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"INFLAMM-AGING" E PATOLOGIE OCULARI: RUOLO DI SIRT1 E OPPORTUNITA' TERAPEUTICHE

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DIPARTIMENTO DI FARMACIA

Corso di Laurea Magistrale in Farmacia

Tesi di Laurea

“INFLAMM-AGING” E PATOLOGIE OCULARI:

RUOLO DI SIRT1 E OPPORTUNITA' TERAPEUTICHE

Relatore:

Prof. Vincenzo Calderone

Candidato:

Arianna Ciompi

(2)
(3)

INDICE

1 Introduzione

1

2 “Inflamm-aging”

2.1

Infiammazione

2.2

Invecchiamento

2.3

Il segreto della longevità

2.4

Relazione tra “Inflamm-aging” e patologie

2

3

4

7

9

3 Gli effetti dell' “Inflamm-aging” a livello oculare

3.1

Degenerazione maculare legata all'età (AMD)

3.2

Uveite

3.3

Retinopatia Diabetica

3.4

Sindrome dell'occhio secco

10

11

15

18

24

4 Le vie di regolazione del segnale nell'“Inflamm-aging”:

la via delle Sirtuine

4.1

La via delle Sirtuine

4.2

Le sette isoforme delle Sirtuine

4.3

Sirt1 ed il suo ruolo fisiologico

4.4

L'effetto protettivo di Sirt1 nell'invecchiamento oculare

4.5

Approcci per incrementare l'attività di Sirt1

26

26

29

31

37

40

5 Conclusioni

43

Bibliografia

(4)

1

INTRODUZIONE

La ricerca sull'invecchiamento e tutto ciò che lo riguarda ha fin da sempre affascinato la comunità scientifica, riscuotendo un interesse crescente anche nella popolazione, dovuto al divulgare di notizie tramite i mezzi di comunicazione, che hanno spesso trattato argomenti quali l'aumento dell'aspettativa media di vita nel mondo, l'aspettativa di vita massima e come mai vi sia un aumento dei soggetti centenari in determinate popolazioni.

L’invecchiamento è diventato oggetto di numerosi studi scientifici, finalizzati ad indagarne il meccanismo molecolare e ad elaborare strategie utili per la prevenzione delle sintomatologie e malattie ad esso connesse. Nonostante ciò, non sono state ancora trovate le cause esatte che sono alla base del fenomeno di invecchiamento dell'essere umano e, nello specifico, dei vari distretti anatomici.

Molti protagonisti molecolari sono responsabili dell'invecchiamento, tra i quali enzimi, proteine e l'attivazione o la repressione di varie vie di regolazione del segnale; tra questi, è stata scoperta e studiata una nuova famiglia di proteine, le Sirtuine, che rivestono particolare interesse per la loro possibile implicazione nella longevità cellulare, in patologie cardiovascolari e neurodegenerative, in alcuni tipi di cancro, nel diabete e nell’obesità.

(5)

2 “INFLAMM-AGING”

Il termine “Inflamm-aging” è stato coniato all'inizio del secolo da Claudio Franceschi, docente dell'Università di Bologna, e deriva dall'unione delle due parole inglesi inflammation (infiammazione) e aging (invecchiamento); esso indica la stretta connessione esistente tra il processo infiammatorio cronico e l'invecchiamento. Poichè la popolazione anziana è in continuo aumento e l'invecchiamento è il principale fattore di rischio per la maggior parte delle malattie croniche, è necessario ampliarsi nella ricerca di soluzioni per migliorare la salute umana. L'obiettivo basilare è capire come l'invecchiamento possa permettere lo sviluppo di malattie croniche, e di conseguenza di cercare approcci preventivi e terapeutici per debellarle (Franceschi e Campisi, 2014). Le principali fonti di infiammazione dell' Inflamm-aging sono:

Detriti cellulari, tra cui organuli danneggiati, radicali liberi, metaboliti,

molecole alterate, che si accumulano con l'età nell'organismo. La loro produzione aumenta con l'età, ed allo stesso tempo il loro smaltimento da parte dei macrofagi diminuisce, determinando accumulo;

Senescenza cellulare, uno stato in cui la cellula perde le proprie funzioni

fisiologiche e non è più in grado di proliferare. L'accumulo di cellule senescenti in un organo ne altera le funzioni, fino a comprometterle del tutto. Le cellule senescenti alimentano le malattie legate all'età perché secernono numerose citochine proinfiammatorie, che vanno ad alterare anche la funzione delle vicine cellule normali;

Immunosenescenza, che può essere accelerata da infezioni causate da

CMV, HIV e il Virus di Epstein-Barr. I cambiamenti legati all'età derivano sia dall'esposizione permanente a patogeni e antigeni, ma anche da cambiamenti intrinseci nelle cellule e dalla predisposizione genetica (Franceschi et al., 2000).

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2.1 Infiammazione

L'infiammazione è la reazione di un tessuto vascolarizzato ad un danno locale causato da agenti lesivi (noxa), e consiste nella risposta della componente vascolare, della componente cellulare (migrazione e attivazione dei leucociti), e di una finale reazione sistemica. L'infiammazione non è un evento negativo per l'organismo, anche se dà dolore ed impedimento funzionale, ma ha uno scopo difensivo perché favorisce l'intervento di componenti del sistema immunitario nelle sedi in cui si verifica un'intrusione esterna. L'infiammazione contrasta l'agente lesivo e gli effetti del suo danno, avviando allo stesso tempo tutti i processi di riparazione necessari. La risposta è protettiva ed è intrecciata con il processo di riparazione. Si tratta di un processo che distrugge l'agente lesivo, mirando alla ricostruzione del tessuto danneggiato attraverso processi di rigenerazione. L'infiammazione può essere distinta in due tipi:

– L’infiammazione acuta, un meccanismo difensivo che l’organismo mette in atto, in modo transitorio, per contrastare situazioni di pericolo causate da agenti patogeni esterni o da eventi traumatici; una volta superato il problema (qualche ora, pochi giorni al massimo), l’infiammazione non lascia conseguenze nell'organismo;

– Se, invece, lo stato infiammatorio persiste e lo stimolo flogogeno non viene né rimosso né risolto, l’infiammazione passa allo stato cronico, con conseguenze rilevanti sui tessuti, sintomi specifici e manifestazioni cliniche evidenti. Il processo infiammatorio cronico può essere tale fin dall'inizio se alcuni agenti flogogeni resistono ai meccanismi di uccisione intracellulare, oppure se la reattività dell'individuo è ridotta per la presenza di malattie croniche o per carenze nutrizionali gravi; in questo caso, il processo cronico si sviluppa fin dall'inizio.

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2.2 Invecchiamento

Si definisce invecchiamento (aging) il cambiamento, nel tempo, delle caratteristiche funzionali di un organismo, che tendono a decadere in modo progressivo. Con l'avanzare dell'età, infatti, si assiste alla comparsa di alterazioni fisiologiche a livello degli organi, con un declino progressivo delle normali funzioni. L'invecchiamento è condizionato dall'interazione di vari fattori: fattori genetici, fattori ambientali, dieta, condizioni sociali e patologiche, interventi farmacologici, stress ossidativo. Si tratta di un fenomeno biologico graduale ma continuo, che varia da individuo ad individuo, in quanto non c'è un vero e proprio momento della vita in cui si inizia ad invecchiare. Al momento si stima che gli individui possano vivere fino ad 80– 120 anni, un tempo chiaramente più lungo se paragonato a quello dei nostri antenati: ciò è una conseguenza diretta dei miglioramenti nelle condizioni di vita, nei progressi scientifici e nell'assistenza medica (Franceschi et al., 2000). Poiché l'invecchiamento è un processo multifattoriale, è necessario prendere in considerazione i differenti aspetti che concorrono a determinare le numerose alterazioni morfo-funzionali. Una delle teorie in grado di spiegare gran parte delle alterazioni che si verificano nell’invecchiamento e in molti stati patologici ad esso correlati è la Teoria Radicalica di Harman. Essa afferma che l’invecchiamento è il prodotto di una serie di reazioni ossidative di natura radicalica che sono in grado di accelerare la degradazione dei sistemi biologici, causando nel tempo un’usura somatica; la longevità dipenderebbe dall’efficienza dei sistemi di protezione antiossidante (Harman, 1956).

