Universit`a degli Studi di Bologna

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FACOLT`A DI SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI

Corso di Laurea in Fisica

Modelli Stocastici del Sistema Immunitario:

Risposta Adattativa, Memoria e Longevit` a

Tesi di Laurea di: Relatore: Chiar.mo

Luca Mariani Prof. Giorgio Turchetti

Sessione II

AA 2000/2001

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FACOLT`A DI SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI

Corso di Laurea in Fisica

Modelli Stocastici del Sistema Immunitario:

Risposta Adattativa, Memoria e Longevit` a

Tesi di Laurea di: Relatore: Chiar.mo

Luca Mariani Prof. Giorgio Turchetti

Parole chiave: modelli stocastici, dinamica non lineare,

sistemi biologici complessi, biologia del tempo di vita curve di sopravvivenza

Sessione II

AA 2000-2001

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INDICE

Introduzione . . . 4

1 Il Sistema Immunitario Umano . . . 6

1.1 Il Sistema immunitario . . . 6

La Risposta Immunitaria . . . 6

Evoluzione della Risposta Immunitaria . . . 8

1.2 Organizzazione del Sistema Immunitario Umano . . . 10

1.3 I Linfociti T . . . 12

1.4 Meccanismi di Risposta del Sistema Immunitario . . . 15

1.5 Immunosenescenza . . . 18

Caratteristiche dell’Invecchiamento . . . 18

Rimodellamento del repertorio cellulare . . . 19

Stress in Immunosenescenza. . . .20

Evoluzione del sistema immunitario . . . 22

2 Modelli stocastici per l’evoluzione dei linfociti T citotossici nelcorso della vita umana . . . 24

2.1 Caratteristiche per un medello di evoluzione dei linfociti . . . 25

2.2 Stress immunologico e rumore bianco . . . 28

2.3 Modello a Concentrazioni . . . 30

Premesse . . . 30

Analisi deterministica . . . 32

Analisi stocastica . . . 34

Interpolazione con i dati sperimentali . . . 38

2.4 Modello a Valori Assoluti . . . 39

Premesse . . . 39

Nuova analisi stocastica . . . 40

Stima delle deviazioni standard . . . 43

Concentrazioni: analisi e confronti . . . 45

Conclusioni . . . 47

2.5 Modello Infantile. . . .47

Premesse . . . 47

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2.6 Modello Adulto . . . 52

Premesse . . . 52

Casi particolari: β = 0 . . . 54

Stima delle curve deterministiche . . . 55

3 Curve di Sopravvivenza . . . 61

3.1 Biologia del Tempo di Vita . . . 61

Caratteristiche della biologia del Tempo di Vita . . . 61

Eterogeneita’ genetica, fluttuazione ambientale e stocasticita’ di morte . . 63

3.2 La legge di Gompertz-Makehan . . . 65

Caratteristiche di una Legge di Sopravvivenza . . . 65

Formulazione della Legge di Gompertz-Makehan . . . 65

Osservazioni sulla funzione Gompertziana . . . 68

3.3 Curve di Sopravvivenza del modello a Concentrazioni . . . 69

Approssimazioni dei modelli del capitolo 2 . . . 69

Soglia di sopravvivenza . . . 71

Osservazioni sulle curve di sopravvivenza . . . 75

Confronto con la curva di Gompertz-Makehan . . . 79

APPENDICE A: Soluzione dell’equazione di Fokker-Planck per il processo di Ornstein Ulembeck unidimensionale omogeneo . . . 84

APPENDICE B: Soluzioni per il processo di Ornstein Ulembeck del modello a Valori Assoluti,casi omogeneo e disomogeneo . . . 88

APPENDICE C: Calcolo delle soluzioni del modello Adulto . . . 94

APPENDICE D: Andamenti della curva di Sopravvivenza e del Tasso di Mortalit`a . . . 98

Ringraziamenti . . . 102

bibliografia . . . 103

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Introduzione

Il Sistema Immunitario Umano, il cui scopo è preservare l’integrità dell’organismo rispetto alle sollecitazioni interne ed esterne, è , al pari del Sis- tema Nervoso, un prototipo di sistema biologico complesso. Mettendone in luce l’organizzazione, i meccanismi caratteristici ed i legami esistenti tra le risposte antigeniche e lo sviluppo genetico(cap.1), risulta evidente come le sue dinamiche caratterizzino le varie fasi della vita umana (Immunosenesenza) e la sua evoluzione possa essere studiata attraverso modelli di tipo stocastico.

Questa ipotesi permette di prendere in considerazione l’eterogeneit`a genetica, le fluttuazioni ambientali e la casualit`a dell’interazione individuale, superando le limitazioni di una descrizione puramente deterministica. In questo scenario si propone una serie di modelli stocastici che descrivono diversi aspetti del sistema immunitario clonotipico quali la produzione timica, la conversione cellulare e il rimodellamento dello spazio immunitario. Questi modelli sono basati su sistemi di equazioni differenziali ordinarie, lineari e non, in cui si introduce, tramite un rumore bianco, l’effetto delle fluttuazioni antigeniche(cap.2).

I riscontri tra le soluzioni dei modelli ed i dati sperimentali, relativi ai Linfociti T Citotossici, confermano la validità , su lunghe scale temporali, dei meccanismi immunologici considerati. I modelli proposti consentono non soltanto di seguire l’evoluzione temporale delle concentrazioni linfocitarie, ma anche di valutare la probabilità di sopravvivenza di una popolazione umana, assumendo un marcatore di mortalità legato alle stesse concentrazioni (cap.3); inoltre la legge di sopravvivenza dedotta dal modello, dipendente soltanto da due parametri, può essere

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utilizzata per descrivere la statistica del tempo di vita di un’ampia classe di popolazioni biologiche.

Il contributo innovativo di tale legge viene esaminato in relazione alle problem- atiche e ai risultati raggiunti nello studio della Biologia del Tempo di Vita, pren- dendo come termine di paragone la Legge di Gompertz-Makehan. La somiglianza esistente negli andamenti generali delle due leggi, nasconde tuttavia una notevole diversità che si evidenzia nel comportamento delle rispettive derivate (Mortal- ity Rate) in fase senescente. Mentre nella legge Gompertziana, che si fonda su una statistica di Mortalità , questa derivata cresce esponenzialmente, nel modello proposto essa decresce, dopo avere aver raggiunto un massimo in corrispondenza dell’età media della popolazione, fornendoci una spiegazione biologicamente moti- vata di casi di estrema longevità (ultracentenari).

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Capitolo 1

IL SISTEMA IMMUNITARIO UMANO

Sommario

In questo primo capitolo si cerchera’ di dare una breve descrizione del Sistema Immunitario Umano, soffermandoci principalmente su quegli aspetti che verranno ripresi nei prossimi capitoli. Dopo aver introdotto le funzioni che permettono la sopravvivenza dell’organismo e i legami esistenti tra risposta immunitaria, evoluzione genetica e adattamento ambientale (par.1.1), si mettera’ in evidenza l’organizzazione interna (par.1.2) approfondendo soprattutto lo studio dei Linfociti T (par.1.3), la sottopopolazione campione per i confronti sperimentali condotti nei modelli proposti in seguito. Verranno infine presentati i meccanismi di risposta (par.1.4) ed alcuni fenomeni correlati all’Invecchiamento nel Sistema Immunitario(par.1.5).

1.1IL SISTEMA IMMUNITARIO

La Risposta Immunitaria

Il Sistema Immunitario SI nel suo complesso puo’ essere definito come un ”Sis- tema Biologico Complesso” , con la funzione di riconoscere e neutralizzare gli agenti esterni nocivi ( virus, funghi, batteri ..) che attaccano l’organismo e gli agenti autole- sivi prodotti dall’organismo stesso in particolari condizioni fisio-patologiche ( forme allergiche,malattie autoimmuni,..). Nello specifico sono preposti a svolgere tali com- piti un grande ed eterogeneo gruppo di organi,cellule e sostanze in soluzione.

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Le prime barriere che difendono il nostro organismo dalle infezioni esterne sono la cute e le mucose; quando un agente patogeno riesce a superarle viene attaccato dai Leucociti ( o Globuli Bianchi). L’organismo reagisce a questa infiltrazione di agenti esterni con una difesa immunitaria che unisce due meccanismi di risposta complementari: la Risposta Immunitaria Innata e la Risposta Immunitaria Adattativa.

