5. DISCUSSIONE
Negli ultimi decenni sono stati fatti molti progressi in merito alla comprensione del ruolo svolto da diversi segnali esogeni alla cellula, quali ad esempio i fattori di crescita, nella regolazione della produzione delle cellule del sangue, mentre non sono ancora stati del tutto chiariti i meccanismi molecolari intrinseci alle cellule staminali e ai precursori ematopoietici. A questo proposito, varie osservazioni hanno messo in luce il contributo di alcune famiglie di geni codificanti fattori di trascrizione. In particolare, ricerche condotte nel nostro laboratorio sugli omeogene, hanno dimostrato l’importanza che questi regolatori dello sviluppo neurale hanno anche nella produzione delle cellule del sangue (Magli et al., 1997, Magli 1998, Levantini et al., 2003).
Seguendo l’ipotesi che meccanismi comuni possano controllare sistemi differenziativi diversi, e in particolare neurogenesi ed ematopoiesi, in questo studio abbiamo analizzato il ruolo di un altro fattore di trascrizione neurale, Sox2, nell’ambito del sistema ematopoietico. Sox2 (Sry-type high-mobility-group box 2), codifica una proteina appartenente ad una importante famiglia di fattori di trascrizione coinvolti anch’essi in diversi sistemi differenziativi e di sviluppo dei vertebrati definiti “HMG box” (high-mobility group box). E’ attivo molto precocemente durante lo sviluppo embrionale e recentemente è stata dimostrata la sua fondamentale funzione nello sviluppo e nella morfogenesi del sistema nervoso centrale (Graham et al., 2003; Catena et al., 2004). E’ espresso in diversi tipi di cellule staminali, come le embrionali, le germinali e le neurali, e ci siamo quindi chiesti se sia coinvolto anche nella regolazione delle cellule staminali e/o precursori ematopoietici.
Nostri risultati preliminari, ottenuti tramite l’analisi molecolare di cellule midollari murine wild type, hanno evidenziato che Sox2 è espresso, seppure a livelli molto bassi, anche nel midollo osseo, principale sede di produzione delle cellule del sangue nella vita adulta. In particolare, indagini più dettagliate sulle diverse popolazioni midollari sembrano indicare che il gene sia trascrizionalmente attivo a livello di precursori primitivi pluripotenti, suggerendo quindi che Sox2 contribuisca al controllo delle fasi precoci dell’ematopoiesi.
Nel mio lavoro di tesi, finalizzato a verificare questa ipotesi, ho studiato gli effetti della ridotta espressione in vivo di Sox2 sulla produzione delle cellule del sangue.
Dal momento che la completa inattivazione di Sox2 è letale, ho utilizzato 2 linee di topi mutanti, generate nel laboratorio della dottoressa Silvia Nicolis, dell’Università di Milano-Bicocca: 1) Sox2 knock down in cui l’espressione del gene è fortemente diminuita, con una riduzione stimata nel sistema nervoso centrale di circa il 70%, a seguito della delezione di una sequenza di 2.4 Kb nella regione enhancer su un allele, e della sostituzione sull’altro allele della regione codificante con il costrutto β-GEO; 2) topi transgenici Sox2 eterozigoti in cui la sequenza codificante di un allele è stata sostituita con il costrutto β-GEO, mentre l’altro allele è normale, con una riduzione di espressione nel sistema nervoso di circa il 40% .
Mentre i topi Sox2 eterozigoti sembrano essere fenotipicamente normali, i mutanti Sox2 knock down presentano una serie di anomalie a carico del sistema nervoso.