I radicali liberi sono delle specie chimiche che hanno un elettrone spaiato nell'orbitale più esterno, caratteristica che li rende instabili ed altamente reattivi con tutti gli agenti circostanti, dai quali sottraggono o ai quali cedono un elettrone nel tentativo di acquisire stabilità.

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La produzione di radicali liberi è legata al metabolismo cellulare, ma possono essere prodotti anche in caso di cattive condizioni dovute a stress, fumo di sigaretta, inquinamento ambientale, cattiva alimentazione, vita sedentaria, abuso di alcool, farmaci e droghe. L'ossigeno è il principale responsabile della formazione di radicali liberi: in condizioni fisiologiche, una minima quantità di specie reattive dell'ossigeno (ROS) viene sempre prodotta dal metabolismo cellulare e viene eliminata ad opera di sistemi antiossidanti endogeni, tra cui la superossido dismutasi (SOD), la catalasi, la glutatione perossidasi, ed altre piccole molecole come la vitamina C e la vitamina E (Vendemiale et al., 2011). Si parla di “stress ossidativo” quando si instaura uno squilibrio tra la produzione di ROS ed il sistema di difesa antiossidante, a favore dell'ambiente ossidante, con un aumento eccessivo dei ROS circolanti. Nell'invecchiamento si possono avere diversi meccanismi di stress ossidativo: un aumento della velocità di produzione di ROS, una riduzione di efficacia dei sistemi di difesa antiossidante, oppure una diminuita efficienza nel riparare le molecole danneggiate. A concentrazioni elevate, i ROS attaccano i principali costituenti della cellula, causando frammentazione proteica, inattivazione di enzimi, la mutagenesi del DNA, la rottura della membrana cellulare e apoptosi (Vendemiale et al., 2011).

Lo stress ossidativo svolge un ruolo rilevante nell'insorgenza di alcune patologie: la presenza di un elevato stato ossidativo aumenta la suscettibilità a malattie cardiovascolari, malattie neurodegenerative (Alzheimer, Parkinson, Corea di Huntington, SLA), aterosclerosi, disturbi metabolici, ipertensione e cancro (Chong et al., 2012).

L'invecchiamento è un processo biologico naturale, caratterizzato da un graduale declino delle funzioni cellulari e da cambiamenti strutturali in numerosi organi; i cambiamenti anatomici e fisiologici delineano il processo di senescenza.

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La sopravvivenza umana è collegata anche alla presenza di un sistema immunitario funzionale ed efficiente, ma con l’avanzare dell’età si assiste ad un lento e progressivo deterioramento delle funzioni immunitarie (Fulop et al., 2018). Avendo una speranza di vita maggiore, anche il sistema immunitario deve affrontare un'esposizione ad un'ampia varietà di antigeni: con l'invecchiamento si riscontra un deterioramento della componente immunitaria definito immunosenescenza. Le caratteristiche dell'immunosenescenza sono:

– maggiore suscettibilità dell'organismo ad infezioni e tumori (protezione insufficiente contro l'insorgenza di neoplasie);

– fallimento dei meccanismi di riparazione delle ferite; – risposte ai vaccini compromesse;

– possibili riattivazioni delle infezioni virali croniche;

– aumento dell'incidenza di malattie infiammatorie, tra cui le malattie cardiovascolari e le malattie degenerative come morbo di Alzheimer, morbo di Parkinson e osteoartrite, che hanno alla base una forte componente infiammatoria. Si può anche assistere ad un aumento della produzione di auto-anticorpi, con insorgenza di patologie autoimmuni. L'invecchiamento del sistema immunitario può funzionare da acceleratore per altre patologie legate all'età, che portano ad un generale deterioramento degli organi. È bene quindi considerare il processo di invecchiamento come un importante fattore di rischio di tutte le malattie (Kennedy et al., 2014).

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2.3 Il segreto della longevità

La percentuale di centenari e super-centenari nella popolazione moderna sta crescendo velocemente, ed è importante valutare i fattori che determinano il successo dell'invecchiamento in età così avanzate. La presenza di una risposta infiammatoria attiva per risolvere le infezioni è utile in giovane età, ma con la vecchiaia diventa la causa di molte malattie: la stessa risposta infiammatoria, quindi, ha due significati diversi e opposti a seconda dell'età dell'individuo. Cosa hanno di caratteristico i centenari, che permette loro una vita più lunga? I soggetti che vivono più a lungo mostrano dei livelli più alti di molecole pro-infiammatorie, che supportano l'infiammazione cronica, ma allo stesso tempo presentano anche degli alti livelli di molecole anti-infiammatorie. In individui centenari sani sono stati trovati dei segni di Inflamm-aging, accompagnati da un aumento dei livelli di marcatori anti-infiammatori: si pensa che a fianco di un fenomeno infiammatorio vi sia la concomitanza di un fenomeno anti-infiammatorio, che viene definito anti Inflamm-aging; la longevità sarebbe l'esito di un giusto equilibrio tra queste due risposte. I centenari rappresentano un'eccezione agli effetti dell'Inflamm-aging, poichè sembrano esser dotati di alcune varianti geniche che consentono loro di ottimizzare l'equilibrio tra le molecole pro-infiammatorie e le molecole anti-infiammatorie, minimizzando gli effetti dovuti all'esposizione ad insulti ambientali, agenti patogeni, fattori di stress (Franceschi et al., 2007).

Il segreto della longevità non risiede nell’assenza completa dell'infiammazione, ma nella capacità dell’individuo di mantenere il corretto equilibrio tra

Inflamm-aging e anti Inflamm-Inflamm-aging (Arai et al., 2015). L'invecchiamento normale,

quindi, è rappresentato dai centenari, che sono lo standard di riferimento degli studi, mentre gli individui che non raggiungono quest'età sono l' “eccezione biologica”, che non ha un corredo genetico tale da raggiungere un'età avanzata.

(11)

I centenari ed i loro discendenti sono epigeneticamente più giovani di quanto si possa dedurre dalla loro età cronologica: nello specifico, sono più giovani del previsto di circa 8,7 anni in base alla loro rispettiva età cronologica. Il termine epigenetica (dal greco epì=sopra e gennetikòs=relativo all'ereditarietà familiare) indica lo studio delle modifiche chimiche e strutturali apportate al genoma che non alterano il DNA, ma che vengono trasmesse con la divisione cellulare e possono influenzare il modo in cui i geni sono espressi. A differenza della genetica, che studia i geni e la trasmissione dei caratteri ereditari sulla base della sequenza genica, l’epigenetica studia l’ereditarietà sulla base di modifiche ambientali che influenzano la struttura del DNA e che condizionano l’espressione genica (Franceschi et al., 2007).

Le modificazioni epigenetiche fanno parte del normale funzionamento delle cellule. Epigenetica è ogni modificazione del DNA che non altera la sequenza, a differenza delle mutazioni, e riguarda tutte le modifiche che coinvolgono, ad esempio, la metilazione, l’impacchettamento e la replicazione del DNA.