Gia’ i primi studi effettuati sull’SI nel 19^mo secolo mostrarono come in seguito ad un attacco esterno, aumentino nel sangue le concentrazioni di determinate sostanze, dette Anticorpi, e ci si immunizzi in maniera anche duratura verso alcune malattie (peste,vaiolo,..). Tale forma di risposta immunitaria, che prevede la produzione di anticorpi caratteristici del particolare patogeno infettante, e’ detta Adat- tativa e porta l’individuo a rafforzarsi contro gli agenti precedentemente incontrati

(1) .

A fianco di questa forma di risposta, che diventa altamente efficace solo dopo una prima fase di apprendimento, si trova una risposta Innata che ha il vantag- gio di essere immediata e non specifica, ma che invece di debellare completamente l’infezione mette in atto solamente un’azione di contenimento dell’infezione stessa.

(1) A causa delle reazione innescate si e’ dato il nome di Antigene ( ANTIbody GENEretor ) a tutte le sostanze capaci di essere riconosciute dal SI adattativo.

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Figura 1.1Classificazione dei Patogeni

EVOLUZIONE della Risposta Immunitaria

Una potente prospettiva in grado di chiarire alcuni aspetti fondamentali della Risposta Immunitaria e’ la Propspettiva Evolutiva. L’Immunita’ Innata e’ l’unica presente negli organismi piu’ semplici e meno evoluti (Invertebrati) poiche’ un SI con solo questo tipo di risposta e di configurazione costante e’ facilmente gestibile, nonstante sia molto poco funzionale ed ottimizzato. Si intravede una successiva evoluzione del SI che, conservando e riutilizzando le strutture della Risposta Innata, ha sovrapposto a questa Risposta Aspecifica una struttura piu’ complessa e dinamica in cui si sviluppa un elevato numero di funzionalita’. La Risposta Adattativa e’

infatti presente nelle specie animali piu’ evolute (Vertebrati), permettendo un alto rendimento energetico e una maggior durata della vita.

In conclusione la parte Adattiva migliora la risposta immunitaria contro gli antigeni tipici dell’ambiente dove viviamo e che quindi abbiamo incontrato precedentemente, ottimizzando i processi di creazione e di mantenimento cellulare in funzione degli antigeni presenti nell’habitat circostante. Quella innata, non potendo rimodel- larsi sul tipo di ambiente esterno, e’ in grado di difenderci da ogni tipo di antigene, senza specializzarsi sulle richieste effettive dell’organismo; queste caratteristiche la fanno diventare essenziale:

A-Nell’infanzia dove l’organismo appena entrato in contatto con l’ambiente esterno inizia a fare esperienze e a crearsi il patrimonio immunitario

B-Negli eventuali cambiamenti di ambiente esterno dove, come nell’infanzia, l’azione adattativa ha una ulteriore fase di apprendimento

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C-Nella vecchiaia dove i Meccanismi Adattativi che hanno aumentato le nos- tre capacita’ di reazione antigenica, lentamente si esauriscono ( tipico fenomeno di Pleiotropia Antagonista).

Le semplificazioni usate per introdurre la risposta immunitaria lasciano comunque in ombra uno dei problemi piu’ attuali e discussi dell’immunologia , ovvero la completa interazione tra i meccanismi di risposta Innata e Adattativa.

L’immunita’ Innata e’ la parte piu’ ancestrale del SI e quindi anche quella piu’ re- sistente,consolidata ed indipendente.E’ sulle sue reazioni che si e’ andata a sovrap- porre nel corso dell’evoluzione genetica un’ulteriore forma di risposta adattiva, che memorizza informazioni e si configura sulle caratteristiche dell’ambiente esterno; in quest’ottica e’ naturale comprendere come la Risposta Adattativa continui a dipen- dere dai meccanismi su cui si e’ inserita, migliorando e aiutando la risposta Innata senza pero’ sostituirla. Queste due forme di risposta sono quindi interagenti; a livello di popolazioni cellulari infatti si vede come l’innescarsi della prima ( produzione citochinica,..) sia propedeutico all’avvio della seconda. Questo nuovo scenario riesce cosi’ a spiegare in termini evolutivi come il contributo della risposta Innata diventi essenziale nei limiti estremi della vita umana, dove si assiste a una perdita delle fa- colta’ adattative, e perche’ la risposta Adattiva,che caratterizza la fase matura di un organismo evoluto,invecchiando diventi per sua stessa natura meno efficace.

1.2 ORGANIZZAZIONE del SI UMANO

Tutti i Leucociti sono prodotti nel Midollo Osseo da un progenitore comune definito Cellula Staminale Ematopoietica; dopo questa fase di produzione alcuni tipi vengono

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immessi direttamente nel sangue, altri invece migrano in tessuti dove continuano a maturare (tessuti linfoidi centrali) per poi raggiungere quelli dove restano in attesa

di una risposta immunitaria (tessuti linfoidi periferici). La suddivisione principale dei Leucociti avviene tra tre grandi famiglie: Linfociti,Cellule Dentritiche e Cellule Fagocitarie.

I Linfociti sono i principali mediatori delle risposte immunitarie, contribuendo a quella Adattiva con i Piccoli Linfociti (in cooperazione principalmente con le cellule

Dentritiche)) e a quella Innata con le Cellule Natural Killer ( insieme alle Cellule fagocitarie) . I Piccoli Linfociti, tutti morfologicamente simili, si differenziano

a livello cellulare tra Linfociti B e Linfociti T,in base alle molecole presenti sulla membrana( detti Marcatori Molecolari), caratteristiche delle funzioni che possono svolgere,presenti sulla membrana( detti Marcatori Molecolari).

I Linfociti B e gli anticorpi da essi generati mediano la Risposta Adattiva Umorale, cosi’ chiamata in quanto attuata attraverso la cooperazione tra cellule e

molecole in soluzione.

I Linfociti T sono portatori dell’Immunita’ Adattiva Cellulare,che si basa invece

sull’interazione e sulla cooperazione tra cellule.

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Figura 1.2Classificazione dei Leucociti

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1.3 I LINFOCITI T

I Linfociti T vengono immessi nel SI dal Timo ( l’organo poietico dove matu- rano) nei primi anni di vita, prima che quest’ultimo si atrofizzi durante l’adolescenza.

Essi si trovano inizialmente nel fenotipo denominato Vergine, riconoscibile dalla mancanza sulla membrana superficiale di proteine CD95 (CD95-).

La singola cellula Vergine, quando viene immessa nel SI, ha una sua specificita’

intrinseca, dipendente dalla forma molecolare dei recettore superficiali; tale specificita’ la fa essere reattiva solo a determinati tipi di antigeni e quando si verifica un attacco antigenico, solo un piccola parte del pool Vergine reagira’ attivamente. Questa reazione produce due possibili fenomeni di mutazione cellulare, entrambi caratteriz- zate dalla presenza sulla membrana del marcatore proteico CD95 (CD95+):

1-Le Vergini coinvolte raggiungono la configurazione bio-chimica Effettrice e quindi espandono via clonazione; tale clone va a combattere attivamente l’agente patogeno e finita la fase acuta, gradualmente si riduce via Apoptosi ( morte cellulare programmata).

2-Dopo la risposta immunitaria rimane all’interno del SI un clone di fenotipo Memoria, che in caso di successivi attacchi dello stesso antigene riesce a rispondere in maniera piu’ pronta ed efficace: tale clone e’ il mediatore della Memoria Immunologica.

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Figura 1.3Modelli teorici per la memoria immunologica.

Il fenotipo Effettore e’ quindi transitorio, diventando molto corposo in fase di

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attacco acuto, ma quasi ininfluente in assenza dell’antigene ⁽²⁾ .

(2) Queste considerazioni di carattere imunologico ci permettono sul lungo periodo

di mediare le fluttuazioni delle cellule Effettrici e di raggrupparle col fenotipo Memo-

ria nei successivi studi di popolazioni CD8. Mediando infatti e’ possibile eliminare

le forti oscillazioni che la loro concentrazione subisce dopo ogni attacco, e trattarlo

come un contributo costante

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Figura 1.4Schema per la classificazione dei Linfociti.

I linfociti T si distinguono ulteriormente in T Helper e T Citotossici, aventi ruoli e comportamenti diversi nell’ambito della risposta immunitaria. I T Helper (marcatore CD4+) hanno una funzione coadiuvante della risposta umorale, generando dei segnali costimolatori che permettono ai Linfociti B di attivarsi, proliferare e trasfor- marsi al fine di combattere l’antigene riconosciuto.

