Materiali e metodi
Tecniche di biologia molecolare
Tutte le tecniche di base di manipolazione degli acidi nucleici (ad es. sub-clonaggio di cDNA in vettori di espressione, trascrizione in vitro, PCR) sono state applicate come descritto nel classico manuale di laboratorio Molecular Cloning di Sambrook et al. (1989). Analogamente, metodi di routine co-me la puri cazione di acidi nucleici con colonne cromatogra che per a nità, sono stati eettuati come descritto nei manuali delle ditte fornitrici dei kits.
Costrutti
Vettori di clonaggio
pLT.31-Lin28. (Moss e Tang, 2003). Vettore composto dal cDNA di Xlin-28A (numero di accesso: AF521098) clonato in pBluescript. Per la sintesi in vitro delle sonde antisenso per ibridazione in situ, il vettore è stato linearizzato con l'enzima di restrizione SmaI e la trascrizione è stata condotta con l'RNA polimerasi batterica T3.
Clone I.M.A.G.E. ID 5570327/IRAK 97-A21. Questo clone (numero di accesso: BQ733913.1) contiene una sequenza EST di 882 bp iden-tica al 96% alla sequenza di cDNA di Xlin-28B (numero di accesso: BC042225). Il cDNA è inserito nei siti SalI e NotI del vettore pCMV-pSPORT6. Per la sintesi in vitro delle sonde antisenso per ibridazione in situ, il vettore è stato linearizzato con l'enzima di restrizione SalI e la trascrizione è stata condotta con l'RNA polimerasi batterica T7. pNPG152 (Nrp-1). (Richter et al., 1990). Vettore composto dal cDNA
di Nrp-1 (numero di accesso: M34894-5) clonato in pBluescript. Per la sintesi in vitro delle sonde antisenso per ibridazione in situ, il vettore è stato linearizzato con l'enzima di restrizione NotI e la trascrizione è stata condotta con l'RNA polimerasi batterica T3.
pXCAT2. (Mosquera et al., 1993) Vettore composto dal cDNA di Xcat2 (numero di accesso: X72340) clonato in pSPORT1. Per la sin-tesi in vitro delle sonde antisenso per ibridazione in situ, il vettore è
stato linearizzato con l'enzima di restrizione EcoRI e la trascrizione è stata condotta con l'RNA polimerasi batterica SP6.
Xpumilio (Nakahata et al., 2001) Vettore composto dal cDNA di Xpumilio (numero di accesso: AB091091) clonato in pBluescriptSK(-). Per la sintesi in vitro delle sonde antisenso per ibridazione in situ, il vet-tore è stato linearizzato con l'enzima di restrizione SalI e la trascrizione è stata condotta con l'RNA polimerasi batterica T3.
Vettori di espressione
Tutti i vettori di espressione utilizzati negli esperimenti di lipofezione in Xenopus sono basati sul vettore pCS2+. Questo ha un polilinker per il clo-naggio compreso tra il promotore del citomegalovirus (CMV) e il segnale di poliadenilazione del virus SV40. Il subclonaggio di una sequenza codi can-te in questa posizione permetcodi can-te l'espressione del gene desiderato in cellule eucariotiche trasfettate.
pCS2-eGFP Vettore di espressione per la eGFP, utilizzato negli espe-rimenti di lipofezione. Contiene la sequenza codi cante per la eGFP a valle del promotore CMV. Utilizzato negli esperimenti di lipofezione da solo, come controllo, e in co-trasfezione con altri costrutti per marcare le cellule lipofettate.
XLin-28Acod-pCS2 (Fig.10) Vettore di espressione per XLin-28A, uti-lizzato negli esperimenti di lipofezione. Il costrutto è stato ottenuto tramite subclonaggio della sequenza codi cante di XLin-28A (escissa dal vettore pLT.31-Lin28 con gli enzimi SmaI e SspI) nel sito StuI del vettore di espressione pCS2+.
Nrp-1cod-pCS2 (Fig.11) Vettore di espressione per Nrp-1, utilizzato negli esperimenti di lipofezione. Il costrutto è stato ottenuto tramite subclonaggio della sequenza codi cante di Nrp-1 nel sito StuI del vetto-re di espvetto-ressione pCS2+ (l'inserto è stato escisso dal vettovetto-re pNPG152 (Nrp-1) con gli enzimi BamHI e DraIII e convertito ad estremità piatte con la T4 DNA Polimerasi).
Figura 10: Xlin-28Acod-pCS2.
Metodi bioinformatici
Per l'analisi delle sequenze di DNA è stato utilizzato il software pDRAW32.
Le sequenze sono state scaricate dal database online Genbank, presso il sito web dell'NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
Per l'allineamento di sequenze nucleotidiche e amminoacidiche è stato uti-lizzato l'algoritmo di multiallineamento Clustal W, disponibile presso il sito dell'EBI: http://www.ebi.ac.uk/clustalw/index.html.