Come prima osservazione, il numero di topi Sox2 knock down alla nascita ha una frequenza ridotta rispetto a quella attesa, e diminuisce ulteriormente nei primi giorni postnatali. Presentano un ritardo della crescita, che viene comunque compensato dopo la sesta settimana di vita, e una lenta reattività. Non appena
viene raggiunta la taglia normale di un adulto, il 40% dei mutanti ritraggono gli arti verso il tronco in un modo distonico, piuttosto che estenderli come fanno i topi normali. Questo fenotipo descritto come “zampa a pinza” è stato osservato in mutanti con danni neurologici dovuti a neurodegenerazione. Il 40% dei topi Sox2 knock down è affetto da crisi epilettiche causate da attività anomale della corteccia
e dell’ippocampo, registrabili con un elettroencefalogramma (EEG). Infine, presentano il tipico comportamento circling tra la terza o quarta settimana di età e anche, a volte, successivamente, fenotipo che nei roditori è associato a neurodegenerazione dello striato. Nel cervello dei topi adulti si ha una riduzione della corteccia, del corpus callosum, un decremento del talamo anteriore, dello striato dorsale e del setto, un allargamento del terzo ventricolo. Queste diminuzioni di regioni cerebrali sembrano associate a degenerazione cellulare e anche ad una diminuzione di precursori neurali proliferanti (Ferri et al., 2004).
Nel corso del mio lavoro di tesi ho analizzato l’ematopoiesi di questi topi, confrontandola, in tutte le sue fasi, con quella dei topi wild type, cioè a livello di cellule mature del sangue, a livello di precursori ematopoietici midollari e a livello di cellule staminali.
Il primo quesito da me affrontato è stato se la diminuita espressione di Sox2 potesse provocare variazioni a livello degli elementi sanguigni e dei precursori midollari. Nessuna differenza significativa è rilevabile tra le cellule mature del sangue dei topi Sox2 knock down, Sox2 eterozigoti e wild type (Figura 4.1), mentre, al contrario, l’analisi dei progenitori midollari, ha evidenziato un aumento altamente significativo dei soli precursori CFU-Mix nei topi Sox2 knock down rispetto sia ai Sox2 eterozigoti, sia ai controlli wild type (Figura 4.8 e 4.9). Questo risultato suggerisce che Sox2 in condizioni normali non abbia un ruolo nelle fasi
terminali dell’ematopoiesi, ma possa invece agire come un regolatore della proliferazione e/o mantenimento dei precursori CFU-Mix.
Per verificare questa ipotesi ho effettuato colture secondarie di singole colonie miste. Anche in questo caso ho rilevato un aumento significativo di colonie miste secondarie nei mutanti knock down rispetto ai controlli Sox2 eterozigoti e wild type, pur non osservando variazioni significative nel numero assoluto di colonie
secondarie formate, né nella percentuale di cloni secondari eritroidi o mielomonocitari (Figura 4.10). Questi risultati avvalorano l’ipotesi che il gene Sox2 abbia un effetto sui precursori multipotenti e che la sua diminuita
espressione possa indurre un aumento del self-renewal di questi precursori, o, in alternativa, una riduzione della frazione di cellule pluripotenti normalmente destinata ad una morte programmata.
Il secondo quesito è stato se la diminuzione di espressione di Sox2 potesse provocare variazioni significative a livello delle cellule staminali ematopoietiche.
A tal proposito ho effettuato saggi di ripopolazione competitiva in vivo in animali letalmente irradiati. Ho trapiantato quattro diverse combinazioni di midollo Sox2 knock down e midollo wild type: queste combinazioni sono state stabilite al fine di
poter confrontare la capacità ripopolativa di una popolazione rispetto all’altra sia in condizioni di parità che in condizioni di un considerevole squilibrio iniziale. I risultati indicano che fra i diversi gruppi di topi trapiantati non vi sono variazioni significative nel numero assoluto di elementi maturi del sangue (Figura 4.11), o di precursori ematopoietici midollari (Figura 4.12). Pertanto il fenotipo ematopoietico dei mutanti knock down, caratterizzato da un elevato numero di progenitori pluripotenti, non sembra essere trapiantabile. Tuttavia, il risultato sorprendente è venuto dall’analisi del genotipo delle colonie generate dai topi
trapiantati, effettuata al fine di determinare il contributo di ciascun midollo donatore alla ricostituzione midollare degli animali riceventi. I dati ottenuti infatti indicano che anche nel caso in cui il midollo Sox2 knock down è stato iniettato in proporzione nettamente prevalente rispetto al competitore wild type (in rapporto di circa 3:1), la percentuale di ricostituzione da parte delle cellule mutanti (37%) è fortemente inferiore rispetto alla controparte normale (Figura 4.14). La diminuita capacità ripopolativa del midollo mutante può essere dovuta ad un diminuito numero di cellule staminali o ad una loro ridotta capacità di homing (colonizzare il midollo dei riceventi).