I Linfociti T Citotossici ( CD8+) ⁽³⁾ sono invece deputati all’eliminazione di cellule infettate da virus o di cellule alterate dell’organismo stesso(es. cellule tumorali).

1.4 MECCANISMI di RISPOSTA del SISTEMA IMMUNITARIO

I microrganismi che un normale individuo sano incontra nella vita solo rara- mente sono causa di malattie percettibili. La maggior parte di essi viene individuata e distrutta nel giro di poche ore da parte di sistemi di difesa non antigene-specifici che coma gia’ detto costituiscono la cosiddetta immunita’ innata. Solo nel caso in cui un microrganismo infranga queste prime difese o un composto molecolare venga a contatto con cellule del sistema, si innesca una risposta immunitaria Adattativa, con conseguente generazione di cellule effettrici antigene-specifiche, indirizzate speci- ficamente contro l’agente patogeno, e di cellule di memoria in grado di prevenire una successiva infezione dello stesso patogeno.

(3) Nei modelli proposti nel seguito i confronti sperimentali sono fatti sui T CD8+

Citotossici

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Figura 1.5Attacco patogeno e risposta immunitaria.

La prima fase di ogni risposta adattativa consiste nell’Attivazione delle cellule T vergini negli organi linfoidi periferici ( o Linfonodi) dove gli antigeni provenienti dai tessuti periferici vengono bloccati e processati.

Successivamente avviene il Differenziamento dei linfociti T vergini in cellule effettrici e cellule di memoria. Le modalita’ esatte con cui avviene questo meccanismo

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non sono ancora note completamente benche’ sia attualmente evidente il ruolo di costimolazione e cooperazione di altre cellule dell SI, come i macrofagi e le cellule NK (sono presentati in figura *.* gli attuali modelli ipotizzati).

Successivamente ha luogo l’Espansione Clonale, in cui i linfociti specifici per quell’antigene sono attivati e cominciano a dividersi una volta che, sotto opportune costimolazioni, raggiungono i tessuti periferici soggetti all’attacco. Il numero di linfociti cresce in maniera esponenziale su scale temporali diverse a seconda del tipo di linfocita: i primi linfociti a completare l’espansione clonale sono i T helper dato il loro ruolo fondamentale per l’attivazione della risposta umorale. Dopo alcuni giorni tutte le cellule T attivate possiedono funzioni effettrici.

Dopo che il carico antigenico e’ stato ridotto le cellule effettrici subiscono un processo di contrazione con cui gradualmente vengono eliminate circa il 95% delle cellule T specifiche per l’antigene. Questa contrazione e’ nota come Morte Cellulare Indotta da Attivazione (AICD) ed e’ il meccanismo principale di regolazione per gli stessi linfociti T nella fase successiva a quella effettrice.

L’ultima fase e’ quella della Memorizzazione, dove la presenza di cloni linfocitari antigene-specifici conduce il SI verso una configurazione tale da poter rispondere piu’ rapidamente ad eventuali attacchi di patogeni gia’ incontrati in precedenza.

1.5 IMMUNOSENESCENZA

Caratteristiche dell’Invecchiamento

Uno degli aspetti piu’ interessanti di un sistema biologico complesso, nel signi- ficato piu’ fisico della parola, e’ sicuramente lo studio delle configurazioni che esso

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Figura 1.6Risposta immunitaria specifica primaria e secondaria.

assume quando il suo stato evolutivo e’ lontano da quello iniziale. Il SI umano e’

anch’esso un sistema biologico complesso che invecchia, e non un sistema di difesa indipendente dal tempo come e’ stato considerato dai biologi per molto tempo . Fin dalla nascita, quotidianamente, noi veniamo a contatto con virus, batteri e sostanze esterne all’organismo che devono essere riconosciuti dal SI ed eventualmente distrutti nel caso questi risultino patogeni, e che soprattutto devono essere ”memorizzati” al fine di proteggere l’organismo da eventuali attacchi successivi di patogeni dello stesso tipo. La continua attivita’ immunitaria a cui noi siamo sottoposti, induce l’organismo

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sia da un punto di vista genetico che da un punto di vista cellulare a modificare alcuni meccanismi interni in maniera irreversibile riducendo gradualmente le risorse del sistema e limitando inevitabilmente le potenziali linee di difesa nei confronti di ulteriori insulti antigenici.

L’Immunosenescenza e’ il risultato di questa lunga attivita’ di difesa in cui l’organismo subisce numerosi cambiamenti che ne modificano continuamente gli equilibri interni fino a raggiungere una configurazione limite molto diversa da quella iniziale In questa ottica si deve affermare quindi che il SI di un individuo anziano e’ il risultato del funzionamento del sistema durante tutto l’arco della vita a partire dalla nascita o addirittura dal momento del concepimento. Lo studio dell’Immunosenescenza ha contribuito enormemente alla comprensione del complesso fenomeno dell’Invecchiamento perche’ ha permesso di riformulare, sulla base dei risultati ottenuti con la ricerca sperimentale, molti dei paradigmi interpretativi del fenomeno; uno per tutti che l’Invecchiamento non e’ una malattia di per se’ e quindi va separata dalle patologie associate all’eta’.

Rimodellamento del Repertorio Cellulare

Nell’Immunosenescenza si riscontra una riduzione globale dello spazio immunologico disponibile, conseguenza indiretta dei benefici effetti che l’SI, durante l’arco della vita, ha fornito all’organismo nella sua normale attivita’ di neutralizzazione degli agenti patogeni, e che in fase senescente determinano quasi paradossalmente i limiti di sopravvivenza umana. In base a numerosi risultati sperimentali, molti dei quali emersi dagli studi sul SI di individui centenari, fu formulata la Teoria del Ri- modellamento nell’Invecchiamento in cui si sostiene che l’Invecchiamento non e’

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semplicemente un deterioramento generale del sistema, ma piuttosto un processo di- namico di riassetto globale che coinvolge ogni suo sottosistema e che avviene durante l’intero arco della vita. In questo rimodellamento dell’organismo alcuni meccanismi si deteriorano nel tempo, altri migliorano le loro prestazioni e altri ancora possono rimanere essenzialmente invariati.

Esperimenti ”in vivo” hanno mostrato che i vari repertori cellulari presenti all’interno del SI evolvono in maniera eterogenea, con dinamiche differenti per ogni tipo di popolazione cellulare. Alcuni cloni si espandono enormemente mentre altri diminuiscono di dimensione, caratterizzando cosi’ lo ”Spazio Immunologico” di cias- cun organismo; ogni clone ha una sua storia, un proprio numero di replicazioni che lo contraddistingue dagli altri e che ne evidenzia il continuo mutamento nell’arco della vita. Come esempio si puo’ portare quello dei centenari e degli individui anziani in cui si riscontra una progressiva diminuzione del repertorio dei linfociti vergini, ed un progressivo aumento delle cellule effettrici e/o di memoria, soprattutto nel repertorio dei linfociti T citotossici.