La ricerca di motivi regolatori in sequenze 3'UTR è stata condotta utiliz-zando il server RegRNA: http://regrna.mbc.nctu.edu.tw. Per la predi-zione del folding di sequenze di RNA è stato utilizzato il programma MFold: http://frontend.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/cgi-bin/ rna-form1.cgi.
Embrioni di Xenopus laevis
Fecondazione in vitro
Gli embrioni e gli esemplari adulti di Xenopus vengono mantenuti se-guendo le procedure descritte nel classico manuale di Nieuwkoop e Faber (1967).
Gli embrioni da utilizzare per gli esperimenti sono stati ottenuti tramite fecondazione in vitro. A tale scopo, gli spermi vengono ottenuti da un omo-genato di testicolo, mentre le uova vengono raccolte da femmine precedente-mente stimolate con ormoni.
In breve, il maschio di Xenopus viene anestetizzato per immersione in una soluzione allo 0,1% di MS-222, e poi operato per la rimozione del testicolo. Il testicolo viene conservato a 4 in soluzione MMR 1X con gentamicina (20 µg/ml; per le soluzioni si veda la tabella Soluzioni alla ne del paragrafo). Le femmine invece vengono stimolate con 800/1000 UI di Gonasi (gonado-tropina corionica umana) 12-15 ore prima della fecondazione; ciò stimola la maturazione degli oociti e la loro deposizione.
pia-stre Petri; si facilita la deposizione esercitando una leggera compressione sull'addome degli animali. Una parte del testicolo viene omogenizzata con un pestello e quindi distribuita sulle uova. Se la fecondazione è avvenuta correttamente, dopo circa un'ora si può osservare il fenomeno della rotazio-ne corticale. A questo punto si procede con la rimoziorotazio-ne del rivestimento gelatinoso che avvolge gli embrioni; viene utilizzata una soluzione degeli -cante contenente DTT (vedi tabella Soluzioni), che viene applicata per circa 5 minuti ( no a quando non si osserva la perdita del gel). Gli embrioni ven-gono in ne lavati in MMR 0.1X e poi mantenuti nello stesso mezzo no al momento dell'utilizzo.
Gli stadi embrionali vengono identi cati in accordo alle tavole pubblicate in Nieuwkoop e Faber (1967). Soluzioni ∗ MMR 10X NaCl 0,1 M KCl 2 mM MgSO4 1 mM CaCl2 2 mM HEPES pH 7,8 5 mM EDTA 0,2 M
Acqua deionizzata a volume ∗ Soluzione degeli cante
Tris-HCl pH 8,8 0,2 M
DTT 3,2 mM
Fissazione e disidratazione
Gli embrioni da analizzare allo stadio desiderato sono sottoposti a ssa-zione. Questo trattamento evita il deterioramento dei tessuti e preserva la struttura delle cellule e delle macromolecole che le compongono.
Gli embrioni da sottoporre ad ibridazione in situ whole mount vengono raccolti in vials di vetro da 4 ml e ssati in mezzo MEMFA (vedi tabella Soluzioni) per 1 ora e 15 minuti circa a temperatura ambiente in agitazione. Al termine della ssazione, il mezzo viene sostituito con etanolo al 100% e le vials possono essere conservate a -20 no al momento dell'utilizzo.
Per quanto riguarda gli embrioni da sottoporre ad analisi istologica, la ssazione è stata eettuata con una soluzione di paraformaldeide (PFA) al 4% in PBS 1X, preparata di fresco da uno stock di paraformaldeide al 20%. Gli embrioni vengono posti in apposite vials con circa 5-10 ml di questa so-luzione e lasciati 1-1 1/2 ora a temperatura ambiente in leggera agitazione, oppure tutta la notte a 4.
Gli embrioni così ssati vengono sottoposti a disidratazione. Questo impe-disce che nella successiva fase di congelamento si formino microcristalli di ghiaccio in grado di lesionare il tessuto. La soluzione crioprotettiva è costi-tuita da saccarosio al 30% P/V in PBS 1X; gli embrioni vengono incubati con 5-10 ml di questa soluzione per circa 3 ore a temperatura ambiente in leggera agitazione oppure tutta la notte a 4.
Soluzioni ∗ PBS 1X (1 lt.) NaCl 8 g KCl 0,2 g Na2PO4·16H2O 1,44 g KH2PO4 0,24 g pH 7,4 ∗ MEMFA MOPS 0,1 M pH 7.4 EGTA 2 mM MgSO4 1 mM Formaldeide 4%
∗ Paraformaldeide (PFA) al 20%
A 400 ml di H2O milliQ alla temperatura di 50 vengono aggiunti
100 µl di NaOH 10 N e lentamente 100 gr di paraformaldeide. La soluzione viene mescolata per 30-60 minuti, nché non si chiari ca. Essa viene poi ltrata con carta 3MM e portata al volume di 500 ml con H2O milliQ. Viene in ne conservata in aliquote da 50 ml a -20.