I risultati ottenuti forniscono quindi una forte evidenza del coinvolgimento di Sox2 nella regolazione dell’ematopoiesi, nelle sue fasi più precoci, in particolare
sulle cellule staminali ematopoietiche e sui precursori multipotenti.
Le ipotesi che si possono avanzare in merito al ruolo di Sox2 all’interno del sistema differenziativo delle cellule del sangue sono molteplici e una delle prime considerazioni riguarda la possibilità che Sox2 svolga una duplice azione, intervenendo separatamente sulle cellule staminali e sui progenitori pluripotenti, o che il gene regoli solo una delle due popolazioni, con effetti conseguenti anche sull’altra. Un esempio a favore di un’azione distinta a due diversi stadi differenziativi è dato dal sistema nervoso, dove la ridotta funzione di Sox2 determina una diminuzione di cellule staminali neurali, causata da un minore self- renewal, e una diminuzione di precursori neurali e cellule mature dovuta a
degenerazione delle stesse cellule nervose (Ferri et al., 2004). Analogamente, quindi, nel sistema ematopoietico Sox2 potrebbe intervenire nel controllo dell’autoreplicazione o dell’apoptosi sia sulle HSCs che sulle CFU-Mix, e,
utilizzando partners e targets molecolari diversi, esplicare funzioni addirittura opposte.
In alternativa, Sox2 potrebbe agire solo su un tipo di popolazione cellulare e, se il sistema viene perturbato, i suoi effetti si ripercuoterebbero su altri tipi di cellule, infatti un’altra possibilità è che la diminuzione di cellule staminali, tramite meccanismi di compensazione, determini un aumento delle attività proliferative di precursori a valle nella gerarchia ematopoietica per mantenere l’omeostasi dell’organismo.
L’alterazione della popolazione staminale dei mutanti Sox2 knock down può essere spiegata ipotizzando diversi meccanismi di azione del gene sull’attività funzionale delle HSCs.
1) Sox2 potrebbe influenzare il self-renewal delle cellule staminali ematopoietiche, in analogia alla sua azione su altri tipi di cellule staminali.
La diminuzione di espressione di Sox2 determina una forte diminuzione di cellule staminali neurali, agendo verosimilmente sulla proliferazione e mantenimento di queste cellule, e determina a livello di cellule staminali embrionali una diminuzione della loro stabilizzazione in vitro come linea cellulare.
Infatti i dati riportati in letteratura confermano che per mantenere un’elevata capacità autorigenerativa e proliferativa le cellule ES necessitano dell’espressione costitutiva di Sox2 (Avilion et al., 2003) e di Oct3/4 (Nichols et al., 1998; Niwa et al., 2000). E’ stato dimostrato che embrioni nulli per Sox2 o per Oct3/4 sono letali prima dell’impianto nella parete uterina: infatti le cellule staminali che costituiscono l’epiblasto perdono la loro capacità proliferativa ed autorinnovativa provocando la morte precoce dell’embrione. E’ stato inoltre dimostrato che cellule ES che mancano di Sox2 o Oct3/4 non possono essere stabilizzate in coltura,
quindi Sox2 in associazione con Oct3/4 è essenziale per il mantenimento di cellule embrionali pluripotenti (Avilion et al., 2003). A tal proposito, è stato osservato che nelle prime fasi dell’embriogenesi Sox2 interviene sinergicamente con Oct- 3/4 nell’attivazione trascrizionale del gene FGF-4 (Fibroblast Growth Factor-4),
che codifica un fattore indispensabile per la sopravvivenza delle cellule staminali dell’epiblasto (Ambrosetti et al., 2000).