Stress in Immunosenescenza

L’organismo umano e’ continuamente sottoposto a situazioni di Stress attraverso l’alimentazione, sostanze tossiche, smog e radiazioni elettromagnetiche, e ogni cellula del nostro organismo viene continuamente sottoposta alle numerose sti- molazioni che le giungono dall’ambiente che la circonda; possiamo allora immaginare il carico antigenico come un particolare ”stressore” a cui l’organismo reagisce attraverso la risposta immunitaria. Possiamo inoltre supporre che il SI sia soggetto a due forme di stress antigenico, che presumibilmente influiscono in maniera differente

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Figura 1.7Rimodellamento del Sistema immunitario

sulle modalita’ di attivazione ed espansione clonale della risposta immunitaria. Da un lato vi e’ l’Attacco Antigenico Acuto (stress acuto), ad esempio un infezione virale come l’influenza, capace di produrre nel sistema una vasta espansione clonale di linfociti T citotossici, mentre dall’altro vi e’ lo Stress Cronico, (o infezione cron- ica) ossia una sorta di stimolazione di fondo continua, le cui conseguenze nel SI non sono ancora state studiate approfonditamente. L’ipotesi di fondo dei vari modelli stocastici presentati in seguito e’ che questo tipo di Carico Antigenico Cron- ico genera l’attivazione della risposta immunitaria da parte di un clone memoria senza che sia presente l’antigene specifico. L’Immunosenescenza e’

in questa visione il risultato della continua esposizione ad una disparata varieta’ di antigeni(virus, batteri, ma anche cibo, molecole proprie e sostanze estranee al corpo) che spingono il sistema a mutare continuamente la dinamica interna dei suoi compo-

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nenti cellulari e molecolari. Questo continuo riassetto e’ il risultato di un processo a lungo termine teso ad ottimizzare l’efficienza della risposta immunitaria sia attraverso la ”memorizzazione” degli attacchi antigeni precedenti, sia attraverso l’impiego dei meccanismi genetici che caratterizzano la specificita’ della risposta clonotipica. Se da un lato quindi la genetica gioca un ruolo cruciale per l’evoluzione SI, in quanto gran parte dei meccanismi coinvolti nella risposta immunitaria sono promossi dalla codifica di informazioni contenute nel genoma, dall’altro non va trascurato il ruolo dell’interazione tra organismo ed ambiente. Quest’ultimo seleziona la storia immunologica di ogni individuo, in quanto ogni clone memoria e’ il risultato della particolare stimolazione a cui l’organismo e’ andato incontro ed il loro progressivo accu- mulo, nonostante garantisca una protezione duratura contro antigeni gia’ noti, allo stesso tempo riduce le potenzialita’ del SI, inibendo la produzione di nuove cellule vergini nei confronti di attacchi antigenici nuovi. Infatti, i cloni di linfociti memoria occupano nel tempo una porzione sempre piu’ vasta dello ”spazio immunologico”

disponibile, a scapito delle cellule vergini che diminuiscono gradualmente nel tempo.

La Riduzione dello Spazio Immunologico e la Diminuzione del Numero di Linfociti T Vergini nella fase senescente possono essere considerate tra le caratteristiche principali dell’Immunosenescenza e quest’ultima costituisce senz’altro un Marcatore Biologico di Mortalita’.

Evoluzione del SI

Alla immunita’ cellulare specifica si contrappone l’immunita’ innata, originatasi precedentemente da un punto di vista evolutivo, e presente quindi anche in organismi piu’ semplici. Nell’ invecchiamento si riscontra un aumento dell’attivita’ cellulare

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mediatrice della risposta immunitaria innata e su queste considerazioni sono state proposte, in una visione evolutiva dell’SI, alcune ipotesi.

1-La parte piu’ sofisticata del SI ossia l’Immunita’ Clonotipica Adattativa e’ anche la piu’ fragile e maggiormente propensa ad alterazioni rispetto all’Immunita’

Innata, piu’ semplice e maggiormente conservata nel tempo, che non risente sensibilmente dell’Invecchiamento dell’organismo

2-L’Immunosenescenza puo’ essere giustificata attraverso l’introduzione nel modello di una Pleiotropia Antagonista in cui, sostanzialmente, l’efficienza che un meccanismo ha offerto nella fase iniziale della vita si ripercuote in una perdita progressiva delle sue funzionalita’ in fase senescente (e viceversa).

Osservando infatti alcuni meccanismi genetici si riscontra che in fase giovanile alcuni geni contribuiscono positivamente al mantenimento dell’organismo, mentre in fase senescente deteriorano il sistema favorendo l’insorgenza di alcune patologie tipiche dell’Invecchiamento (diabete,..). I dati sperimentali disponibili sull’essere umano sono relativi non ad un singolo individuo seguito per un arco temporale molto lungo ma ad una popolazione di individui con eta’ diverse in modo da ricoprire gran parte del tempo di durata della vita in esperimenti a piu’ breve termine. Questi studi incrociati su piu’ persone se da un lato permettono di comprendere alcuni meccanismi correlati alla longevita’ e all’Invecchiamento, dall’altro pongono il problema della grande diversita’ genetica che intercorre nella popolazione e soprattutto non tengono conto del fatto che ognuno ha una propria peculiare interazione con l’ambiente esterno. Per poter verificare a pieno le conclusioni qui esposte, sono necessari degli studi longitudinali sull’essere umano, e questo richiede un notevole dispendio di risorse dato l’esteso arco temporale da prendere in considerazione. Contributi positivi possono

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essere offerti dalla modellizzazione matematica applicata allo studio dei meccanismi interni del sistema immunitario, sia da un punto di vista genetico che da un punto di vista di dinamica delle popolazioni cellulari nella comprensione di fenomeni quali l’Invecchiamento e la longevita’ estrema di particolari individui.

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Capitolo 2

MODELLI STOCASTICI PER L’EVOLUZIONE DEI LINFOCITI

T CITOTOSSICI LUNGO

IL CORSO DELLA VITA UMANA

Sommario

Scopo di questo capitolo e’ la creazione di modelli matematici per l’evoluzione su lunga scala temporale delle popolazioni di linfociti T citotossici CD8+ umani.

Saranno messe in luce le caratteristiche che un modello evolutivo di questo tipo deve soddisfare(par.2.1) e il rapporto tra contributo deterministico e stocastico(par.2.2), formulando le fondamentali ipotesi biologiche relative all’interazione dei CD8+ e fornendone una traduzione matematica in termini di sistemi differenziali. Lo studio degli andamenti deterministici, delle fluttuazioni stocastiche ed il confronto con i dati sperimentali porteranno alla creazione di modelli sempre piu’

accurati e ad una verifica delle ipotesi biologiche assunte.

Il primo modello (par 2.3) prende in esame unicamente le concentrazioni linfocitarie attraverso una analisi stocastica dell’interazione tra compartimenti fenotipici; nonostante alcune semplificazioni nella formulazione matematica di alcune ipotesi immunologiche, i risulati sono in accordo con gli andamenti qualita- tivi dei dati sperimentali (vedi figura). Una visione piu’ accurata dell’evoluzione dinamica delle popolazioni linfocitarie viene ottenuta dal Modello a Valori As- soluti(par2.4), in cui il contributo stocastico agisce distintamente sulle varie

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popolazioni linfocitarie permettendo una chiara interpretazione immunologica dei parametri scelti.

La teoria del rimodellamento del SI nel corso della vita (Franceschi) fornisce nuovi elementi biologici per la costruzione dei modelli successivi. I fenomeni che maggiormaente caratterizzano il remodellamento( azione timica e ridimensionamento dello spazio immunologico) caratterizzano col loro contributo fasi distinte della vita umana, rispettivamente l’infanzia e la senescenza. Queste considerazioni permettono una trattazione inizialmente separata dei vari fenomeni tramite l’implementazione del modello a Valori Assoluti ottenuto in precedenza in due sottomodelli: Modello Infantile(par. 2.5) e Modello Adulto(par. 2.6). I due sistemi stocastici ottenuti migliorano nelle fasce di eta’ considerate le dinamiche a cui sono soggette le popolazioni linfocitarie, non modificando gli andamenti generali che gia’ precedentemente avevano un buon accordo sperimentale e diventano un’ottima prova della validita’ delle semplici ipotesi fisico-matematiche di partenza e dell’approccio stocastico seguito.

2.1 Caratteristiche di un modello di evoluzione dei Linfociti T citotossici

I modelli sviluppati nei prossimi paragrafi studiano le dinamiche dei vari fenotipi di Linfociti T citotossici (vedi par 1.3) su scale temporali dell’ordine della vita umana. Le popolazioni di linfociti T si suddividono nei tre fenotipi Vergini, Memoria ed Effettori in base ai diversi recettori presenti sulla superficie cellulare.

Il fenotipo Effettore e’ uno stato di transizione breve della risposta linfocitaria se paragonato alle scale temporali prese in considerazione nei modelli; questo sug- gerisce di raggruppare i cloni di linfociti T di memoria e effettori in un unico

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comparto ( stesso biomarcatore CD95-), entrambi accumunati dall’aver sperimentato l’incontro con il loro antigene correlato. Questa scelta e’ inoltre dettata dall’ipotesi, presentata nel capitolo precedente (par 1.5), che porta a considerare la diminuzione di linfociti T Vergini un Marcatore Biologico di Mortalit`a ; mante- nendo il comparto cellulare Vergine isolato, e riunendo i due comparti Memoria ed Effettore,sara’ possibile sviluppare dai risultati dei Modelli uno studio sulle curve di sopravvivenza associate a questo marcatore (cap.3). Si definisce preliminarmente uno spazio delle fasi X=(V,M), prodotto scalare dei valori assoluti della popolazione Vergini(V) e della popolazione Memoria ed Effettore(M). La costruzione di questo spazio e’ utile per la visualizzazione dell’incremento e dello scambio di cellule tra i due compartimenti linfocitari. I principali contributi alla dinamica delle popolazioni linfocitarie nel SI individuati sperimentalemente sono: la Stimo- lazione Antigenica, la Ristimolazione Antigenica, il Contributo Linfopoietico e il Rimodellamento dello Spazio Immunologico.