Comprendere quali siano i fattori che determinano la longevità estrema (e la conseguente riduzione della mortalità) può essere di aiuto per raggiungere una maggiore durata della vita per la popolazione, e per colmare il dislivello presente tra coloro che invecchiano più velocemente e quelli che, invece, invecchiano più lentamente. Si tratta di una visione innovativa, che apre future prospettive nello sviluppo di nuove strategie per ritardare l’invecchiamento: se le malattie associate all'età presentano un'origine infiammatoria comune, è possibile curarle tutte insieme piuttosto che una alla volta. Potrebbe essere possibile curare l’invecchiamento considerandolo come un unico e solo processo, curando insieme i diversi disturbi associati all’età.

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2.4 Relazione tra “Inflamm-aging” e patologie

L'Inflamm-aging è un fenomeno che viene scatenato soprattutto da segnali endogeni, tra i quali un aumento dello stress ossidativo, danni alle macromolecole dell'organismo che portano alla formazione di detriti cellulari, l'alterazione del metabolismo, che sono connessi con il processo infiammatorio. Anche se non ha segni clinici né sintomi evidenti, l’Inflamm-aging genera danni alle cellule e ai tessuti, rappresentando un fattore di rischio per molte patologie croniche (Figura 1); è un processo strettamente correlato a patologie quali la malattia di Alzheimer, la malattia di Parkinson, la sclerosi laterale amiotrofica, la sclerosi multipla, l'aterosclerosi, le malattie cardiache, la degenerazione maculare senile, il diabete di tipo II, l'osteoporosi, l'insulino-resistenza, il cancro ed altre patologie (Xia et al., 2016).

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3 GLI EFFETTI DELL' “INFLAMM-AGING” A LIVELLO

OCULARE

L'infiammazione, come già detto, è una risposta del sistema immunitario ad insulti nocivi volta a mantenere l'omeostasi e ripristinare la funzionalità dell'organismo. Anche l'occhio (Figura 2) cerca di limitare le risposte immunitarie e infiammatorie locali per preservare la vista: questo fenomeno viene definito “privilegio immunitario oculare”, ed è mediato da una combinazione di meccanismi locali e sistemici (Zhou e Caspi, 2010).

La prima linea di difesa a livello oculare è la presenza di un'efficace barriera emato-retinica che impedisce il libero traffico di cellule e molecole dentro e fuori l'occhio finchè essa è integra, preservando l'ambiente oculare. Nel caso di un trauma fisico agli occhi, le cellule immunitarie del sangue entrano nell'occhio e il microambiente oculare si occupa di controllarle e di contenerle. Se ciò non è sufficiente e si sviluppa un'infiammazione, l'occhio sollecita meccanismi regolatori sistemici. I cambiamenti legati all'età influenzano tutte le strutture oculari e vanno ad incidere soprattutto sulla qualità della visione (Perez e Caspi, 2015).

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È importante riuscire a distinguere i cambiamenti fisiologici che sono legati all'età, dai cambiamenti di natura patologica. La prevalenza della perdita visiva aumenta in genere dopo i 60 anni di età, e la visione inadeguata è la seconda disabilità fisica prevalente nelle persone anziane (Lin et al., 2016).

Verranno trattate in seguito alcune patologie oculari, soffermandosi in particolare sul ruolo che ha il processo infiammatorio nella loro insorgenza.

Degenerazione maculare legata all'età (AMD)

Uveiti

Retinopatia diabetica

Sindrome dell'occhio secco

3.1 Degenerazione maculare legata all'età (AMD)

La degenerazione maculare legata all'età (AMD) è la prima causa di cecità nel mondo occidentale e colpisce i soggetti con più di 65 anni (Jin et al., 2016). Si tratta di una patologia oculare fortemente invalidante, che determina un danno a livello della macula, la zona centrale della retina dove vi è la massima concentrazione dei coni, ovvero i fotorecettori specializzati nella visione dei dettagli; questa zona retinica ci consente di riconoscere i volti, i colori, di leggere e di guidare. L'AMD determina una compromissione irreversibile della visione centrale, mentre la visione periferica o laterale viene conservata (non si ha cecità totale). Tra i sintomi iniziali si ha la distorsione delle immagini che interessa il centro del campo visivo (dove si punta lo sguardo), difficoltà nella lettura e nello svolgimento di attività a distanza ravvicinata, e perdita della brillantezza dei colori. Quasi sempre la malattia è progressiva e colpisce entrambi gli occhi, anche a intervalli di tempo variabili e con quadri clinici e gravità differenti (Chen e Xu, 2015).

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Tipologie di AMD

La AMD si sviluppa secondo una serie di tappe (Figura 3):

(a) Nell'occhio, la luce passa attraverso la pupilla e viene focalizzata dalla lente alla macula dello strato retinico nella parte posteriore dell'occhio. (b) L'epitelio pigmentato retinico, insieme alla membrana di Bruch, forma la

barriera retinica esterna che separa la retina dalla coroide. Questa barriera trasporta ossigeno e nutrienti dalla coroide alla retina, ed i rifiuti metabolici della retina sono allontanati verso la coroide.

(c) Le prime fasi di AMD sono contraddistinte dall'insorgenza di drusen, depositi di natura proteico-lipidica posti nella barriera retinica esterna, tra l'epitelio pigmentato retinico e la membrana di Bruch; allo stesso tempo si ha senescenza dell'epitelio pigmentato retinico ed un accumulo di microglia e macrofagi nello spazio sottoretinico. La presenza di drusen non implica che vi sia l'insorgenza immediata di AMD, ma aumenta il rischio di svilupparla. L'AMD può poi progredire in due forme distinte. (d) AMD secca (o atrofica), è caratterizzata da un assottigliamento

progressivo della retina centrale che, riducendosi di dimensioni, risulta sempre meno ricca di capillari e per questo si atrofizza. Si ha la perdita dell'epitelio pigmentato retinico e dei fotorecettori, con infiltrazione di macrofagi sul sito della lesione.

(e) AMD umida (o essudativa), è la forma più grave, caratterizzata dal fenomeno di neovascolarizzazione, ovvero dalla crescita di nuovi vasi sanguigni anomali che si sviluppano dalla coroide (membrana vascolare più interna dell'occhio) e crescono sotto il centro della retina (macula). Sono vasi sanguigni che hanno una parete molto fragile e possono rompersi facilmente, determinando emorragie retiniche e versamenti (Chen e Xu, 2015).

(16)

L'AMD è una malattia multifattoriale e vi è una complessa interazione di fattori genetici e ambientali a monte della patologia: familiarità, età (superiore ai 60 anni), fumo di sigaretta, abuso di alcool, ipertensione arteriosa, disordini cardiovascolari, esposizione prolungata e ripetuta ad intense sorgenti di luce, disturbi della coagulazione. Non è noto come questi fattori agiscano tra loro. Che ruolo ha il processo infiammatorio nell'insorgenza dell'AMD?

Con l'invecchiamento, la retina soffre di insulti ossidativi cronici di basso grado che aumentano con il progredire dell'età e degli insulti esterni. Di conseguenza, il sistema immunitario innato retinico, in particolare microglia e sistema del complemento, subisce dei bassi livelli di attivazione, che è stata definita col termine parainfiammazione (Chen e Xu, 2015).

