Istologia 02 – Colorazioni istologiche Preparazione di un campione La preparazione di un campione (preparato istologico) da osservare al microscopio comprende 3 fasi:

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Istologia 02 – Colorazioni istologiche

Preparazione di un campione

La preparazione di un campione (preparato istologico) da osservare al microscopio comprende 3 fasi:

1. Fissazione

2. Disidratazione e diafanizzazione

3. Inclusione e/o sezionamento

4. Colorazione

Colorazione¹

Esistono diverse “tecniche di colorazione”dei tessuti. Le principali sono le seguenti:

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Istologica. Questo tipo di colorazione mette in evidenza lei “caratteristiche morfologiche” dei tessuti e delle cellule. A sua volta, comprende tecniche bicromiche (quando si usano due coloranti),tricromiche (se si usano 3 coloranti) e tecniche elettive (quando si privilegia la colorazione di un determinato tessuto – es. connettivo, nervoso, muscolare - a scapito di altri).Le più diffuse colorazioni istologiche sono l’Ematossillina-Eosina (bicromica), colorazione di Azan-Mallory (tricromica) e alcune colorazioni istologiche selettive, quali la Gomori, la Sudan III, la Nissl, la Golgi- Cajal, la May-Grunwald-Giemsa.

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Istochimica. Mette in evidenza le “caratteristiche chimiche”dei tessuti e delle cellule che li compongono. Ciò avviene sviluppando una reazione chimica vera e propria che darà un precipitato che si vede al microscopio. Esempio classico è la reazione di PAS e l’Alcian blu.

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Immunoistochimica. Si tratta di una tecnica di colorazione altamente specifica che coloradeterminati antigeni presenti nel tessuto. Questa tecnica prevede l’uso di particolari anticorpi legati a cromogeni insolubili che permettono la visione delle strutture che interessano mediante microscopia ottica (si tratta di metalli pesanti, enzimi o fluorocromi).

Alcuni esempi di colorazione istologica.

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Colorazione ematossilina-eosina (EE) è la tecnica più comunemente usata.

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Ematossilina: colorante basico, quindi acidofilo: si lega a molecole acide conferendo ad esse un colore blu-viola. Si colorano con ematossilina il nucleo, i ribosomi, le ragioni acide del citoplasma e la matrice extracellulare cartilaginea.

o

Eosina: colorante acido, quindi basofilo: si lega a molecole acide conferendo ad esse un colore rosso-rosa. Si colorano con eosina le regioni basiche del citoplasma e le fibre collagene.

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Colorazione Azan-Mallory: è una colorazione tricromia, composta da:

o

Azocarminio:

con il metodo di Heidenhain, colora in rosso intenso i nuclei, cromatina, eritrociti; in rosa pallido il citoplasma

o

Acido fosfotungstico: prepara all’aggiunta della miscela

1 La colorazione serve a rendere visibili le cellule, dato che esse sono per natura trasparenti. La maggior parte dei coloranti è impiegata per la microscopia ottica, mentre per quella elettronica non si usano coloranti, ma si uniscono i campioni ad alcune sostanze metalliche, che si prestano bene ad essere attraversate dagli elettroni (TEM) o a riflettere il fascio di elettroni, mettendo in evidenza le superfici cellulari (SEM).

Istologia 02 – Colorazioni istologiche

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Miscela policroma di Mallory

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Composizione

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Blu di anilina

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Orange G

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Acido ossalico

L’Azan Mallory colora in rosso

intenso i nuclei, cromatina, ed eritrociti; in rosa pallido il citoplasma; in blu intenso le fibre collagene e le fibre reticolari; in azzurro le mucine e il mucinogeno; in arancio le cellule del sangue e le fibre muscolari.

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Colorazione di Gomori: è una colorazione elettiva per le fibre reticolari, che appaiono in nero intenso su un fondo grigio-giallo. Si basa sull’affinità dell’‘argento per le proteine costituenti queste fibre.

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Colorazione Sudan III e Sudan Black: serve per evidenziare le goccioline lipidiche contenute nelle cellule adipose. Le sezioni si ottengono da

pezzi congelati e tagliati al criostato (in modo da evitare i successivi passaggi nei solventi organici) che scioglierebbero le goccioline lipidiche. Il Sudan III colora le goccioline lipidiche in giallo-arancio mentre il Sudan Black le colora in nero.

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Colorazione di Nissl: è una colorazione per il sistema nervoso centrale e si usa su sezioni in paraffina di 10 µm di spessore. La peculiarità è quella di mettere in evidenza la

zona tigroide del Nissl (accumulo di ribosomi nel pirenoforo, il corpo cellulare delle cellule nervose), colorandola con il blu-azzurro tipico del blu di toluidina.