Preparazione di sezioni istologiche
Gli embrioni ssati in PFA e disidratati in saccarosio vengono utilizzati per preparare sezioni istologiche da sottoporre ad ibridazione in situ o ad immunoistochimica.
Dopo la disidratazione gli embrioni sono disposti in una apposita vaschet-ta per inclusione, privati del saccarosio residuo e ricoperti con resine per crioinclusione OCT o Tissue-Tek, a base acquosa, liquide a temperatura ambiente e a basso punto di congelamento. Gli embrioni inclusi vengono congelati in un bagno di etanolo a -80 per circa 15 minuti e poi conservati a -80 no al momento del taglio delle sezioni al criostato.
I blocchetti ottenuti sono stati tagliati con un criostato Leica C1850 in modo da ottenere sezioni dallo spessore di 12 µm. Le sezioni sono state raccolte su vetrini SuperFrost e asciugate all'aria per circa un'ora. Se non utilizzati subito, i vetrini così preparati vengono conservati a -80.
Tecniche di rivelazione dell'RNA messaggero
Sintesi di sonde a RNA
Per gli esperimenti di ibridazione in situ sono state utilizzate sonde ad RNA antisenso, in grado di appaiarsi all'mRNA del gene di interesse. Tutte le sonde impiegate sono state sintetizzate in vitro utilizzando nucleo-tidi marcati con digossigenina (DIG-11-UTP, Dig Labelling Mix, Roche). Il DNA stampo viene preparato linearizzando il plasmide di interesse con un enzima che lasci un'estremità 5'-protruding a monte del cDNA. Quindi
il DNA linearizzato viene puri cato (Qiagen PCR Clean-Up kit) e incubato con i nucleotidi e una RNA polimerasi adatta alla trascrizione dell'antisenso (T7, T3 o SP6). La reazione viene assemblata come segue e incubata per 2 ore a 37:
DNA stampo 1 µg
Miscela di nucleotidi con DIG-11-UTP 2.5 mM 2 µl
Tampone di trascrizione 5X 4 µl
Inibitore delle RNAsi (20 UE/µl) 1 µl
RNA polimerasi 2 µl
Acqua milliQ no a 20 µl
La sintesi è seguita da incubazione con 1 µl di DNAsi per 15 minuti e da precipitazione alcolica. Per precipitare la sonda, si aggiungono 2 µl LiCl 5M e 75 µl di etanolo 100% e si immerge il tutto in un bagnetto di etanolo a -80 per almeno 15 minuti. Quindi, si centrifuga a 4 a 12·600
RPM per 15 minuti e si rimuove il sovranatante. Il pellet viene risospeso in acqua milliQ. Per la quanti cazione si procede o tramite elettroforesi con tRNA a concentrazione nota o con lo spettrofotometro. La sonda viene eventualmente diluita nella Miscela di ibridazione no ad una concentrazione di 50-100 ng/µl, e conservata a -20 . Soluzioni ∗ Miscela di ibridazione Formammide 50% NaCl 5M 0.75M PE 10X (100mM PIPES pH 6.8; 1mM EDTA) 1X tRNA 10mg/ml 100 µg/ml Eparina al 5% 0.05% SDS 20% 1%
Ibridazione in situ su sezioni
L'ibridazione in situ su sezioni istologiche permette di osservare il pat-tern di espressione del gene di interesse a livello delle speci che popolazioni cellulari che compongono il tessuto analizzato.
Le sezioni istologiche della retina di Xenopus in sviluppo sono state preparate come precedentemente descritto. Le sezioni tagliate al criostato e asciugate all'aria possono essere utilizzate subito o conservate a -80. In quest'ulti-mo caso, le sezioni devono essere opportunamente scongelate prima di essere impiegate per l'ibridazione su sezione.
Le sezioni possono essere direttamente incubate con la sonda a RNA diluita nel Tampone di ibridazione (vedi tabella Soluzioni). La sonda viene generalmente diluita alla concentrazione di 1 ng/µl e denaturata a 70 per 5-10 minuti. Ogni vetrino viene coperto con 150 µl di questa miscela e poi coperto con un vetrino coprioggetto. I vetrini vengono collocati in una camera umida contenente carta assorbente Whatman 3mm imbevuta con una soluzione di Sali di Ibridazione 1X (vedi Soluzioni) e Formammide al 50%, quindi incubati per una notte a 65.
