Riassunto
Nel rombencefalo dei vertebrati i neuroni serotoninergici sono organizzati in nuclei (nuclei del raphe) che fanno parte del sistema reticolare. I nuclei del raphe forniscono una estesa innervazione a numerose regioni del cervello ed al midollo spinale. Alterazioni nel corretto funzionamento del sistema serotoninergico sembrano essere correlate all’insorgenza di alcune patologie neuropsichiatriche tra cui i disturbi alimentari, l’aggressività e la depressione.
Ad oggi i precisi meccanismi genetici che durante lo sviluppo embrionale controllano la specificazione ed il differenziamento dei neuroni serotoninergici non sono ancora del tutto chiariti.
Durante lo sviluppo del sistema nervoso centrale i neuroni che producono serotonina (5-HT) si formano nella porzione ventrale del midollo allungato. E' stato dimostrato che molecole diffusibili come Shh, FGF8 e FGF4 sono in grado di attivare alcuni fattori di trascrizione come Mash1, Nkx2.2, Nkx6.1, GATA2, e GATA3 i quali, a loro volta, promuovono la specificazione dei precursori serotoninergici. Recentemente nel topo è stato identificato il gene Pet-1: un fattore di trascrizione con dominio ETS che inizia ad essere espresso nei precursori serotoninergici circa un giorno prima che la serotonina venga prodotta. Mediante esperimenti di
“knockout” genico nel topo è stato dimostrato che Pet-1 è necessario per il differenziamento terminale e, presumibilmente, per il mantenimento del fenotipo serotoninergico e per la sintesi di serotonina nel SNC.
Allo scopo di fornire un contributo alla comprensione dei meccanismi molecolari coinvolti nello sviluppo dei neuroni serotoninergici, il mio lavoro di tesi si è concentrato nello studio del ruolo funzionale del fattore di trascrizione Pet-1 nel modello sperimentale Xenopus laevis.
Inizialmente, ho effettuato uno “screening” di una genoteca di cDNA che mi ha permesso di isolare l’omologo del gene Pet-1 in Xenopus laevis.
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Successivamente ho studiato il "pattern" dell’espressione genica di XPet1 durante lo sviluppo embrionale e nel cervello adulto mediante ibridazioni in situ "whole mount" e su sezione. Effettuando esperimenti di ibridazione in situ e di immunoistochimica ho confrontato l’espressione genica di XPet-1 con la presenza di serotonina nel sistema nervoso centrale sia durante lo sviluppo embrionale sia nell’adulto. I risultati ottenuti indicano che in Xenopus XPet-1 è espresso unicamente nei neuroni serotoninergici che orginano a livello rombencefalico nei nuclei del raphe. Per stabilire con esattezza l‘andamento spazio-temporale della comparsa dei neuroni che esprimono XPet-1 durante lo sviluppo del sistema serotoninergico di Xenopus ho effettuato esperimenti di doppia marcatura con sonde per geni espressi al confine meso-rombencefalico, come XEn, e specifici dei rombomeri (r) 3 e 5 come XKrox20. L’espressione di XPet-1 può essere rilevata a partire da stadio 24 (tailbud) nella regione ventrale del tubo neurale che sta al confine tra mesencefalo e rombencefalo. A stadi successivi di sviluppo l’espressione di XPet-1 si estende posteriormente fino al confine tra il rombencefalo ed il midollo spinale.
Grazie alla possibilità di effettuare micro-iniezioni in embrioni di Xenopus questo modello sperimentale permette di effettuare lo studio funzionale di specifici geni. Allo scopo di studiare la funzione di XPet-1 durante lo sviluppo embrionale di Xenopus, ho iniziato ad effettuare esperimenti di sovraespressione mediante la microiniezione del cDNA di XPet-1. Dalle analisi degli embrioni iniettati è stato possibile riscontrare che il gene XPet-1 alle dosi prese in considerazione non è in grado da solo di produrre neuroni 5HT ectopici.
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II