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Colorazione di Golgi-Cajal: anch’essa è una colorazione specifica per il sistema nervoso centrale. Piccoli pezzi molto freschi di sistema nervoso centrale vengono immersi per 1-6 giorni in soluzione osmio-bicromica a 25°C. Successivamente, il pezzo viene colorato con nitrato d’argento all’1% in acqua. La reazione può durare fino a 3 giorni. A colorazione avvenuta si includono i pezzi in paraffina e si tagliano sezioni molto spesse, intorno a 40-50 µm, per avere una visione il più completa

possibile del tessuto e dei vari costituenti cellulari. Questa è una colorazione di difficile riuscita che, molte volte, presenta problematiche praticamente irrisolvibili. In ogni caso, si ha una buona colorazione quando le cellule nervose spiccano in nero intenso su un fondo color tabacco. Proprio perchè di difficile e incostante riuscita sono state proposte, da vari autori, diverse varianti (Golgi- Bubenaite, Golgi-Cox, ecc.) …sempre difficoltose da realizzare.

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May-Grunwald-Giemsa: è una colorazione elettiva per il sangue. Viene utilizzata per colorare gli strisci di sangue. Il sangue viene strisciato su un vetrino portaoggetto, fissato per 30 min. all’aria e colorato prima con la miscela di May-Grünwald (blu di metilene e eosina), quindi, lavato e colorato col Giemsa (composto da eosina, blu di metilene, azzurro A e B

e violetto di metilene). I globuli rossi appaiono rosa-arancio, i nuclei dei leucociti blu.

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Alcuni esempi di colorazione istochimica.

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Reazione PAS (reazione acido periodica di Shiff): questa è una reazione specifica per le mucine neutre (presenti negli epiteli secernenti, nelle ghiandole endocrine e nel sistema nervoso). Viene

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impiegato un ossidante (l’acido periodico), che attacca selettivamente il gruppo funzionale amminico primario o quello –OH delle mucine, provocando la

liberazione di un gruppo aldeidico rivelato, poi, dal reattivo di Shiff (rosso porpora). Si esegue normalmente in associazione all’Alcian blu (che colora le mucine acide).

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Alcian blu: è una colorazione utilizzata per evidenziare sia le mucine acide che i glicosaminoglicani (GAG) contenenti gruppi carbossilici.

Di solito si esegue in contemporanea alla PAS reazione, per avere un quadro completo delle mucine presenti nel preparato, sia acide (Alcian, precipitato blu intenso), sia neutre (PAS, rosso).

Alcuni esempi di colorazione immuno-istochimica.

L’immunoistochimica è un metodo complesso specifico per la rilevazione di particolari antigeni² presenti nel tessuto o nelle cellule da esaminare. Su

una sezione di tessuto o su cellule opportunamente preparate, si pone l’anticorpo specifico che è legato a sostanze evidenziabili alla microscopia (fluorocromi, metalli pesanti, enzimi).

Sezioni istologiche

Quando si osserva un vetrino, si deve saper immaginare la struttura 3D corrispondente all’immagine piatta che vediamo.

Se l’oggetto che si osserva è una sfera, ci apparirà come un cerchio di dimensione diversa a seconda della zona dove avviene il taglio.

Se l’oggetto è una struttura tubulare, possiamo avere tre diversi tipi di sezioni:

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Longitudinale: la struttura viene tagliata secondo la sua dimensione maggiore (di lungo);

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Un antigene è una sorta di “targa” che identifica le cellule di un organismo. Un organismo ha cellule diverse tra loro, ma con gli stessi antigeni. Gli antigeni vengono riconosciuti da particolari glicoproteine, gli anticorpi (o immunoglobuline – Ig). Essi sono prodotto da un particolare tipo di cellule, i linfociti B. Nei metodi immunoistochimici, il legame antigene-anticorpo causa una fluorescenza, che può essere rilevata con particolari macchinari.

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Trasversale: il taglio avviene lungo la dimensione minore dell’oggetto (perpendicolare al taglio longitudinale)

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Obliqua: il taglio avviene lungo un asse a metà tra il trasversale e il longitudinale.

Nel taglio longitudinale, un tubo può apparire o come due pareti distanziate da uno spazio vuoto (se il taglio avviene lungo la cavità del tubo) o come una singola parete (se il taglio non prende la cavità).

Nel taglio trasversale il tubo appare come un cerchio il cui interno è vuoto.

Nel taglio obliquo si ha una forma simile al taglio trasversale, ma più ovale.

Nel caso in cui si osservi un tessuto con cellule strettamente unite tra di loro (come un tessuto epiteliale di rivestimento), le sezioni longitudinale e trasversale daranno lo stesso risultato all’osservazione: si vedrà uno o più strati di cellule quadrate o rettangolari ed i nuclei risulteranno sempre allineati per file.

Se invece si fa una sezione obliqua, si osserveranno parti di cellule dei vari strati e lo stesso accadrà con i loro nuclei. Appariranno più file di cellule e solo alcune saranno complete, mentre la maggior parte risulterà frammentaria.

Preparazione microscopia elettronica

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Chimica

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Fissazione

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Disidratazione

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Impregnazione: con resina epossidica

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Taglio: ultramicrotomo (50 nm)

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Coloranti: sali e idrossidi di metalli pesanti

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Montaggio: microreti metalliche

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Fisica

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Frozen-fracture (impronta): scansione

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