Figura 3: Retina ed epitelio pigmentato retinico in AMD normale, precoce e tardiva (riadattata da Chen e Xu, 2015)

AMD SECCA

AMD UMIDA

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Tra le condizioni omeostatiche basali e l'insorgenza di un vero e proprio processo infiammatorio, esiste uno stato intermedio di parainfiammazione, che è una risposta adattativa del sistema immunitario alla presenza di bassi livelli di stress tissutale, che si accumula nel tempo. Il ruolo della parainfiammazione è di mantenere l'omeostasi e ripristinare le funzioni del tessuto, in questo caso dell'occhio invecchiato sano (Chovatiya R, Medzhitov R., 2014).

In pazienti affetti da AMD, la risposta parainfiammatoria diventa disregolata e contribuisce al danno maculare conclusivo: se lo stress retinico è elevato e supera la capacità di riparazione operata dal sistema immunitario, il danno ai tessuti è inevitabile. Tra i fattori che contribuiscono alla disregolazione vi sono l'età, la predisposizione genetica e i fattori di rischio ambientali. La parainfiammazione disregolata danneggia la barriera retinica, determinando distruzione del “privilegio immunitario retinico” e portando allo sviluppo di lesioni, che sono il preludio dell'insorgenza di AMD (Chen e Xu, 2015).

A sostegno della presenza del processo infiammatorio, in pazienti affetti da AMD sono stati rilevati anche dei livelli plasmatici aumentati di:

– molecole infiammatorie, tra cui vitronectina, protrombina, aumento dei livelli sierici di proteina C reattiva, immunoglobuline e proteine del complemento (C3, C5, C5b, CFH e CRP), rilevati dalle analisi di drusen. Poichè l'attivazione del complemento è coinvolta anche nell'uveite e nella retinopatia diabetica, ciò suggerisce che il sistema del complemento sia una parte importante della difesa immunitaria innata della retina; – cellule immunitarie, inclusi macrofagi, linfociti e mastociti, rilevati nelle

lesioni della macula o nella coroide adiacente alle lesioni maculari (Chirco e Potempa, 2018).

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3.2 Uveite

L'uvea (Figura 4) è una sottile membrana vascolare dell'occhio posta tra la sclera (tunica esterna fibrosa) e la retina (tunica interna nervosa), definita anche tunica media. Dal punto di vista anatomico, è composta da tre porzioni:

L'iride, un delicato diaframma posto davanti al cristallino, che separa la camera anteriore da quella posteriore, e presenta al centro il forame pupillare, designato a controllare la quantità di luce che penetra nell'occhio con meccanismo riflesso. È una sottile membrana che determina il colore degli occhi.

Il corpo ciliare, una formazione anulare che si estende dalla base dell'iride alla coroide, deputato alla produzione di umor acqueo e al controllo del fenomeno di accomodazione (messa a fuoco delle immagini) attraverso il muscolo ciliare. La coroide, uno strato vascolare posto tra la sclera (esterna) e la retina (interna), che si estende dal nervo ottico fino al corpo ciliare, con funzione di trasporto di ossigeno e nutrienti alla porzione della retina ad essa adiacente, comprendendo i fotorecettori e l'epitelio pigmentato retinico. Vi sono anche dei melanociti che possono conferire dei diversi gradi di colore al fondo oculare.

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Poiché a livello dell'uvea vi sono numerosi vasi sanguigni e vasi linfatici che sono deputati al trasporto di ossigeno e di nutrienti ai tessuti oculari, un eventuale processo infiammatorio che si instaura a questo livello si espanderà anche ai distretti anatomici circostanti, come cornea, retina, sclera. Si definisce uveite una generica infiammazione che avviene a livello dell'uvea e può essere distinta, in base al distretto anatomico, in quattro tipi (Figura 5):

– Uveite anteriore: si localizza nel segmento anteriore dell'occhio, e comprende irite (infiammazione nella sola camera anteriore) e iridociclite (infiammazione nella camera anteriore e nel vitreo anteriore). L'occhio all'esterno appare molto rosso, poichè i vasi corneali si dilatano ed assumono un colorito violaceo. Si ha lacrimazione abbondante e offuscamento della vista;

– Uveite intermedia: si localizza nella cavità vitrea;

– Uveite posteriore: termine che identifica ogni forma di retinite, coroidite o infiammazione del disco ottico;

– Panuveite: infiammazione generale che coinvolge tutte le strutture dell'uvea, anteriori intermedie e posteriori.

L'uveite determina una riduzione temporanea della vista e, se non viene curata in modo efficace e tempestivo, implica danni irreversibili a uno o ad entrambi gli occhi. Il paziente avverte bruciore oculare, graduale offuscamento della vista, eccessiva lacrimazione e dolore (Jabs et al., 2005).

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Le cause dell'insorgenza di questa patologia sono molte: esistono delle uveiti infettive, ovvero causate da agenti infettivi esogeni (virus, batteri, funghi) che giungono all'occhio attraverso la circolazione sistemica o per via di traumi oculari; tra questi: Herpes simplex virus, Citomegalovirus, HIV, Toxoplasmosi, batterio della tubercolosi, granuloma dentale. Esistono anche delle uveiti non-infettive, dette idiopatiche, che sono causate da altri meccanismi ad eziologia sconosciuta: malattie di natura reumatologica o autoimmunitaria, come l’artrite reumatoide, la sarcoidosi o il morbo di Behcet, che provocano una reazione immunitaria responsabile dell'attivazione del processo infiammatorio. L'uveite si può presentare anche come conseguenza di un tumore dell'occhio, di un linfoma o di un glaucoma (Lee et al., 2014).

Nelle uveiti che non sono riconducibili a traumi o ad agenti patogeni definiti, si ritiene che vi sia un ben preciso meccanismo di attivazione alla base.

Le cellule T autoreattive specifiche per la retina si attivano in periferia, circolano ed arrivano ai vasi sanguigni della retina. I fattori scatenanti che attivano queste cellule in modo che sfuggano al controllo sono in gran parte ancora sconosciuti. A causa del loro stato attivato, le cellule innescate producono degli enzimi degradanti della matrice e perciò passano attraverso le giunzioni strette della barriera emato-retinica, entrando nel tessuto retinico. A questo livello avviene la produzione di citochine e chemochine, mediatori chimici dell'infiammazione che promuovono un massiccio reclutamento di leucociti infiammatori dalla circolazione sistemica. L'infiammazione risultante provoca danni al tessuto e il rilascio di antigeni oculari, che innescano dei meccanismi regolatori specifici che risolvono la malattia, o la limitano. Questi risultati supportano l'idea che un individuo che presenta un repertorio di cellule T autoreattive specifiche per la retina con maggiore affinità, può avere una maggiore probabilità di sviluppare uveite (Caspi, 2010).

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3.3 Retinopatia Diabetica

La retinopatia diabetica, DR, è una complicanza tardiva del diabete, che si manifesta di solito dopo alcuni anni dall'insorgenza della malattia, soprattutto se questa non viene trattata in modo adeguato.

Il diabete è una malattia caratterizzata dall'aumento di glucosio nel sangue (iperglicemia), dovuto ad un’insufficienza assoluta o relativa di insulina, un ormone prodotto dalle cellule ß del pancreas, indispensabile per utilizzare il glucosio nei tessuti. Si distinguono due forme principali di diabete:

– Diabete di tipo 1 (diabete insulino-dipendente, o diabete giovanile), che è dovuto alla distruzione da parte del sistema immunitario delle cellule ß del pancreas, che sono responsabili della produzione di insulina. Per questo viene classificata a tutti gli effetti come malattia autoimmune. Si tratta di una situazione irreversibile, ed il paziente che ne è affetto deve necessariamente assumere ogni giorno, e per tutta la vita, dosi di insulina per via sottocutanea;

– Diabete di tipo 2 (diabete non insulino-dipendente) è la forma più comune che interessa i soggetti in età avanzata. È caratterizzato da un duplice difetto: un deficit nella secrezione di insulina da parte delle cellule ß pancreatiche e/o un difetto di azione della stessa insulina sui tessuti bersaglio (insulino-resistenza), con il conseguente incremento dei livelli di glucosio nel sangue. Tra le cause vi sono dei fattori ereditari ed ambientali, ma anche altri aspetti caratteristici del soggetto (obesità, vita sedentaria, dieta e stile di vita, ipertensione, età).

