato il tentativo di applicare il metodo SEM in senso esplorativo per la ricerca di legami di connettività ignoti.

Nel capitolo sei viene descritta l’impostazione dell’esperimento e presentati i risultati dell’analisi standard dei dati reali, attraverso il GLM, con cui vengono individuate le regioni olfattive. Infine vengono presentati e interpretati i risultati dell’analisi di connettività attuata su quelle regioni.

Inoltre sono presenti anche tre appendici in cui si descrivono rispettivamente il

Maximum Likelihood, la statistica χ

e il test- χ

applicato al Likelihood Ratio ed

infine gli stimatori Least-Squares e Weighted-Least-Squares.