La Stimolazione Antigenica rappresenta l’incontro della cellula Vergine con l’antigene specifico, a cui segue una sua trasformazione in cellula Effettrice;la conseguente espansione clonale della cellula Effettrice permette la soppressione dei patogeni infettanti ( vedi cap 1.4).

Dopo la fase di risposta antigenica acuta,solo una parte del clone Effettore sopravvive, rimanendo pero’ nel SI sottoforma di cellule di Memoria; un successivo incontro con l’antigene specifico provoca un ulteriore aumento nel repertorio di cloni Memoria ( Ristimolazione Antigenica).

Gli organi linfopoietici ( Timo e Midollo Osseo) immettono nel SI cellule in maniera indipendente dalla dinamica interna di M e V; il loro contributo sara’

(32)

quindi rappresentato da una funzione f(t), cosicche’ sia facilmente schematizzabile la loro azione variabile nel tempo.

Fenomeni invece che effettuano un rimodellamento dell’intero sistema, (ad es.

il Ridimensionamento del SI nella Senescenza) dovranno essere tenuti in considerazione nella scelta dei coefficenti del sistema differenziale cosi’ da regolare la dinamica generale.

Una forma generale per il sistema differenziale deterministico nello spazio X(V,M) cosi’ costruito `e

dX

dt = A(X(t)) X + f (t) (2.1)

o, esplicitando le dinamiche dei due comparti cellulari, dV

dt = A11(V, M )V + A12(V, M )M + fV(t) (2.2) dM

dt = A₂₁(V, M )V + A₂₂(V, M )M + f_M(t) (2.3) Notiamo subito che possiamo porre il termine f_M(t) = 0 , essendo riferito al contributo degli organi linfopietici che immettono solo linfociti vergini. La scelta delle condizioni iniziale riduce il sistema considerato ad un problema di Cauchy; con buona approssimazione per le scale temporali considerate, si puo’

fissare M(0)=0, cercando V(0) nell’accordo con i dati sperimentali.

La matrice A dovra’ avere autovalori non positivi per garantire la stabilita’

delle soluzioni del sistema. A11 e’ il fattore di conversione di cellule vergini in memoria,causata dall’attacco antigenico medio, sia acuto che cronico, a cui siamo costantemente sottoposti, ovvero quanta parte della nostra popolazione di

(33)

linfociti Vergini sperimenta l’antigene, mentre A21 e’ la conseguente quantit`a di cloni Memoria che si creano in seguito a questa trasformazione di cellule Vergini.

A₂₂ sara’ il fattore di riconversione di cellule Memoria in seguito a un successivo attacco antigenico precedentemente sperimentato che puo’ indurre una riduzione dello spazio Vergini ( A12 ).

Infine bisogna aggiungere alcune considerazioni sullo spazio delle fasi costruito per rappresentare i due comparti cellulari. Questo spazio ”immunologico” deve essere infatti finito, non potendo l’organismo mantenere in funzione un numero ar- bitrariamente grande di Linfociti: questa necessita’ di ottimizzazione delle risorse energetiche dell’organismo produce quindi una competizione tra i vari linfociti per il mantenimento del proprio spazio immunologico. L’evoluzione delle due popolazione cellulare dipende evidentemente dai vincoli imposti dalla limitatezza dello spazio, variabile nel tempo, e dai meccanismi di competizione che collegano i due repertori.

2.2 Stress immunologico e rumore bianco

Lo stress antigenico (vedi par 1.5), a cui il SI e’ costantemente sottoposto, tiene in considerazione le sollecitazioni prodotte sia dall’ambiente esterno, con cui identifichiamo tutti gli attacchi che subiamo da parte di patogeni presenti nell’ambiente circostante (aria, cibo,...), e dall’ambiente interno, che e’ costituito dalle cellule dell’organismo non appertenenti al SI e che da questo devono essere continuamente riconosciute e controllate come innocue. Questo attacco e’ per la maggior parte del tempo molto lieve, assimilabile ad una pressione, definita antigenica, a cui il SI e’ costantemente sottoposto, assolutamente scorrelata nel

(34)

tempo e che va ad assumere le caratteristiche fisico-matematiche di un Rumore Bianco; questo rumore di fondo e’ lo Stress Antigenico Cronico. Talvolta attacchi intensi su breve scala temporale e specifici, per cio’ che concerne la risposta clonotipica (stati influenzali), si presentano nell’organismo inducendo una forte espansione clonale; questi eventi, discretizzabili su lunga scala temporale, prendono il nome di attacchi Antigenici Acuti. Nella modellizazione matematica della dinamica di popolazioni di linfociti T citotossici su lunga scala temporale la fase acuta e’ un evento talmente breve rispetto al passo temporale preso in considerazione nel modello (1 anno) da poter essere sostituito con la media temporale sul passo stesso.

In conclusione lo stress cronico non produce delle reazioni visibili e distin- guibili nel SI, andando ad assumere un aspetto aspecifico, dovendo considerare la risposta data dal SI contro questo disturbo costante come globale e non attuata da una espansione clonale specifica; lo stress acuto e’ invece caratterizzato da stati influenzali a cui il sistema immunitario risponde in maniera specifica. L’evoluzione del SI si distinguera’ in una descrizione deterministica sulla media della popolazione presa in esame, in cui la genetica e l’ambiente medi influiranno sulle caratteristiche dell’ambiente esterno ed interno, ed in un descrizione stocastica che tenga conto della variabilita’ biologica (par.3.1) causata da un’eterogeneità genetica, dalle fluttuazioni ambientali e da una stocasticità dell’interazione individuale tra ambiente (esterno ed interno) e SI ⁽¹⁾ . L’analisi sui modelli proposti partirà

(1) Questa stocasticita’ si riflettera’ poi sulle dinamiche di sopravvivenza ed e’

una delle premesse fondamentali nello studio della ”Biology of the life Span” ( cap. 3)

(35)

dalla loro soluzione deterministica per trovare riscontri tra ipotesi biologiche, rap- presentazione matematica e valori sperimentali; questo permetter`a di comprendere come la componete stocastica regoli l’andamento diffusivo nel corso dell’intera vita umana dei dati sperimentali relativi ai diversi individui della popolazione studiata.

Il rumore bianco ξ (t) , il cui prodotto scalare `e < ξ (t), ξ (t^′) >= δ (t − t^′) , non presenta nessuna correlazione temporale e ha media nulla, < ξ (t) >= 0 . Si in- trodurr`a un coefficente ǫ per stabilire la forza con cui la fluttuazione dello stress agisce sull’intero sistema e un angolo θ per distribuire l’effetto di questo stress sui linfociti Vergini e Memoria. Infatti se la forza antigenica dell’ambiente (esterno ed interno) ǫ agisce su tutto il SI e’ unica, ogni compartimento linfocitario reagira’ in maniera diversa, a seconda delle proprie caratteristiche immunologiche, a questa pressione ambientale. Si ottiene un sistema differenziale :

dV

dt = A11(V, M )V + A12(V, M )M + fV(t) + ǫ cos²(θ )ξ (t) (2.4.1)

dM

dt = A21(V, M )V + A22(V, M )M + ǫ sin²(θ )ξ (t) (2.4.2)

L’idea di prendere una distribuzione regolata dai quadrati del seno e del coseno permette una migliore divisione degli effetti delle fluttuazioni stress antigenico:

l’intensita’ di questa fluttuazione, che verra’ dalla somma delle due fluttuazioni, non dipende infatti dall’angolo di distribuzione θ fissato ( ǫ cos²(θ )ξ (t) + ǫ sin²(θ ) = ǫ ).