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La retinopatia diabetica si classifica in due forme (Porta, 2009):

Retinopatia diabetica non proliferante (NPDR): è il primo stadio della

malattia, meno aggressivo, caratterizzato dall'insorgenza emorragie, di microaneurismi ed essudati rigidi (depositi di grassi provenienti dal sangue). Quando trasuda del liquido dalle pareti alterate dei capillari può formarsi un edema maculare, poiché i vasi dilatati sono fragili e permeabili e causano la trasudazione di siero. L’occlusione dei vasi di diametro maggiore può produrre degli infarti ischemici, che appaiono come aree bianco-grigiastre a margini sfumati (“noduli cotonosi”), con un conseguente apporto insufficiente di sangue alle cellule. La presenza di queste lesioni definisce la retinopatia diabetica “non proliferante” (Figura 6);

Figura 6: Edema maculare diabetico con un ispessimento della retina nella regione maculare e deposizione di essudati duri (Porta, 2009)

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Retinopatia diabetica proliferante (PDR): è la forma più grave e

pericolosa della malattia. Man mano che la retinopatia diabetica progredisce, un numero sempre maggiore di vasi sanguigni si occlude, determinando ischemia retinica, una condizione che priva di ossigeno le zone della retina. Per compensare l'occlusione dei vasi viene stimolata la crescita di nuovi capillari retinici, che apportino un quantitativo di sangue sufficiente alla retina (fase di neovascolarizzazione); i nuovi vasi però sono fragili e si rompono con facilità, causando delle emorragie che riempiono la camera posteriore dell'occhio, occupata dal corpo vitreo. Il riversamento del sangue può causare il sollevamento della retina dalla sua posizione (distacco della retina), stato che comporta un oscuramento della vista che, se non trattato, determina cecità (Figura 7).

Le due forme di retinopatia diabetica presentano caratteristiche strutturali diverse (Figura 8). Con il progredire della malattia si assiste alla comparsa di corpi mobili (puntini neri, macchie scure, striature) che fluttuano nel campo visivo, un offuscamento marcato della vista, la riduzione della visione notturna e la difficoltà nella percezione dei colori (Porta e Bandello, 2002).

Figura 7: Retinopatia proliferante con chiare arcate di neovascolarizzazione, accompagnate da tralci di tessuto fibro-gliale a partenza dalla papilla del nervo ottico. Sono presenti segni di trazione retinica e sanguinamento endovitreale. Alcuni essudati duri nella regione maculare indicano la contemporanea presenza di maculopatia (Porta, 2009).

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Ad oggi non vi è chiarezza assoluta sull’argomento, ma la condizione di iperglicemia sembra essere il fattore scatenante la catena di eventi che costituiscono la patogenesi della retinopatia diabetica (Matthews et al., 2004). L’associazione tra alto glucosio e retinopatia diabetica è confermata da alcuni studi, che mostrano una correlazione positiva tra la severità dell’iperglicemia e il grado di retinopatia diabetica (Doft et al., 1984; Rosenstock et al., 1986). L’iperglicemia è tossica per molte cellule presenti nell’organismo, ma alcuni organi risultano maggiormente afflitti dal diabete, tra cui i reni ed il sistema nervoso, retina inclusa. Questo si spiega considerando che, mentre la maggior parte delle cellule richiede l’azione dell'insulina per permettere l’entrata del glucosio nel citoplasma, le cellule del rene e del tessuto nervoso sono insulina-indipendenti, per cui il glucosio si muove “liberamente” attraverso la membrana plasmatica indipendentemente dall’insulina.

Il trasportatore per il glucosio GLUT1, presente sulle cellule endoteliali dei vasi, su neuroni e sulle cellule di Müller della retina, è soggetto a saturazione; vari fattori associati alla retinopatia diabetica (ipossia, VEGF e IGF-1) aumentano l’espressione di GLUT-1 (Kumagai, 1999; Ruberte et al., 2004),

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Ciò determina accumulo intracellulare di glucosio qualora le cellule siano esposte cronicamente ad un ambiente iperglicemico (Busik et al., 2002).

Il ruolo dell’infiammazione nell'insorgenza della retinopatia diabetica è un argomento di indagine molto seguito negli ultimi anni. L’infiammazione cronica è caratterizzata dall’aumento della permeabilità vascolare, da edema, infiltrazione di cellule infiammatorie, espressione di chemochine e citochine, distruzione tissutale, tentativo di riparo e neovascolarizzazione; la retinopatia diabetica presenta la maggior parte di questi aspetti (Antonetti et al., 2006). La catena innescata dai segnali pro-infiammatori può essere strettamente legata ad alcuni dei risvolti connessi alla retinopatia diabetica. L’incremento delle concentrazioni sieriche di citochine pro-infiammatorie, di molecole di adesione, e l’attivazione di cellule immunitarie contribuiscono a incentivare la risposta infiammatoria. Nella sistema vascolare retinico, questo risulta in importanti alterazioni, tipiche della retinopatia diabetica, come la leucostasi, che porta ad occlusione capillare, e l’aumento della permeabilità dei vasi, mediato dal VEGF (Chibber et al., 2007). Inoltre, l’attivazione della microglia nella retina diabetica può condurre all’aumento di produzione di citochine proinfiammatorie e di ROS, fattori di crescita, metalloproteasi della matrice e NO, tutti coinvolti nell’induzione della retinopatia diabetica (Langmann, 2007). La retinopatia diabetica progredisce lentamente e raggiunge gli stadi più avanzati in assenza di sintomi, provocando dei danni che nel tempo diventano irreparabili, con il rischio di perdere la vista. La patologia di solito colpisce entrambi gli occhi ed ha esordio silenzioso: nelle fasi iniziali non provoca segni d'allarme, ed è importante che i pazienti diabetici monitorino il decorso della patologia effettuando una visita oculistica almeno una volta l'anno, con stretto controllo del diabete, dell'ipertensione e della colesterolemia (Porta, 2009).

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Esistono comunque degli efficaci trattamenti per bloccare l’evoluzione della retinopatia, tra cui la fotocoagulazione laser della retina, che previene la grave riduzione visiva quando le lesioni dovute alla patologia sono ancora allo stato iniziale. Qualora il laser non sia sufficiente a bloccare l'insorgenza della patologia, perché viene applicato tardivamente o perché si è in una fase già aggressiva, sono necessarie delle procedure di vitrectomia.

Recentemente sono stati ottenuti dei buoni risultati attraverso la somministrazione intravitreale di steroidi e di agenti inibitori del VEGF, come il pegaptanib, il ranibizumab e il bevacizumab, in appoggio alla fotocoagulazione laser. L’inibizione del VEGF si è dimostrata efficace nel trattamento delle forme più aggressive di neovascolarizzazione e di edema maculare, non trattabili con la sola fotocoagulazione (Kaiser, 2006).