Per gli esperimenti di ibridazione in situ su sezioni con le sonde di Xlin-28A e Xlin-28B è stato utilizzato un particolare protocollo di prepara-zione delle sezioni, sviluppato a partire da Polak e O'Donnell McGee (1998) e Polesskaya (2006). Questo protocollo facilita la penetrazione della sonda nel tessuto, e smaschera mRNA complessati ad altre macromolecole. In breve, le sezioni sono reidratate e lavate in una soluzione di PBS e Triton X-100 0,1% (due lavaggi da 5 minuti). Segue un trattamento con la Proteinasi K: i vetrini vengono incubati per un minuto esatto con 1 ml di Proteinasi K 10 µg/ml in PBS, e poi immersi in una soluzione di PBS e Glicina 0,1 M per almeno 5 minuti (per inibire la proteasi). Questo passaggio è seguito da un trattamento di post- ssazione con paraformaldeide al 4% (1 ml per vetrino) per 15 minuti. Dopo la post- ssazione i vetrini vengono sciacquati breve-mente prima in PBS e poi in H2O (purezza milliQ), per eliminare tutti i sali
residui. Quindi le sezioni vengono asciugate a 37 (sono necessari almeno 30 minuti). I vetrini asciutti vengono sottoposti a pre-incubazione a 65 con la Miscela di Ibridazione per almeno 30 minuti (0,8-1 ml per vetrino). Dopo
la pre-incubazione la Miscela di Ibridazione viene sostituita con la Miscela contenente la sonda denaturata, e i vetrini vengono incubati per una notte a 65 come consueto.
Dopo l'incubazione con la sonda, i vetrini coprioggetto vengono rimossi e le sezioni vengono sottoposte a tre lavaggi da 30 minuti nella Soluzione di Lavaggio (vedi Soluzioni) a 65. Seguono due lavaggi da 30 minuti in MABT (vedi Soluzioni) eettuati a temperatura ambiente.
Prima dell'incubazione con l'anticorpo anti-DIG, si eettua un passaggio di bloccaggio incubando i vetrini per 1 ora a temperatura ambiente con 1 ml della Soluzione di Bloccaggio (vedi Soluzioni). Quindi si rimuove la soluzione di bloccaggio e si aggiunge l'anticorpo anti-DIG coniugato alla fosfatasi alcalina (Roche), diluito nella stessa soluzione (concentrazione nale 300 mU/ml, 150-200 µl per vetrino). I vetrini, coperti con un coprioggetto e collocati in camera umida, sono incubati per una notte a temperatura ambiente.
I lavaggi post-anticorpo (5 in tutto) vengono eettuati a temperatura am-biente in MABT per 30 minuti ciascuno. Questi sono seguiti da due lavaggi da 10 minuti in un Tampone ottimale per l'attività della fosfatasi alcalina (APB, vedi Soluzioni). Per la rivelazione è stato utilizzato il substrato della fosfatasi alcalina Fast Red (Roche), che produce un segnale di ibridazione uorescente paragonabile a quello dei uorocromi rodamina o Cy3.
Quando il livello di segnale è soddisfacente, la rivelazione viene bloccata im-mergendo i vetrini in PBS 1X. Per facilitare il riconoscimento delle singole cellule, i nuclei possono essere colorati con il uoroforo Hoechst 33342 (usato alla concentrazione nale di 1 ng/µl). Quindi i vetrini vengono lavati in PBS 1X, montati con Aqua Polymount (Polysciences Inc.) e conservati a 4.
Soluzioni ∗ Sali di Ibridazione 10X (1 lt.) NaCl 114 g Tris HCl 14,04 g Tris Base 1,34 g NaH2PO4·2H2O 7,8 g NaH2PO4 7,1 g 0,5M EDTA 10 ml
∗ Soluzione di Lavaggio (washing solution)
SSC 1X Formammide 50% Tween-20 0,1% ∗ SSC 20X NaCl 3 M Na citrato 0,3 M ∗ MABT Acido maleico 100 mM NaCl 150 mM Tween-20 0,1%
∗ Soluzione di Bloccaggio (Blocking solution) Blocking Reagent (Boehringer) 2%
Siero di capra 20%
∗ Tampone per la fosfatasi alcalina - APB NaCl 0,1 M MgCl2 0,05M Tris/HCl pH 9,5 0,1 M Tween-20 0,1% Levamisole (Sigma) 0,5 mg/ml
Ibridazione in situ whole mount
L'ibridazione in situ su embrioni interi permette di studiare il pattern di espressione dei geni durante lo sviluppo embrionale di Xenopus mediante l'ibridazione delle sonde, marcate con DIG-11-UTP, agli mRNA presenti nei tessuti.
Ibridazione.
Per l'ibridazione in situ whole mount si utilizzano embrioni ssati in mezzo MEMFA e disidratati in etanolo (come precedentemente descritto). Il pro-tocollo di ibridazione prevede all'inizio una serie di passaggi di reidratazione con brevi lavaggi in soluzioni contenenti quantità di etanolo decrescenti, PBS e Triton X-100 (PBTw, vedi tabella Soluzioni):
- etanolo 75%, PBTw 25% - etanolo 50%, PBTw 50% - etanolo 25%, PBTw 75%
Vengono poi eettuati 2 lavaggi da 5 minuti in PBTw 100%.