(36)

2.3 Modello a concentrazioni

Premesse

Nel primo modello presentato abbiamo assunto le seguenti approssimazioni biologiche: non consideriamo il contributo degli organi linfopoietici ( f(t)=0) e nemmeno i rimodellamenti dello sistema immunitario,( la matrice A sara’ a co- efficienti costanti). Il contributo del Timo ( organo linfopoietico dei CD8+) ha infatti un ruolo attivo solo nella prima fase della vita, atrofizzandosi nella fase di sviluppo adolescenziale. Nel nostro modello abbiamo tralasciato questo contributo approssimandolo con una condizione iniziale per le cellule Virgin che tenga conto anche delle successive immissioni, mentre in seguito il loro valore dipendera’

dalle sole dinamiche di scambio con il compartimento di cellule T di Memoria.

Nel tentativo di costruire un modello per lo studio delle dinamiche di popolazione dei linfociti T che tenga conto dell’evoluzione dei compartimenti cellulari V ed M sull’intero corso della vita e dei collegamenti tra diminuzione del repertorio linfocitario e probabilita’ di morte `e lecito in prima approssimazione trascurare il contributo timico: l’infanzia `e caratterizzata da una dinamica di assestamento del repertorio immunitario molto caotica ( nei primi anni di vita l’organismo im- para a riconoscere e a combattere le principali forme antigeniche presenti nell’

ambiente ) e questa fase di transizione tra l’inesperienza nativa e la maturit`a immunologica ha quindi andamenti troppo complessi per rientrare in un modello

”long-living” a pochi gradi di libert`a ⁽²⁾ . La fase di rimodellamaneto del SI,in particolare la riduzione dello spazio immunologico, viene invece osservata in fase

(2) Sperimentalmente bisogna inoltre ricordare anche come il reperimento dei dati relativi alle popolazioni linfocitarie non renda possibile uno studio preciso

(37)

senescente e quindi il modello potr`a presentare discrepanze nelle code senza che le fasi precedenti ne risentano.Si delineano cosi’ quali devono essere le fasce temporali di validita’ del modello costruito ( 15-65 anni).

Analisi Deterministica

L’analisi deterministica parte dalla forma generale dV

dt = A11V + A12M (2.5)

dM

dt = A₂₁V + A₂₂M (2.6)

Definendo le variabili per le concetrazioni v = _{V +M}^V e m = _{V +M}^M si ottiene un sistema con la forma

dv

dt = A₁₁v + A₁₂m − (A11+ A₂₁)v²− (A12+ A₂₂)mv (2.7) dm

dt = A₂₁v + A₂₂m − (A11+ A₂₁)vm − (A12+ A₂₂)m² (2.8) Le condizioni iniziali sulle concentrazioni di Linfociti T Vergini e Memoria saranno v(0) = 1 ed m(0) = 0 , poiche’ al momento della nascita dell’individuo tutte le cellule linfocitarie presentano il fenotipo Vergine, non avendo sperimentato nessun antigene.Quetsa ipotesi e’ sicuramente vera in un’ottica ”long-living”, nonostante gia’ nella fase fetale il SI inizi a svolgere la sua funzione di Memorizzazione delle informazioni antigeniche. Il non considerare la riduzione dello spazio immunitario, di fasi temporali brevi della vita umana; i dati non dovrebbero essere presi su individui diversi, nati in periodi distanti e quindi con esperienze immunologiche completamente scorrelate,ma si dovrebbero utilizzare insiemi coortici e seguire ogni individuo per tutto il periodo interessato.

(38)

ovvero la diminuzione di Linfociti mantenuti dall’organismo nel SI che avviene nella fase senescente, ci permette di approssimare costante la dimensione dello spazio immunologico, condizione espressa matematicamente dal vincolo V+M=costante, ed A a coefficcenti costanti.

Dopo alcuni passaggi algebrici si trova

A21 = −A¹¹ A22 = −A¹² (2.9)

e, ridefinendo A₂₁ = α A₂₂ = β , si ha un sistema di equazioni differenziali per le concentrazioni del tipo:

dv

dt = −α v − β m dm

dt = +α v + β m (2.10)

Dalla relazione v + m = _{V +M}^V + _{V +M}^M = 1 , ci si riduce quindi all’equazione

dv

dt = −α v + −β (1 − v) (2.11)

v(t) = α e^{−t(α−β)}− β

α − β (2.12)

Posto T = _α−β¹ e v_∞ = −βT si ottiene l’equazione (vedi figura 2.1)

v(t) = v_∞ + (1 − v∞)e^−t/T (2.13)

(39)

(40)

Figura 2.1 Concentrazioni di Linfociti Vergini e Memoria

Parametri delle curve: sinistra α = .04 β = .005 ^{, destra} α = .06 β = .008 I fattori di conversione α e di riconversione β presuppongono un peso iden- tico dei due cloni nello spazio immunologico; quindi per ogni quantita’ di cellule Vergini stimolate un uguale quantita’ di cloni Memoria vengono creati, mentre la restimolazione di un certo numero di cloni Memoria togliera’ spazio nell’intero SI al repertorio Vergine, obbligandolo a diminuire proporzionalmente.

Analisi Stocastica

Se ora aggiungiamo all’equazione per le v un contributo stocastico che cerchi di descrivere lo stress antigenico fluttuante, aggiungiamo un ipotesi molto ridut- tiva sulla risposta immunologica: il numero di cellule dei due pool resta comunque costante (V+M=V(0)), in quanto non si modifica questa condizione se lavoriamo sulla v(t): le concentrazioni subiscono delle fluttuazioni complementari e la variazione stocastica di una popolazione viene equamente compensata da un identica variazione nell’altra.

Abbiamo quindi una un’equazione differenziale per questa evoluzione linfocitaria del tipo

dv

dt = −α v + −β (1 − v) + ǫ ξ (t) < ξ (t^′)ξ (t) >= δ(t^′− t) (2.14) Questa equazione ha una forma riconducibile alla pi`u generale equazione di Langevin

dx

dt = ψ(x, t) + ǫ ξ (t) (2.15)

(41)

dove ψ(x, t) e ǫ ξ (t) sono rispettivamente un campo deterministico generico e una forzatura stocastica con correlazioni nel tempo. Per tale sistema sappiamo che esistono due punti di equilibrio a seconda che v_∞ sia positivo o negativo(

vedi figura 2.2).

Figura 2.2Punti di equilibrio del sistema deterministico v(t) per v_∞>0 e per v_∞<0

Attraverso la trasformazione:

t^′ = t/T v^′= v − v∞ (2.16)

si ha che l’equazione (2.14) rappresenta un processo di Ornstein-Ulembeck (O-U) definito come

dv^′

dt^′ = −v^′+ ǫ√

T ξ(t^′) (2.17)

con correlazione temporale di tipo esponenziale della variabile v^′

hv^′(t₁)v^′(t₂)i = exp(−ǫ(t1− t2) − exp(−ǫ(t1+ t₂)

1 2ǫ

) (2.18)

(42)

Figura 2.3 Effetto del rumore sull’evoluzione della popolazione linfocitaria. La regione delimitata dalle due curve estremali rappresenta l’area in cui vengono distribuite le traiettorie dell’evoluzione stocastica con una probabilita’ di esistenza data dalla soluzione della Fokker Planck

Le traiettorie soluzioni dell’equazione di Langevin per il processo di O-U sono distribuite attorno alla soluzione deterministica che coincide con la curva mediata su tutte le realizzazioni possibili del processo stocastico (vedi figura 2.3)

Ogni traiettoria ha una diversa probabilita’ di realizzarsi che sara’ tanto mag- giore quanto piu’ la realizzazione stocastica si avvicina alla soluzione deterministica (che corrisponde al caso ǫ = 0 ). La densita’ di probabilita’ associata ad ogni istante di tempo alle possibili realizzazioni del processo e’ data dalla soluzione dell’equazione di Fokker-Planck relativa al processo di O-U (vedi appendice A)

(43)

∂ρ

∂t^′ − ∂(v^′ρ)

∂v^′ = ǫ²T 2

∂²ρ

∂v^′2 (2.19)

La densita’ di probabilita’ ρ relativa alla v(t) si scrive:

ρ(v) =

exp −

v − vmed(t)2

2σ²(t)

p2πσ²(t) (2.20)

che corrisponde ad una gaussiana centrata sulla soluzione deterministica, la cui larghezza cresce fino ad un valore asintotico costante

σ²(t) = ǫ²T

2(1 − e^−2t/T) (2.21)

Per ogni istante temporale t si ha un intero spettro di valori possibili per le concentrazioni, distribuiti attorno ad un valor medio coincidente con il valore dato dalla soluzione dell’equazione deterministica all’istante temporale t. La probabilita’ di trovare una concentrazione v(t) , in un intervallo di valori centrato attorno alla soluzione media, e’ data da un integrale gaussiano. Consideriamo le traiettortie all’istante t che si discostano da quella deterministica per una frazione della varianza σ(t) , vale a dire

hv(t)i + xσ(t) ≤ v(t) ≤ hv(t)i + (x + dx)σ(t) (2.22)

La probabilita’ che v(t) appartenga al tempo t a questo intervallo e’ dunque data da

P (dx) = e^−x²^/2

√2π dx (2.23)

ove (v − hv(t)i)²= x² .