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3.4 Sindrome dell'occhio secco

La sindrome dell’occhio secco (DES, Dry Eye Syndrome) è una patologia oculare molto frequente e riconducibile a tre cause (Bourne et al., 2013):

– ridotta produzione delle lacrime (ipolacrimia);

– eccessiva evaporazione delle lacrime (“occhio secco evaporativo”), situazione dovuta a un’alterazione dei loro componenti chimici. È la situazione più diffusa, riconducibile ad una disfunzione delle ghiandole di Meibomio, deputate alla produzione della parte lipidica della lacrima; – composizione alterata delle lacrime (dislacrimia);

La superficie oculare deve essere mantenuta costantemente umida ed il film lacrimale (Figura 9) deve essere adatto per una detersione ed una protezione appropriata: se si altera la quantità delle lacrime o se peggiora la loro qualità, l’occhio tende a seccarsi poiché la cornea non risulta più lubrificata a dovere.

Le lacrime sono prodotte dalle ghiandole lacrimali (principali ed accessorie) e sono necessarie per la formazione del film lacrimale, una sottile pellicola che ricopre l’occhio allo scopo di lubrificarlo e di apportare sostanze nutritive ed ossigeno alla cornea.

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Le lacrime sono composte da acqua, elettroliti, proteine, grassi e sostanze organiche. Presentano una struttura stratificata: esternamente vi è uno strato lipidico che impedisce alla componente acquosa di evaporare, internamente a contatto con le strutture oculari vi è uno strato di mucine che tiene la parte acquosa attaccata alle cellule, mentre la parte acquosa, più ampia, si trova in mezzo alle due porzioni. Grazie all’apertura e alla chiusura delle palpebre, il film lacrimale viene distribuito in modo uniforme su tutta la superficie oculare. Una scarsa produzione di lacrime o un’alterazione dei loro costituenti porta all'insorgenza della DES (Kojima et al., 2012).

I principali fattori di rischio per l'insorgenza di patologia sono: età (sopra ai 50 anni), infiammazioni croniche, uso scorretto di lenti a contatto, attività a video prolungata, traumi, menopausa, utilizzo di alcuni farmaci. I pazienti affetti da DES avvertono bruciore e fastidio agli occhi, senso di corpo estraneo (sabbia negli occhi), difficoltà nell'apertura delle palpebre al risveglio, intolleranza alla luce e presenza di secrezioni all’angolo interno dell’occhio; nei casi più gravi, si avverte forte dolore e la visione diventa offuscata.

La DES può essere causata anche dallo stress ossidativo: a sostegno di ciò, i topi che sono privi di superossidodismutasi 1 (SOD1) presentano un aumento dello stress ossidativo e svilupperebbero una ridotta produzione di lacrime. Di conseguenza, la riduzione dello stress ossidativo attraverso l'assunzione di integratori orali è risultata un ottimo trattamento emergente per trattare la DES (Kojima et al., 2012; Uchino et al., 2012).

Tra gli altri trattamenti in uso vi sono le terapie topiche utilizzando colliri e gel, che funzionano da sostituti lacrimali e contribuiscono alla riduzione del fastidio e a prevenire il danneggiamento della cornea, ma in genere hanno degli effetti transitori sui sintomi avvertiti dal paziente; si può eventualmente effettuare una terapia antinfiammatoria con farmaci per via orale, o ricorrere a dei trattamenti specifici e mirati alle ghiandole lacrimali che fanno uso della luce pulsata.

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4 LE VIE DI REGOLAZIONE DEL SEGNALE NELL'

“INFLAMM-AGING”: LA VIA DELLE SIRTUINE

L'invecchiamento determina l'insorgenza e l'accumulo di cambiamenti nell'ambiente cellulare, con conseguente disfunzione di tessuti ed organi. Le cellule con un DNA instabile sono biologicamente vulnerabili, e se il danno creatosi al doppio filamento è troppo grande da riparare, la cellula diventa senescente o muore per apoptosi. La capacità della cellula di riparare il DNA è importante nel progredire dell'invecchiamento.

Per spiegare i meccanismi alla base dell’invecchiamento fisiologico sono stati condotti numerosi studi, dai batteri all’uomo. Già da qualche tempo, i ricercatori sospettavano l’esistenza di geni specifici che fossero responsabili di regolare la durata della vita, in virtù del fatto che l’invecchiamento è un processo complesso che coinvolge numerosi tessuti e sistemi, influenzato da migliaia di geni. Gli studi sull'invecchiamento nel lievito hanno portato alla scoperta di una famiglia di enzimi, le Sirtuine, che influenzano molteplici percorsi ed aumentano la durata della vita e la salute generale degli organismi.

4.1 La via delle Sirtuine

Lo studio delle Sirtuine è iniziato a partire dall’identificazione, nel lievito

Saccharomyces cerevisiae, del gene Sir2 (Silent Information Regulator 2): esso

è stato uno dei primi geni della longevità ad essere identificato ed analizzato negli organismi inferiori (Revollo e Li, 2013).

Nei mammiferi sono state individuate sette isoforme di Sirtuine (Sirt1-Sirt7), che vengono distinte in base alla loro distribuzione cellulare e alla funzione (Michan e Sinclair, 2007). Si tratta di enzimi NAD+-dipendenti, che necessitano

di una molecola di NAD+ come cofattore, e che operano mediante un'attività

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Nella reazione di deacetilazione, le Sirtuine rimuovono il gruppo acetilico presente nel substrato e lo trasferiscono all'ADP ribosio, formando il composto 2'-O-acetil-ADP-ribosio (2'-OAADPr). Tra i prodotti finali della reazione si ottengono il substrato deacetilato, una molecola di Nicotinammide (NAM) ed il 2'-OAADPr.

Le Sirtuine agiscono anche come mono-ADP-ribosiltransferasi, catalizzando il trasferimento del gruppo ADP-ribosio dal NAD+ a delle proteine riceventi

(modificazione post-traduzionale, detta ADP-ribosilazione), con la produzione finale di proteine mono-ADP-ribosilate e il rilascio analogo di Nicotinammide (Michan e Sinclair, 2007).

Figura 10: Meccanismo Deacetilasico e Mono-ADP-Ribosiltransferasico delle Sirtuine (Michan e Sinclair, 2007).

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Tra i substrati conosciuti delle Sirtuine vi sono anche dei fattori di trascrizione importanti, tra cui la proteina p53, i fattori di trascrizione FOXO (Forkhead box O), il fattore nucleare NF-κB, Ku70, il fattore inducibile l’ipossia (HIF-1α) e molti altri (Li et al., 2007; Dioum et al., 2009; Lim et al., 2010).

Nelle loro reazioni, le Sirtuine utilizzano come cofattore esclusivamente il NAD+: ciò significa che le loro attività sono strettamente connesse ai suoi

livelli cellulari (Revollo e Li, 2013). Il NAD+ è un cofattore che prende parte

alle varie reazioni redox della cellula, in cui si indica con NAD+ la forma

ossidata e con NADH la forma ridotta.

Poichè il NAD+ è il cofattore essenziale per le reazioni delle Sirtuine ed è anche

un loro potente attivatore, risulta evidente che sono considerati degli inibitori delle Sirtuine tutti quei fattori che determinano una riduzione dei livelli cellulari di NAD+ (alimentazione ricca di grassi, risposte infiammatorie acute);

al contrario, tutti quei fattori che determinano un aumento dei livelli cellulari di NAD+ avranno un'azione positiva sulle attività delle Sirtuine (digiuno,

restrizione calorica, esercizio fisico). I segnali nutrizionali, ormonali e ambientali possono così modulare le attività delle Sirtuine attraverso i cambiamenti dei livelli cellulari di NAD+ (Houtkooper et al., 2012).