Quindi gli embrioni vengono incubati per 5 minuti esatti a RT in 1ml di PBTw-Proteinasi K (10 µg/ml). Questo passaggio deve essere ben controlla-to: la Proteinasi K permeabilizza gli embrioni e facilita la penetrazione della sonda, ma se utilizzata troppo a lungo danneggia i tessuti.
L'incubazione con la Proteinasi K è seguita da un passaggio di post- ssazione in paraformaldeide 4% in PBS a temperatura ambiente per 20 minuti esatti e da una serie di lavaggi in PBTw (4 lavaggi da 5 minuti).
Quindi gli embrioni vengono equilibrati nella miscela di ibridazione NIH (vedi Soluzioni) e incubati con la stessa per 2-3 ore a 60. Questo passag-gio, detto pre-ibridazione, serve a saturare i possibili siti di legame aspeci ci
della sonda.
La sonda ad RNA viene diluita in H2O (qualità milliQ, 50 ng di sonda in 10
µl), denaturata a 95 per 2 minuti, posta in ghiaccio per altri 2 minuti e in ne diluita in 600 µl di NIH. Gli embrioni vengono incubati con la miscela contenente la sonda per 12-16 ore a 60.
L'incubazione degli embrioni con la sonda è seguita da una serie di lavaggi volti ad eliminare la sonda legata aspeci camente. Per i lavaggi si usano soluzioni a forza ionica decrescente, contenenti SSC e il detergente CHAPS (Sigma). I primi lavaggi vengono eettuati in 2X SSC/0,1X CHAPS a 37 (2 lavaggi da 30 minuti); seguono lavaggi in 0,2X SSC/0,1X CHAPS a 60 (2 lavaggi da 30 minuti).
A questo punto gli embrioni devono essere incubati con l'anticorpo anti-DIG in grado di legarsi alla sonda marcata. L'incubazione con l'anticorpo è pre-ceduta da un passaggio di pre-incubazione con la Soluzione di bloccaggio (vedi Soluzioni) senza l'anticorpo (2 ore a 4), per saturare i siti di lega-me aspeci ci. Segue l'incubazione con l'anticorpo anti-DIG coniugato con la fosfatasi alcalina (Roche), diluito nella Soluzione di Bloccaggio alla concen-trazione nale di 300 mU/ml (1ml per vial). L'incubazione con l'anticorpo può essere condotta a temperatura ambiente per 4 ore o a 4 per una notte. Per rimuovere l'eccesso di anticorpo si procede con ulteriori 5 lavaggi in TB-SX (vedi tabella) a temperatura ambiente di 1 ora ciascuno. Seguono quindi 2 lavaggi da 10 minuti a temperatura ambiente nel Tampone per la fosfatasi alcalina (AP buer, vedi Soluzioni) contenente Levamisole o Tetramisole, inibitore delle fosfatasi alcaline endogene (Sigma).
A questo punto si aggiungono 500 µl di BM-purple (Roche), un substrato cromogenico della fosfatasi alcalina. Questa sostanza conferisce una colo-razione blu intenso alle cellule contenenti la fosfatasi alcalina e che quindi esprimono il gene di interesse. La reazione colorimetrica viene protratta per un tempo variabile (da 1 ora a qualche giorno), no al raggiungimento di un segnale soddisfacente. Una volta che la reazione cromogenica è terminata si rimuove il tampone per la fosfatasi alcalina e si ssano gli embrioni per almeno 1 ora con MEMFA per stabilizzare la colorazione. Gli embrioni così ssati possono essere conservati in etanolo a -20.
Depigmentazione.
permette di evidenziare il segnale proveniente dalla reazione colorimetrica. Per questo scopo è necessario lavare gli embrioni per alcuni minuti con eta-nolo 100%, segue un lavaggio di 5 minuti con etaeta-nolo 70% e in ne si lava con una soluzione composta al 50% di etanolo e al 50% di SSC 1X.
Si passano quindi gli embrioni nella Soluzione depigmentante (vedi Soluzio-ni), lasciando i tubi sotto una lampada a luce bianca per circa 30 min-2 ore. A questo punto gli embrioni vengono lavati per 5 minuti con etanolo 70% e poi conservati in etanolo assoluto a -20.