Come conseguenza si ha che la probabilita’ che al tempo t la concentrazione di cellule vergini di un individuo assuma un valore compreso nell’intervallo

(44)

[hv(t)i + aσ(t), hv(t)i + bσ(t)] (2.24)

non dipende dal tempo t ed e’ data dalla seguente formula

Prob hv(t)i + aσ(t) hvi hv(t)i + bσ(t) = 1

√2π Z b

a

exp

−u² 2

du (2.25)

Inoltre, l’introduzione delle fluttuazioni dello stress antigenico, comporta che una data concentrazione v(t) non e’ piu’ raggiunta ad un tempo definito ma esiste, ed e’ calcolabile, la probabilita’ associata al raggiungimento di tale valore entro una eta’ t fissata in funzione dell’ampiezza dello stress antigenico a cui l’individuo e’ soggetto.

Interpolazione con i dati sperimentali

I grafici ottenuti dal modello ci mostrano un buon accordo sperimentale per le concentrazioni delle cellule Vergini, che seguono un rilassamento di tipo esponenziale e anche lo spread indotto dal rumore bianco e’ ben correlato con quello dei dati sperimentali; la curva relativa alle concentrazioni di cellule T di Memo- ria invece ha un grado di significativita’ ridotto dalla forte dispersione dei valori sperimentali e anche l’analisi delle deviazioni non conferma che parzialmente la correttezza delle ipotesi suggerite. Per cio’che concerne le curve deterministiche, possiamo avere due diverse interpretazioni: da un punto di vista immunologico la curva deterministica fornisce la descrizione di un ipotetico individuo sottoposto a uno stress antigenico cronico costante e ad attacchi antigenici acuti pari alla media della popolazione, con un valore che sia la media di quello subito in ogni istante da tutti gli individui della popolazione e che quindi non e’ stato sottoposto

(45)

a nessuna fluttuazione antigenica dall’ambiente esterno; statisticamente essa rappresenta invece l’evoluzione delle concentrazioni, pesata sulla genetica di una data popolazione,senza considerare l’eterogeneita’ che differenzia ogni individuo nella risposta alle sollecitazioni ambientali.

2.4 Modello a Valori Assoluti

Premesse

Il modello a concentrazioni, con soltanto due parametri deterministici α e β , riesce a descrivere bene la dinamica cellulare che, lungo l’intero corso della vita , regola l’evoluzione della popolazione linfocitaria di fenotipo Vergine e lo studio delle funzioni di sopravvivenza ad essa legata daranno nel successivo capitolo un ottimo accordo sperimentale. Tuttavia nel modello a due soli parametri sulle concentrazioni linfocitarie si considerano alcune ipotesi non completamente giustificabili per quanto riguarda l’effetto dello stress antigenico cronico sui due pool; se tali ipotesi danno la possibilita’ di lavorare su oggetti matematici facilmente trattabili in forma analitica, si deve comunque osservare quanto queste limitazioni ci discostino dalle reali interazioni e reazioni del SI agli stimoli subiti.

Le variazioni stocastiche a cui le due popolazioni sono soggette hanno nel modello precedente una perfetta complementarieta’ e l’accordo sperimentale dei risultati ottenuti mostrano come tale ipotesi non si discosti quantitativamente da una piu’

generale ipotesi di rumore indipendente su entrambi i compartimenti linfocitari.

Mettere in luce la validita’ di questa approssimazione ci permettera’ sul piano teorico di ricondurci ai risultati ottenuti dal vecchio modello per un ulteriore studio sulle curve di sopravvivenza.

(46)

Matematicamente il problema sorge dall’aver inserito il rumore nell’equazione differenziale per le concentrazioni, dopo aver imposto la condizione di vincolo V(t)+M(t)=costante, che quindi non viene modificata. Dal punto di vista immunologico e’ assolutamente piu’ corretto ipotizzare un rumore che provochi anche una fluttuazione sull’intero repertorio T e che agisca in maniera scorrelata sui due repertori Vergine e di Memoria. In questo secondo modello aggiungeremo queste ipotesi riguardo la parte stocastica del sistema; ovviamente l’analisi deterministica avra’ gli stessi risultati della precedente a meno di un cambio di variabili, passando dalle concentrazioni ai valori assoluti.

Nuova Analisi Stocastica

Il modello assume la seguente forma dV

dt = −α V − β M + ǫ cos²(θ )ξ (t) dM

dt = +α V + β M + ǫ sin²(θ )ξ (t) (2.26) dove ricordiamo (par 2.3) che α rappresenta la rapidit`a di conversione da cellule Vergini a cellule di Memoria dopo un attacco antigenico primario. β descrive la rapidita’ di riattivazione di cellule T di Memoria dovuto ad un successivo attacco dell’ antigene; la riespansione del clone T di Memoria ha un effetto inibitorio sulla popolazione di cellule T Virgini. ǫ ξ(t) `e un rumore bianco ( < ξ(t) >= 0 e < ξ(t^′), ξ(t) >= 0 ) che rappresenta la fluttuaziuone di Stress Antigenico con cui l’ambiente continuamente disturba le popolazioni. θ descrive la distribuzione sulle 2 popolazioni dello stress cronico, dandoci la possibilita’ di ipotizzare una risposta distinta delle popolazioni, dipendente dalle proprie caratteristiche fenotipiche . Mentre i valori di α e β restano identici nel passaggio

(47)

tra vecchio e nuovo modello, dovendo descrivere l’andamento dello scambio tra

i due comparti, il fattore ǫ sara’ riscalato in maniera proporzionale al numero

di particelle presenti nel sistema. Ponendo come condizioni iniziali del sistema

V (0) = V₀ e M (0) = 0 , le medie delle popolazioni in valore assoluto sono (

vedi app. B)

hV i = V0 β − α e^{(β−α )t}

β − α hMi = V0α e^{(β−α )t}− 1

β − α (2.27)

Le traiettorie stocastiche V (t) e M (t) (soluzioni del modello) sono dis-

tribuite attorno alle curve delle medie deterministiche che interpolano i dati sper-

imentali.

(48)

(49)

curva a sinistra θ = 0ô , curva al centro θ = 45ô , curva a destra θ = 90ô

Sono mostrati 3 diversi valori di θ ( 0 , ^π₄ e ^π₂ ) per entrambe i comparti cellulari Vergini e di Memoria . Al cambiare dell’angolo con cui si distribuisce il rumore dalle cellule vergini ( θ =0) a quelle del compartimento di memoria θ = ^π₂ la forma della varianza σ(t) muta significativamente. La distribuzione delle traiettorie per le cellule T Vergini dipende considerevolmente dall’angolo θ con cui si mescola il contributo stocastico, mentre per i cloni Memoria la dipendenza e’ molto minore. Il confronto sperimentale induce un’approssimazione ad angoli inferiori ai 45 gradi e porta ad una prima conferma di questo modello: riesce ad assegnare una importante caratteristica immunologica alle cellule Vergini, mag- giore sensibilita’ e dipendenza agli attacchi antigenici esterni. Infatti Se definiamo Lθ = (α cos²(θ ) + β sin²(θ )) allora le Deviazioni Standart di V (t) e M (t) sono ( vedi app. B)

σ_V² (t) = ǫ²

β²

(α − β)² t − 2 L_θβ

(α − β)³ (1 − e^(β−α)t) + L²_θ

2(α − β)³ (1 − e^{2 (β−α)t}

(2.28)