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4.2 Le sette isoforme delle Sirtuine

La famiglia delle Sirtuine è responsabile del fenomeno della longevità, ma interviene in altre attività essenziali per la vita: le loro funzioni variano dall’interazione con le proteine, alla regolazione delle fasi nella divisione cellulare, all’organizzazione dei microtubuli all’interno della cellula, alla risposta cellulare agli agenti dannosi per il DNA, alla stabilità della cellula e alla lunghezza dei telomeri; sono anche implicate nel regolare i meccanismi molecolari che prendono parte all'invecchiamento (Houtkooper et al., 2012). La struttura di ogni Sirtuina (Figura 11) presenta un dominio core catalico NAD+–dipendente in comune e delle estensioni N- e C- terminali, che

differenziano ciascuna isoforma (Mimura et al., 2013).

Le Sirtuine dei mammiferi sono localizzate in tre diversi compartimenti: Sirt1, Sirt2, Sirt6 e Sirt7 si trovano nel nucleo cellulare (Sirt1 e Sirt2 possono essere presenti anche nel citoplasma), mentre Sirt3, Sirt4 e Sirt5 sono localizzate nei mitocondri (Yamamoto et al., 2007). L’identificazione dei substrati delle Sirtuine ha messo in evidenza il loro ruolo rilevante come regolatrici del

Figura 11: Struttura delle Sirtuine: in rosso, il dominio core catalico NAD+-dipendente

comune a tutte le Sirtuine, affiancato da estensioni N-terminali (grigio) ed estensioni C-terminali (giallo). Il PM è espresso in kDa (Mimura et al., 2013).

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Sirtuine umane Localizzazione subcellulare Attività enzimatica Biologia

SIRT 1 Nucleo (citosol) Deacetilasi Stabilità del DNA e proliferazione cellulare SIRT 2 Citosol Deacetilasi Mitosi e differenziazione

cellulare (modulazione della rete di microtubuli) SIRT 3 Mitocondri Deacetilasi Metabolismo energetico e

risposta allo stress ossidativo (livelli di ATP)

SIRT 4 Mitocondri ADP-ribosil transferasi

Metabolismo energetico e risposta allo stress ossidativo SIRT 5 Mitocondri Deacetilasi Metabolismo energetico e

risposta allo stress ossidativo SIRT 6 Nucleo ADP-ribosil

transferasi;

Deacetilasi

Stabilità del DNA e proliferazione cellulare (riparazione del DNA a

singolo filamento)

SIRT 7 Nucleo Deacetilasi Stabilità del DNA e proliferazione cellulare

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4.3 Sirt1 ed il suo ruolo fisiologico

Delle sette classi di Sirtuine individuate e studiate nei mammiferi, Sirt1 è stata l'isoforma più caratterizzata, in quanto il gene Sir2 scoperto nel lievito corrisponde, nei mammiferi, al gene Sirt1 (Sir2 homolog 1), che codifica per la proteina Sirt1. Essa si trova nel nucleo cellulare, ma può traslocare nel citoplasma laddove vi siano delle particolari condizioni fisiologiche o stimoli: ciò avviene attraverso il segnale di esportazione nucleare (NES), mentre il successivo trasporto dal citoplasma al nucleo avviene con il segnale di localizzazione nucleare (NLS) (Hwang et al., 2013).

Sirt1 è formata da 747 aminoacidi, presenta un core catalitico comune a tutte le Sirtuine ed entrambe le estensioni dei domini N- e C-terminali, che servono come delle piattaforme per l’interazione con proteine e substrati. Sirt1 è coinvolta nella regolazione di molti processi fisiologici: la resistenza allo stress ossidativo, l'infiammazione, la senescenza cellulare, l'apoptosi ed il ritmo circadiano; essa regola anche la produzione di insulina e di glucosio, il metabolismo lipidico e la sopravvivenza cellulare, e svolge un’azione protettiva nei confronti dei neuroni dall'insorgenza di patologie neurodegenerative quali Parkinson e Alzheimer (Mimura et al., 2013).

L’espressione di Sirt1, come già visto per tutte le Sirtuine, varia in base alle condizioni fisiologiche ed energetiche della cellula: in particolare, la sua attività viene indotta durante un basso stato energetico (alti livelli di NAD+) e

viene repressa in condizioni di elevato stato energetico (bassi livelli di NAD+).

Per questo motivo, condizioni di digiuno o di diete a scarso contenuto calorico saranno accompagnate da un aumento dell’espressione di Sirt1, mentre diete ad alto contenuto calorico ridurranno la sua espressione (Houtkooper et al., 2012).

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Se si verificano dei danni al doppio filamento di DNA, Sirt1 viene attivata allo scopo di aumentare la stabilità del DNA e di proteggere la cellula: ciò viene fatto secondo un particolare meccanismo (Figura 13).

Il danno al DNA induce la produzione di una proteina chinasi serina/treonina specifica, chiamata atassia telangiectasia mutata (ATM), che attiva la proteina p53 con l'obiettivo di rallentare il ciclo cellulare e guadagnare tempo per la riparazione del DNA. La proteina p53 si attiva ogni volta che le cellule subiscono un'alterazione, fermando la divisione cellulare e consentendo la riparazione del DNA. Il ciclo cellulare viene interrotto in fase G1, impedendo

che la cellula entri in fase S: tale pausa nella progressione del ciclo cellulare viene definita “checkpoint del ciclo cellulare”. Tuttavia, se il danno al DNA è irreparabile, la proteina p53 diventa “super-attiva” e le cellule muoiono per apoptosi. Nei tumori si ha un'alta frequenza di mutazioni su p53, che la rendono responsabile della proliferazione cellulare incontrollata (Ozawa et al., 2010).

La proteina ATM attiva anche i fattori di trascrizione E2fs, che sono responsabili dell'attivazione finale di Sirt1 e dei successivi effetti a valle.

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L'attività di Sirt1 ha un duplice effetto sulla stabilità del DNA: da un lato essa attiva la proteina Ku70, che è implicata nella riparazione del danno al DNA; dall'altro, essa inibisce l'attivazione eccessiva della proteina p53 e la conseguente apoptosi cellulare che ne deriverebbe. La deacetilazione di p53 effettuata da Sirt1 fornisce una protezione dall'apoptosi (Ozawa et al., 2010). Sirt1 e p53 regolano a vicenda le proprie attività: la proteina p53 è coinvolta nel controllo del ciclo cellulare e possiede nella regione C-terminale vari potenziali siti di acetilazione, sui quali Sirt1 esplica la sua attività catalitica (Luo et al., 2001). Nei topi con deficit di Sirt1, i livelli di acetilazione di p53 erano significativamente sovraregolati dopo esposizione a radiazioni ionizzanti, indicando così che Sirt1 ha un ruolo essenziale nell'aumentare la resistenza allo stress delle cellule. L'aumento dell'acetilazione di p53 è stato anche associato al progredire della senescenza (Yamamoto et al., 2007).

L'attivazione di E2fs, il fattore di trascrizione di Sirt1, induce la stessa Sirt1 a bloccare il meccanismo di apoptosi che viene indotto da p53: qualora vi sia un'assenza dei fattori di trascrizione E2fs, si ha un'iperacetilazione di p53 e un aumento del fenomeno di apoptosi, in quanto l'espressione di Sirt1 viene assai ridotta (Chen et al., 2009).

Nel meccanismo di riparazione del DNA, Sirt1 può anche deacetilare il fattore di trascrizione FOXO per indurre la sintesi di fattori anti-apoptotici. I geni FOXO regolano la differenziazione cellulare ed il metabolismo; nel nucleo, Sirt1 e FOXO3 deacetilato formano un complesso che induce l'arresto del ciclo cellulare e la resistenza allo stress ossidativo, ed inibisce la capacità di FOXO3 di indurre l'apoptosi. (Yamamoto et al., 2007). Il meccanismo di protezione delle cellule dallo stress ossidativo e dall'invecchiamento avviene quindi mediante la regolazione di fattori quali FOXO e p53, nonché tutte le altre molecole coinvolte nel danno e nella riparazione del DNA (Chong et al., 2012).