Soluzioni ∗ PBTw Tween-20 0,1% PBS a volume ∗ NIH Formammide 50% SSC 5X RNA di Torula 1 mg/ml Eparina 100 µg/ml Denhart's 1X Tween-20 0,1% CHAPS 0,1% EDTA 10 mM ∗ TBS NaCl 80 mg/ml KCl 2 mg/ml Tris base 30 mg/ml pH = 8 ∗ TBSX TBS 1x Triton X-100 0,1%
∗ Estratto proteico totale di uova
Per questa preparazione vengono omogenizzati embrioni/uova conser-vati a -20 in 1 volume di PBS 1X. Si procede con una centrifugazione di 10 minuti a 4 a 12·000 rpm, e con il recupero della fase acquosa
che viene sottoposta altre 5 volte alla stessa procedura. Si denatura a 56 per 15 minuti la soluzione ottenuta e si centrifuga a 12·000 rpm
per 10 minuti a 4, viene aliquotata e conservata a -20. ∗ Soluzione di bloccaggio (Blocking buer)
Siero di capra 12,5%
Estratto proteico totale di uova 4,2%
Blocking reagent (Roche) 5,8%
TBSX a volume
∗ Tampone per la fosfatasi alcalina - APB
NaCl 0,1 M MgCl2 0,05M Tris/HCl pH 9,5 0,1 M Tween-20 0,1% Levamisole 0,5 mg/ml ∗ Soluzione depigmentante H2O2 1% SSC 0,5x Formammide 5%
Lipofezione di vescicole ottiche di Xenopus laevis
La tecnica della lipofezione consente di trasfettare con un cDNA di in-teresse singoli progenitori retinici in vescicole ottiche in sviluppo. Questo permette lo studio degli eetti funzionali cellulo-autonomi sui cloni di cel-lule retiniche generati dai progenitori lipofettati. Infatti con questa tecnica è possibile studiare l'eetto del guadagno o della perdita di funzione di un gene di interesse nella progenie di singoli progenitori trasfettati all'interno di retine normali (Holt et al., 1990; Ohnuma et al., 2002b).
La miscela da lipofettare è costituita dal cDNA di interesse subclonato in un apposito vettore di espressione (in genere, il vettore pCS2+) e dal cDNA co-di cante per la proteina uorescente GFP, in un rapporto di concentrazioni di circa 3:1. Alla miscela di DNA viene aggiunto il reagente liposomiale DO-TAP (N-[1-(2,3-diolielossi)propil]-N,N,N-trimetilammonio metilsolfato, Ro-che) nella proporzione di 3 µl per ogni µg di DNA. Il DOTAP è costituito da lipidi an patici che formano micelle contenenti il DNA. In ne viene aggiunto 1/10 del volume nale del colorante vitale Fast Green (soluzione acquosa in PBS 1X sterile, 0.25% P/V stock 10X), usato come tracciante.
Per le lipofezioni sono stati utilizzati dei microiniettori Drummond Nanoject (Drummond Scienti c Company, Philadelphia). Gli aghi per le lipofezioni sono stati preparati tramite tiratura a caldo di capillari in vetro (Drummond) con un apparecchio puller da elettro siologia (Sutter Instruments Co.; para-metri: heat 95, pull 50). Gli aghi così tirati sono stati spuntati con un paio di pinze Dumont biologie n.5, riempiti con olio minerale con una siringa da insulina e montati sul microiniettore. La punta viene spezzata sotto allo stereoscopio in modo che abbia uno spessore di circa 20 micrometri. L'ago viene caricato con circa 4-6 µl della miscela da iniettare tramite aspirazione con il microiniettore stesso.
Gli embrioni da lipofettare vengono mantenuti in MMR 0,1X e sistemati in una piastra Petri con una griglia sul fondo, necessaria a mantenere fermi gli embrioni durante la lipofezione. Il microiniettore è dotato di un micro-manipolatore che permette lo spostamento micrometrico dell'ago nelle tre dimensioni. L'ago viene in questo modo inserito in corrispondenza di una delle vescicole ottiche, in posizione abbastanza super ciale. Posizionato l'a-go, viene iniettato un volume compreso tra 30 e 100 nl. Se la lipofezione ha
successo, si osserva un leggero rigon amento dell'epitelio di rivestimento. Per tutte le lipofezioni sono stati impiegati embrioni allo stadio 17-18. Gli embrioni lipofettati sono stati mantenuti in MMR 0,1X no al momento della ssazione.
Iniezione della BrdU in embrioni lipofettati
La Bromodeossiuridina (BrdU) è un analogo della timidina che permette la marcatura delle cellule nella fase S del ciclo cellulare. L'iniezione di BrdU in embrioni ad un certo stadio di sviluppo permette l'identi cazione a po-steriori delle cellule che erano in divisione in quella fase di sviluppo.
Per l'iniezione della BrdU gli embrioni vengono anestetizzati in MS-222 allo 0,1% peso/volume in tampone MMR 0,1X. Viene preparato un ago da mi-croiniezione con una punta grossa, montato sul microiniettore e caricato con una miscela di BrdU 15mg/ml (Sigma) e tracciante Fast Green 10X come per la lipofezione. Negli esperimenti descritti in questa tesi, le iniezioni sono state eettuate nell'addome di embrioni a stadio 33/34 o a stadio 37/38 con 100 nl circa di BrdU. Gli embrioni iniettati vengono velocemente trasferiti in mezzo MMR 0,1X per permetterne il risveglio, e poi mantenuti nello stesso mezzo no al momento della ssazione.