σ_M² (t) = ǫ²

α²

(α − β)² t − 2 α L_θ

(α − β)³ (1 − e^(β−α)t) + L²_θ

2(α − β)³ (1 − e^{2 (β−α)t}

(2.29) come si vede le due deviazioni standard descrivono la diversa interazione tra i due compartimenti con l’ambiente esterno. Dal calcolo delle correlazioni tra i valori assoluti di V ed M si ottiene:

hV (t)M(t)i = ǫ²

− α β

(α − β)² t + (α + β )Lθ

(α − β)³ (1 − e^(β−α)t) − L²_θ

2(α − β)³(1 − e^2(β−α)t

(2.30)

(50)

L’equazione (2.30) conduce ad un’espressione per la deviazione standard dell’intera popolazione dei CD8+

σ²_{V +M}(t) = ǫ²t (2.31)

Questi risultati ci permettono una prima analisi delle differenze nella parte fluttuante dei 2 modelli trattati:

1-Nel Modello a Concentrazioni la deviazione standard di cellule Vergini era identica a quella dei cloni Memoria, con un rilassamento esponenziale ad un valore costante σ_∞ = ^ǫ^√₂^T . Avendo imposto il vincolo V+M=costante prima dell’introduzione del rumore, la deviazione standard dell’intera popolazione e’ sempre nulla

2-Nel Modello a Valori Assoluti la crescita della deviazione dell’intera popolazione e’ lineare. Lo stesso andamento lineare e’ presente nel primo termine per le deviazioni standard di V ed M: tale termine risulta dominante per tempi lunghi a causa del decremento esponenziale degli altri due, mentre in fase iniziale tende ad annullarsi, e quindi ad avere un andamento simile a quello della deviazione standard del modello1.

Stime delle deviazioni standard

L’interpolazione con i dati sperimentali fornisce un stima dei parametri α ∼ 10⁻² , β ∼ 10⁻³ , L_θ∼ α , ǫ ∼ 10 che permette approssimazioni per t inferiori a 100 anni ( stima per la vita umana ). Per quanto riguarda il compartimento di cellule Vergini

σ_V² (t) ∼ ǫ²

(O(10⁻²) t − O(10) (1 − e^−O(10⁻²^)t) + O(10²) (1 − e^{2 −O(10}⁻²^)t)

∼

(51)

∼ ǫ²O(10²) (1 − e^{2 −O(10}⁻²^)t)) (2.32) Risulta quindi che nell’intervallo temporale dell’intero arco della vita umana le deviazioni standard del nuovo modello hanno un andamento approssimabile a quelle del vecchio modello, in quanto l’unico termine che contribuisce significativamente e’

ǫ² L²_θ

2(α − β)³ (1 − e^{2 (β−α)t} (2.33)

Questo risultato risulta di particolare importanza, essendo il primo passo per ri- condurre lo studio analitico delle curve di sopravvivenza effettuato sul modello a concentrazione anche a questo secondo modello; oltre alla dispersione dei dati si riuscira’ ad approssimare anche il valor medio delle concentrazione (sezione seguente).

Se la stessa stima viene fatta sulla deviazione standard del comparto di Memo- ria, che nel vecchio modello sottostimava la dispersione, il risultato tiene conto dei nuovi termini gia’ durante tutto l’arco temporale preso in considerazione (vita umana), mostrando come l’effetto di un rumore ambientale indipendente ne mod- ifichi la dispersione:

σ²_M(t) ∼ ǫ²

O(10⁰) t − O(10²) (1 − e^(β−α)t) + O(10²) (1 − e^{2 (β−α)t})

(2.34)

i tre termini hanno tra 0 e 100 anni contributi confrontabili causando un aumento della deviazione mantenendola comunque sullo stesso ordine di grandezza precedente. Questo risultato va evidenziato in quanto sperimentalmente si trova una forte dispersione nei dati relativi ai cloni Memoria, dispersione a cui le cellule Vergini non sono sostanzialmente soggette.

(52)

Concentrazioni: analisi e confronti

A questo punto e’ utile vedere la correzione che un rumore bianco indipendente sulle due popolazioni impone alle concentrazioni di cellule Vergini e Memoria, cosi’

da stimare l’ambito di validita’ dello studio che portera’ dalle concentrazioni e dalle deviazioni del modello 1 alle curve di sopravvivenza ( cap.3). Sappiamo che i valori medi < V (t) > e < M (t) > dell’attuale modello sono gli stessi che si troverebbero nel modello precedente tramite un opportuno cambio di variabili.

Notiamo allora che il vincolo sul repertorio cellulare si ridurra’ a

< V (t) + M (t) >=< V (t) > + < M (t) >= V (0) (2.35) Sviluppando le popolazioni linfocitarie rispetto a quella media si trova:

V (t) =< V > +ǫ V₁ = V₀ β − α e^{(β−α )t} β − α + ǫ

Z t 0

β − α e^{(β−α )t}

β − α cos²θξ(t − t^′)dt (2.36)

M (t) =< M > +ǫ M₁ = V₀αe^{(β−α )t}− 1 β − α + ǫ

Z t 0

αe^{(β−α )t}− 1

β − α sin²θξ(t − t^′)dt (2.37) La concentrazione v(t) = V (t)+M (t)^{V (t)} cambia il suo valor medio rispetto a v^∗(t) = ^{V (t)}_V

0 del modello precedente :

< v(t) >=< V (t)

V (t) + M (t) >=< < V > +ǫ V₁

V0+ ǫ (V1+ M1) >=

=< v^∗(t) >< (1 + ǫ V1

< V >) (1 − ǫV1+ M1

V₀ + (ǫV1+ M1

V₀ )²+ ...) (2.38) dallo sviluppo del binomio al denominatore, usando le relazioni che mi riconducono alle deviazioni standard che ho precedentemente calcolato:

< V₁² >= σ_V²

ǫ² ; < M₁² >= σ_M²

ǫ² ; ...

(53)

otteniamo l’espressione per la variazione tra la nuova e la vecchia concentrazione media:

δv(t) =< v(t) > − < v^∗(t) >= ǫ²

V₀²(σ_V²₁_+M₁ − σV²1− < V1M₁ >) =

= ǫ²α

V₀²(α − β)[t e^{(β−α )t}− Lθ

(α − β)²(1 − e^(β−α)t)] (2.39)

Questa differenza cresce monotonicamente e tende ad un valore fisso per t che va all’infinito:

δv_∞ = ǫ²α L_θ

V₀²(α − β)³ (2.40)

Se calcolata per t=100 con i parametri fissati dai fit assume il valore

δv(100) ∼ 0.011 (2.41)

Queste due funzioni (fig. 2.5) sono identiche nei primi anni di vita, iniziando a discostarsi sensibilmente solo dopo i 100 anni ma da tale fascia temporale in avanti si viene a perdere il senso fisico della variabile v(t) che inizia ad assumere valori negativi; quindi per le analisi sulle concentrazioni i valori del primo modello sono un’ottima approssimazione di quelli ottenuti dal nuovo modello migliorato.

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Conclusioni

Il modello appena studiato, benche’ riesca sia ad interpolare i dati sia a seguire gli andamenti delle distribuzioni sperimentali per entrambi i pool cellulari, non prende in considerazione alcuni contributi immunologici importanti (Timo, organi linfopoietici come il midollo Osseo), e tende a sovrastimare i valori dei cloni Memoria in fase senescente . Scopo dei prossimi modelli sara’ la verifica di come l’aggiunta di alcuni importanti elementi del SI migliori l’accordo sperimentale con le dinamiche di evoluzione,e quindi sia una ulteriore prova della consistenza delle semplici ipotesi usate nei modelli precedenti.

2.5 MODELLO INFANTILE

Premesse

Il primo termine che gli esperimenti sulla dinamica delle popolazioni di Lin- fociti T suggeriscono e’ il Contributo Timico (cap. 1.3). Il Timo e’ l’organo in cui avviene la maturazione e quindi selezione (positiva e negativa) dei linfociti T che nelle prime due decadi della vita umana immette nell’organismo linfociti T Vergini pronti a poter individuare equalsiasi antigene giunga dall’ambiente esterno. Il timo subisce un’atrofizzazione dopo le prime due decadi di attivita’ , inibendo gradualmente il rifornimento di linfociti Vergini nel SI periferico in et`a adulta. Premettiamo alla costruzione del modello alcune considerazioni essenziali sulle caratteristiche del SI in et`a infantile:

1-Il processo di memorizzazione e’ in fase iniziale e in forte attivita’ data la ingente quantita’ di antigeni che un SI giovanissimo incontra