2) Sox2 potrebbe intervenire nel commitment delle HSCs. Il gene infatti potrebbe influenzare la determinazione del destino cellulare favorendo la scelta differenziativa delle HSCs verso la linfopoiesi o la mielopoiesi. In particolare, la sua funzione potrebbe essere paragonata a quella di Pax5, il quale codifica un fattore di trascrizione che agisce sia come attivatore di geni specifici per il lineage B e, contemporaneamente, come repressore di geni specifici per il lineage T o per la differenziazione verso la mielopoiesi. In accordo con questo modello, è possibile che il fattore Sox2 regoli positivamente la differenziazione linfoide e negativamente quella mieloide. In questo caso, l’aumento dei precursori pluripotenti dovuto alla down-regolazione di questo gene potrebbe essere la conseguenza di uno squilibrio nel commitment delle HSCs. Per verificare questa ipotesi sarà necessario analizzare i precursori linfoidi tramite analisi citofluorimetria, utilizzando marcatori dei precursori linfocitari midollari e timici come CD4 e CD8.
3) Sox2 potrebbe agire sulle cellule che costituiscono il microambiente in cui le HSCs si trovano all’interno del midollo osseo. Pertanto la sua diminuita espressione in cellule stromali potrebbe causare effetti che si ripercuotono sulla differenziazione ematopoietica. Un’ipotesi plausibile di effetto paracrino è data dalla mobilizzazione delle cellule staminali. Alcuni fattori di crescita prodotti
dallo stroma del midollo osseo e necessari per il corretto differenziamento ematopoietico (come G-CSF, GM-CSF, IL-3 e SCF) stimolano la mobilizzazione delle cellule staminali del midollo osseo verso il sangue periferico, determinando un impoverimento del comparto staminale midollare ed un arricchimento di staminali e precursori in circolo (Fazzi et al., 2001). In questo contesto, Sox2 potrebbe esplicare la sua funzione in una popolazione cellulare non ematopoietica, come gli osteoblasti o altre cellule dello stroma, aumentando i livelli di una delle citochine mobilizzanti, e aumentando la migrazione delle cellule staminali ematopoietiche dalla loro nicchia verso la periferia.
Per verificare queste ipotesi, bisognerebbe mettere a confronto le popolazioni del midollo e del sangue periferico dei topi Sox2 knock down con quelle dei topi wild type, tramite analisi citofluorimetrica, utilizzando marcatori per cellule primitive
come CD34, Sca1 e kit.
Tuttavia questa ipotesi è confortata dall’osservazione, effettuata nel nostro laboratorio, che l’espressione del recettore per il G-CSF (G-CSF-R) è significativamente aumentata nelle cellule midollari Sox2 knock down rispetto alla controparte normale. Inoltre indagini biochimiche e molecolari hanno evidenziato che, a seguito del legame con G-CSF, la proteina recettoriale G-CSF-R attiva altri pathways di trasduzione del segnale che coinvolgono alcuni membri della
famiglia Jak/Stat e contribuiscono al mantenimento delle capacità proliferative dei progenitori mieloidi (van de Geijn et al., 2003). L’aumento dell’espressione di G- CSF-R è pertanto compatibile anche con l’aumento dei precursori multipotenti
riscontrato in seguito alla down regolazione di Sox2.
Sorprendentemente, la ridotta espressione di Sox2 è correlata anche ad una diminuzione dell’espressione di Otx1 e i suoi effetti sono coerenti con la nostra
precedente osservazione che, in seguito alla perdita di funzione dell’omeogene, si riscontra un aumento dei precursori pluripotenti e dell’espressione del G-CSF-R (Levantini et al., 2003).
Sarebbe molto interessante effettuare trapianti di midollo wild type in topi irradiati Sox2 knock down per verificare se il fenotipo ematopoietico dei mutanti sia
dovuto ad un effetto estrinseco alle cellule ematopoietiche, determinato dal microambiente in cui queste ultime si trovano. Il principale problema legato a questo tipo di esperimenti è costituito dall’alta mortalità degli animali Sox2 knock down e, di conseguenza dalla difficoltà di analizzare un numero significativo di animali.