Immunoistochimica
Gli esperimenti di immunoistochimica descritti in questa tesi sono stati condotti su sezioni di retine lipofettate per rivelare un marcatore speci co di un certo tipo cellulare (immunoistochimica semplice) o per individuare le cellule incorporanti BrdU negli embrioni iniettati con questo marcatore della proliferazione (doppia immunoistochimica).
Immunoistochimica semplice.
Prima dell'incubazione con l'anticorpo primario, le sezioni sono state sot-toposte a tre lavaggi di circa 5-10 minuti in PBS 1X, al ne di rimuovere l'eccesso di resina da inclusione.
conte-nente albumina di siero bovino (BSA) e un detergente lipidico (Triton X-100, vedi Soluzioni). Il bloccaggio satura i siti di legame aspeci co dell'anticorpo e aumenta la permeabilità delle cellule. I vetrini vengono coperti con 125-150 µl di questa soluzione contenente l'anticorpo nell'opportuna diluizione e poi con un vetrino coprioggetto. L'anticorpo primario è stato incubato per 1 ora a 37, per 3 ore a temperatura ambiente o tutta la notte a 4, a seconda dell'anticorpo.
Dopo l'incubazione con l'anticorpo primario, i vetrini coprioggetto vengono rimossi e le sezioni sottoposte a tre lavaggi di circa 10-15 minuti in PBS 1X, per rimuovere l'anticorpo legato aspeci camente.
La rivelazione è stata condotta utilizzando anticorpi secondari coniugati con uorocromi (descritti nel paragrafo Anticorpi).
L'anticorpo secondario prescelto viene opportunamente diluito nella Soluzio-ne di bloccaggio. Alla stessa soluzioSoluzio-ne vieSoluzio-ne aggiunto il uorocromo Hoechst 33342 (concentrazione nale 10 µg/ml) per la colorazione dei nuclei cellulari in uorescenza. I vetrini, collocati in una camera umida, vengono ricoperti con 125-150 µl della soluzione di anticorpo e poi con un vetrino coprioggetto. L'anticorpo secondario è stato incubato per un'ora a 37. Dopo l'incubazio-ne, i vetrini coprioggetto vengono rimossi e le sezioni sottoposte a tre lavaggi di circa 10-15 minuti in PBS 1X, per rimuovere l'anticorpo legato aspeci -camente. I vetrini vengono alla ne montati con il montante acquoso Aqua Polymount.
Rivelazione della BrdU.
Gli embrioni lipofettati e poi iniettati con la BrdU vengono ssati e inclu-si come descritto per la preparazione delle sezioni istologiche. Le sezioni tagliate al criostato vengono lavate in PBS 1X. La rivelazione della BrdU richiede un passaggio di smascheramento dell'antigene, eettuato trattan-do le sezioni con HCl 2N per 20 minuti. Questo trattamento deproteinizza la cromatina e quindi rende accessibile all'anticorpo primario la BrdU in-corporata nel DNA. Le sezioni vengono quindi estesamente lavate in PBS 1X (5 lavaggi da 10-15 minuti) e sottoposte ad incubazione con l'anticorpo primario con il procedimento già descritto. In questo caso si utilizza una miscela di anticorpi, costituita dall'anticorpo monoclonale anti-BrdU e da un anticorpo policlonale anti-GFP, quest'ultimo per rivelare le cellule lipo-fettate. Dopo l'incubazione con la miscela di anticorpi primari (un'ora a
37) e i lavaggi con PBS 1X, i vetrini vengono incubati con una miscela di anticorpi secondari. Questa è costituita dall'anticorpo anti IgG di topo (per il primario anti-BrdU) e dall'anticorpo anti-IgG di coniglio (per il primario anti GFP), coniugati rispettivamente ai uorofori rodammina (rosso) e Ore-gon Green (verde). Nella miscela di anticorpi secondari non viene incluso l'Hoechst, poiché l'aggiunta di questo uoroforo causerebbe il quenching del segnale della BrdU. Dopo l'incubazione con gli anticorpi secondari (un'ora a 37) e i lavaggi in PBS 1X, i vetrini vengono incubati per 5 minuti circa con Hoechst 33342 diluito in PBS 1X (1 ml per vetrino). Seguono alcuni lavaggi in PBS 1X e il montaggio dei vetrini con Aqua Polymount.
Anticorpi utilizzati
Segue l'elenco degli anticorpi utilizzati negli esperimenti di immunoisto-chimica e le condizioni di utilizzo.
Anticorpi primari
Anti-GFP. Anticorpo policlonale sviluppato in coniglio (Molecular Probes, Invitrogen, A11122). Utilizzato alla diluizione 1:1000.
