Istologia 01 – Nozioni di microscopia e preparazione dei campioni Caratteristiche di un microscopio L’occhio umano ha una risoluzione massima di 0,2 mm (riesce a vedere due punti

Istologia 01 – Nozioni di microscopia e preparazione dei campioni 1

Istologia 01 – Nozioni di microscopia e preparazione dei campioni

Caratteristiche di un microscopio

L’occhio umano ha una risoluzione massima di 0,2 mm (riesce a vedere due punti separati fino alla distanza minima di 0,2 mm). Lo studio delle cellule e dei tessuti è quindi impossibile ad occhio nudo.

C’è bisogno di uno strumento adatto: il microscopio.

Sono due le sue caratteristiche principali:

1. Potere di ingrandimento: massimo ingrandimento che è possibile ottenere;

2. Potere di risoluzione: distanza minima che ci deve essere tra due punti per vederli ancora separati tra loro.

Tipi di microscopia

I principali tipi microscopi sono:

1. Ottico: è il più usato in istologia. Ha una risoluzione di 0,25 µm. Necessita sempre di una colorazione del campione (vedi dopo), in quanto le cellule non colorate sono trasparenti e quindi non osservabili.

2. A contrasto di fase: per osservare cellule in vivo, senza alterarne la struttura. Infatti, il processo di colorazione utilizzato perla microscopia ottica uccide le cellule.

3. A fluorescenza: per osservare campioni naturalmente fluorescenti o resi tali mediante il legame con alcune sostanze, dette fluorocromi.

4. Confocale: permette di osservare, in diversi piani, i vari strati costituenti il preparato in esame.

5. Elettronico: per lo studio dei dettagli cellulari (risoluzione 0,4 nm).

6. A forza atomica: per studiare gli atomi (risoluzione 0,25 nm).

7. In campo oscuro: in cui viene colorato di nero lo sfondo per far risaltare gli elementi cellulari. È utilizzato in quei casi in cui non è possibile effettuare una colorazione del campione.

8. A luce polarizzata: molto utilizzato per studiare le rocce e la loro composizione.

Microscopio ottico

Il microscopio ottico consiste in un tubo con lenti di vetro a ciascuna estremità; dal momento che contiene diverse lenti, il microscopio moderno è detto microscopio composto.

La luce passa sia attraverso il campione, che attraverso le lenti. Le lenti, grazie alla loro disposizione, permettono l’ingrandimento dell’immagine… un po’ come un binocolo al contrario.

Ottico A contrasto di fase A fluorescenza Confocale

Elettronico A forza atomica In campo oscuro A luce polarizzata

Istologia 01 – Nozioni di microscopia e preparazione dei campioni 2 Struttura

1. Oculari: le lenti attraverso le quali si effettua l’osservazione. Da un lato hanno inciso un numero che rappresenta il loro fattore d’ingrandimento.

2. Obiettivo: ciascun microscopio ha tre o quattro obiettivi. Insieme, l’obiettivo e l’oculare formano l'immagine ingrandita che viene osservata. Nella parte centrale del corpo di ciascun obiettivo è indicato il fattore d’ingrandimento.

3. Tavolino portapreparati: è il piano su cui si appoggia il vetrino da osservare; ad esso è attaccato il tavolino traslatore, che permette di spostare facilmente il vetrino in maniera controllata.

4. Condensatore: è situato sotto il tavolino portapreparati. Serve a focalizzare nel miglior modo possibile la luce sul campione ed è estremamente necessario ad alti ingrandimenti (ad esempio oltre i 400x).

5. Accensione: permette di accendere e spegnere la lampada.

Regolatore luce: permette di variare l’intensità della luce.

6. Fonte luminosa: rappresenta la sorgente della luce. La lampada può essere a led o ad incandescenza. In passato la fonte luminosa era rappresentata da uno specchio.

7. Vite macrometrica: è la manopola di regolazione grossolana della messa a fuoco.

8. Vite micrometrica: più piccola della precedente; è disposta sopra quella macrometrica (coassiale con essa). Permette la regolazione fine della messa a fuoco.

9. Terzo occhio per la telecamera: permette l’inserimento di una telecamera.

Modalità di utilizzo

1. Preparare il vetrino (vedi paragrafo Preparazione di un campione)

2. Posizionare il vetrino sul tavolino portaoggetti (bloccandolo con le molle ferma-vetrino).

3. Scegliere l’obiettivo a minimo ingrandimento e mettere a fuoco (prima con la vita macro- e poi con quella micrometrica … facendo attenzione a non sfondare il vetrino con l’obiettivo).

4. Regolare a luce ed il condensatore.

5. Spostare il tavolino (e quindi anche il vetrino) ed osservare gli altri campi.

6. Aumentare l’ingrandimento (girando il tamburo porta obiettivi).

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Istologia 01 – Nozioni di microscopia e preparazione dei campioni 3 Preparazione di un campione

La preparazione di un campione (preparato istologico) da osservare al microscopio comprende 3 fasi:

1. Fissazione

2. Disidratazione e diafanizzazione

3. Inclusione e/o sezionamento

4. Colorazione

Fissazione

La fissazione consiste nell’immobilizzare e conservare tutte le componenti del campione da esaminare per impedire ai tessuti di perdere le loro proprietà fisico-chimiche a causa dell’esposizione all’ambiente esterno La fissazione può essere:

 Chimica: vengono aggiunti al campione dei fissativi che variano a seconda dei componenti che si intendono visualizzare meglio. Le sostanze più comunemente usate sono:

 Alcol etilico (o etanolo): causa la perdita del 95% dei lipidi del campione;

 Aldeidi (formaldeide, paraformaldeide)

 Acido picrico e acido acetico

 Tetrossido di osmio (OsO

): non scioglie i lipidi

 Fisica: congelamento rapido del tessuto, mediante immersione in azoto liquido, alla temperatura di -170 °C. In questo caso, i campioni passeranno direttamente alla fase di sezionamento, saltando disidratazione ed inclusione.

Disidratazione

Dopo essere stato lavato accuratamente con acqua, il campione viene immerso in soluzioni contenente alcol etilico a concentrazioni via via maggiori (50%, 70%, 90%, 95%, 100%). Questo processo porta alla disidratazione del campione, che ha la funzione di fare spazio alla paraffina (passaggio di inclusione) e rendere il tessuto meno molle per facilitare il taglio.

Diafanizzazione

Il campione viene immerso in xilolo che ha una duplice funzione:

 Rimuovere il fissativo (etanolo) che non è miscibile con la paraffina (che viene utilizzata nel passaggio successivo);

 Rendere trasparente il campione.

Inclusione

Per poter essere osservato al microscopio, il campione in esame deve essere tagliato in sezioni così sottili da poter essere attraversate dalla luce.

Nel caso della fissazione chimica, il tessuto non presenta una consistenza tale da poter consentire l’affettamento. Per ovviare a questo problema, si include (inserisce) il tessuto in un liquido che poi solidifica e diventa duro. In questo modo, il blocchetto duro (formato dal liquido solidificato includente il campione) così ottenuto può essere affettato. Nel caso della fissazione fisica, invece, questo passaggio non serve.

La sostanza maggiormente usata per includere un campione è la paraffina. Il campione viene immerso nella

paraffina fusa (a 50 °C) e poi si lascia solidificare a temperatura ambiente.

Istologia 01 – Nozioni di microscopia e preparazione dei campioni 4 Un’altra sostanza impiegata comunemente è la resina epossidica, che viene preferita per i preparati della microscopia elettronica. Essendo più rigida permette il taglio di sezioni ancora più sottili rispetto a quelle dei campioni inclusi in paraffina.

Sezionamento

Il sezionamento permette di ottenere sezioni dello spessore adatto per essere viste al microscopio.

La procedura è diversa a seconda del tipo di campione:

 Campioni fissati chimicamente (e quindi inclusi in paraffina): il taglio viene effettuato con il microtomo, che permette di ottenere sezioni di 5-10 µm. Le sezioni vengono poi messe su un vetrino portaoggetti su cui precedentemente era stata messa una sostanza adesiva, e si lasciano ad asciugare.

Prima di procedere alla colorazione, le fettine vengono immerse nuovamente nello xilolo per rimuovere la paraffina e vengono reidratate attraverso soluzioni con concentrazioni via via decrescenti di alcol etilico (100%, 95%, 90%, 70%, 50%). Il campione è poi immerso in acqua distillata. La reidratazione è essenziale per la colorazione (i coloranti sono idrofili).

 Campioni fissati fisicamente: il sezionamento avviene solitamente con il criostato-microtomo. Si tratta di un dispositivo formato da un microtomo inserito in una camera fredda (criostato), in cui la temperatura varia dai -20 °C fino ai -45°C.

Le sezioni vengono trasferite su vetrini precedentemente raffreddati, successivamente portati a temperatura ambiente per poter procedere alla colorazione.

Preparazione dei campioni di microscopia elettronica

 Chimica

 Fissazione: con alcoli o aldeidi o con tetrossido di osmio

 Disidratazione: in alcol o acetone fino di propilene

 Impregnazione: con resina epossidica (es. epon araldite) a 60-90 °C

 Taglio: ultramicrotomo (sezioni di 50 nm)

 Coloranti: sali e idrossidi di metalli pesanti (acetato di uranile, per acidi nucleici) o idrossidi o citrato di Pb , che determinano un contrasto, per migliorare la visibilità

 Montaggio: sezioni sostenute da microreti metalliche

 Fisica: frozen-fracture (impronta): il tessuto viene congelato e fratturato nelle zone meno

resistenti. Si formano depressioni e convessità dovute alla presenza di organuli.