Anti-BrdU. Anticorpo monoclonale (Sigma-Aldrich, B2531). Utilizza-to alla diluizione 1:500.
Anti-Gln sintetasi. Anticorpo monoclonale (BD Biosciences, 610517). Utilizzato alla diluizione 1:500.
Anti-XOtx2. (Decembrini et al., 2006). Anticorpo policlonale sviluppato in coniglio (PRIMM SRL). Utilizzato alla diluizione 1:200. Anti-rodopsina. Anticorpo monoclonale (Sigma-Aldrich, O4886).
Utilizzato alla diluizione 1:1000.
Anticorpi secondari
Goat anti-rabbit (GAR) verde: Anti-rabbit IgG. Anticorpo policlonale sviluppato in capra (Molecular Probes, Invitrogen, O-6381), coniugato
con il uoroforo Oregon Green 488 (assorbimento a 496 nm, emissione a 524 nm). Utilizzato alla diluizione 1:1000.
Goat anti-rabbit (GAR) rosso: anti-rabbit IgG. Anticorpo policlonale sviluppato in capra (Molecular Probes, Invitrogen, R-6394), coniuga-to con il uoroforo Rhodamine RedTM-X (assorbimento a 570 nm,
emissione a 590 nm). Utilizzato alla diluizione 1:1000.
Goat anti-mouse (GAM) verde: anti-mouse IgG. Anticorpo policlonale sviluppato in capra (Molecular Probes, Invitrogen, O-6380), coniugato con il uoroforo Oregon Green 488 (assorbimento a 496 nm, emissione a 524 nm). Utilizzato alla diluizione 1:1000.
Goat anti-mouse (GAM) rosso: anti-mouse IgG. Anticorpo policlonale sviluppato in capra (Molecular Probes, Invitrogen, R-6393), coniuga-to con il uoroforo Rhodamine RedTM-X (assorbimento a 570 nm,
emissione a 590 nm). Utilizzato alla diluizione 1:1000.
Soluzioni
∗ Soluzione di bloccaggio (Blocking buer) per immunoistochimica
Triton X-100 0,1%
Albumina di siero bovino 0,5% PBS 1X a volume
Trattamento statistico dei dati
I risultati riportati in questa tesi derivano da almeno due esperimenti indipendenti, condotti ciascuno su un numero minimo di sei embrioni.
Per ciascun costrutto, o combinazione di costrutti lipotrasfettati, la per-centuale di ciascun tipo cellulare rispetto al numero totale di cellule contate è stata calcolata su campioni di circa 100 cellule, provenienti dall'analisi di una o più retine lipofettate.
Per il trattamento dei dati e la costruzione dei gra ci è stato utilizzato il software Microsoft Excel 2003. Il valore n, riportato nelle gure dei ri-sultati, rappresenta il numero totale di cellule contate per ciascun costrut-to/combinazione di costrutti lipofettati. La percentuale media è stata calco-lata su un numero minimo di tre campioni. Per ciascun valore percentuale medio sono stati calcolati deviazione standard ed errore standard della media (SEM). Il valore SEM è stato utilizzato per costruire le barre di con denza di tutti gli istogrammi mostrati.
Per valutare la signi catività delle dierenze tra due medie percentuali è stato eettuato il test statistico t di Student a due code, considerando i due campioni indipendenti e le varianze omogenee.
Negli esperimenti di incorporazione di BrdU è stata calcolata la percen-tuale di cellule (totali o di un certo tipo cellulare) lipofettate e con nuclei BrdU-positivi, rispetto al numero totale di cellule lipofettate. L'analisi sta-tistica delle dierenze percentuali è stata condotta poi come descritto sopra per i tipi cellulari.
Fotogra e
I pannelli delle gure mostrate sono stati costruiti utilizzando il programma Adobe Photoshop CS2.
Le fotogra e degli embrioni interi sono state realizzate mediante una fo-tocamera digitale CoolSnap CF montata in asse focale ad uno stereoscopio Nikon SNZ 1500 con l'ausilio di una coppia di bre ottiche Glli/136P.
I preparati istologici sono stati analizzati utilizzando un microscopio Ni-kon Eclipse 600, dotato di obiettivi 4X, 10X, 20X e 40X. Le osservazioni in uorescenza sono state eettuate utilizzando blocchi ottici con spettri di eccitazione/emissione standard per i tre tipi di uorocromo maggiormente in uso: rodamina (luce in emissione rossa), uoresceina (luce in emissione verde; questo è stato utilizzato anche per la rivelazione di GFP) e DAPI (lu-ce in emissione blu). Le immagini sono state acquisite con una fotocamera
digitale Photometrix, modello CoolSnap, dotata di sensore CCD a colori con dinamica di 12 bit per canale e risoluzione 1,3 Mpixels.