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Tra i ruoli fisiologici che interessano Sirt1, è sicuramente degna di nota la sua influenza e regolazione sul ritmo circadiano.

I ritmi circadiani sono dei ritmi caratterizzati da un periodo di circa 24 ore: tra questi vi sono il ritmo sonno-veglia, il ritmo di secrezione del cortisolo e di altre sostanze biologiche, il ritmo di variazione della temperatura corporea e di altri parametri circolatori. Questo sistema circadiano endogeno è una sorta di "orologio interno" all'organismo che si mantiene sincronizzato con il ciclo naturale del giorno e della notte grazie all'azione di stimoli naturali come la luce solare, la temperatura ambientale e stimoli di natura sociale. I ritmi circadiani si trovano nella maggior parte degli eucarioti e in alcuni procarioti, ed influenzano la maggior parte delle attività; anche la produzione di metaboliti come il glucosio, e di ormoni correlati con il metabolismo come l’insulina, segue un ritmo circadiano (Nakahata et al., 2008).

Nei mammiferi, l'orologio circadiano è collocato nel nucleo soprachiasmatico (SCN) situato nell'ipotalamo, che riceve le informazioni sull'illuminazione attraverso gli occhi. Dal punto di vista molecolare, l'espressione genica circadiana è regolata da due fattori di trascrizione: CLOCK (Circadian Locomotor Output Cycle Kaput) e BMAL1 (Brain and muscle Arnt-like protein), che si associano formando un eterodimero, si legano a specifiche regioni promotrici E-box in geni target chiamati CCG (Clock Controlled Genes), e sono in grado di attivare, a cascata, migliaia di altri geni e contribuire al ritmo circadiano (Zhou et al., 2014).

Uno dei geni che viene regolato dall'eterodimero CLOCK-BMAL1 è il gene NAMPT, che codifica per la nicotinammide fosforibosiltransferasi, una proteina limitante nella sintesi del cofattore NAD+. La regolazione di NAMPT

influenza i livelli cellulari di NAD+: ciò modula i processi ossidoriduttivi nella

produzione di energia, ed anche l’attività degli enzimi la cui funzione è dipendente da questo cofattore, tra cui proprio Sirt1.

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Essa ha un ruolo chiave nella regolazione dei ritmi circadiani, poichè deacetila le due componenti CLOCK-BMAL1 nel fegato, e ne amplifica l’espressione nel SCN. La perdita della funzione di Sirt1 si verifica in genere come conseguenza dell’invecchiamento e ciò provoca l'abbassamento dei livelli dei componenti circadiani e il deterioramento del controllo circadiano centrale (Chang e Guarente, 2013).

Nei topi normali, la funzione circadiana decade con l'invecchiamento e l'aumento di Sirt1 nel cervello potrebbe impedire questo decadimento; al contrario, la perdita di funzione di Sirt1 altera il controllo circadiano nei topi giovani, imitando ciò che accade nel normale invecchiamento. Poiché Sirt1 stessa diminuisce con l'invecchiamento nei topi normali, i risultati suggeriscono che i farmaci che aumentano l'attività di Sirt1 negli esseri umani, potrebbero avere benefici diffusi per la salute. I componenti dell'orologio circadiano e Sirt1 lavorano quindi in modo sinergico per regolare l'espressione genica: sarebbe interessante approfondire come ciò accade, per poter porre le basi nello studio di svariate patologie, tra cui la depressione derivante dall'alterazione del ritmo sonno-veglia (Chang e Guarente, 2013).

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Malattia Ruolo fisiologico di Sirt1

1) Malattie metaboliche

associate all'obesità • Aumenta la secrezione di insulina Promuove il metabolismo dei grassi • Riduce i livelli di lipidi

• Protegge dall'aterosclerosi

2) Cancro • È coinvolta nel silenziamento dei geni oncosoppressori

• Inibisce l'attività trascrizionale di p53 • Influenza la riparazione del danno al DNA • Influenza la soppressione tumorale

• Mantiene la stabilità genomica

3) Tessuto adiposo • Riduce l'accumulo di lipidi negli adipociti • Aumenta la sensibilità all'insulina

• Promuove la lipolisi 4) Invecchiamento

cellulare • Sopprime la replicazione di rDNA extracromosomici nel lievito • Mantiene la stabilità dei telomeri 5) Senescenza cellulare • Salva i fibroblasti embrionali di topo

• Deacetila e diminuisce l'attività trascrizionale della proteina p53 pro-apoptotica

6) Invecchiamento e

stress cardiaco • Protegge dallo stress ossidativo Promuove l'arresto del ciclo cellulare e la morte cellulare indotta da FoxO1 e FoxO3

7) Malattie

neurodegenerative • Ritarda la degenerazione assonaleProtegge contro la malattia di Alzheimer, la malattia di Huntington e la sclerosi laterale amiotrofica

8) Segnalazione infiammatoria in risposta allo stress ambientale

• Protegge contro l'infiammazione cronica

• Limita la durata della vita replicativa in risposta allo stress genotossico cronico

9) Effetti sullo sviluppo • Promuove efficienza ormonale • Modula la repressione trascrizionale 10) Effetti sulla

placenta • Promuove la sopravvivenza delle placente cellulariaumentando la resistenza al deficit di ossigeno

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4.4 L'effetto protettivo di Sirt1 nell'invecchiamento oculare

L'invecchiamento oculare è influenzato da vari fattori che si accumulano tra loro e come conseguenza determinano una disfunzione delle strutture oculari. Si ritiene che la causa fondamentale sia l'instabilità del DNA, che può essere indotta da fattori estrinseci (esposizione intensa alla luce, effetti delle radiazioni UV, stress ossidativo, malattie sistemiche) e da fattori intrinseci (anomalie genetiche, patologie sistemiche quali diabete ed ipertensione). L'interazione di questi fattori eziologici e ambientali durante l'invecchiamento determina l'insorgenza o il peggioramento di varie malattie oculari legate all'età.

Le Sirtuine, in particolar modo l'isoforma Sirt1, rivestono un ruolo cardine nella morfogenesi oculare e nella prevenzione di alcune malattie oculari. Tutte le Sirtuine sono espresse a livello oculare, tranne Sirt5 (Balaiya et al., 2017). L'isoforma Sirt1 è localizzata nel nucleo e nel citoplasma delle cellule di retina, iride, corpo ciliare, cornea e cellule epiteliali del cristallino (Figura 15).

Nella cornea, Sirt1 è localizzata nel nucleo e nel citoplasma delle cellule epiteliali corneali e nel nucleo dei cheratociti e delle cellule endoteliali corneali. Nel corpo ciliare, Sirt1 è localizzata principalmente nei nuclei delle cellule del processo ciliare, così come negli strati epiteliali ciliari pigmentati e non pigmentati. Nel cristallino di topo, Sirt1 è localizzata principalmente nei nuclei delle cellule epiteliali e delle fibre; nella retina di topo, Sirt1 è localizzata nei nuclei dell'epitelio del pigmento retinico (RPE) e nei melanociti, nonché nel citoplasma delle cellule endoteliali vascolari coroidali. L'mRNA di Sirt1 è stato rilevato anche nello strato nucleare esterno (ONL), nello strato nucleare interno (INL) e nello strato di cellule gangliari (GCL) della retina (Jaliffa et al., 2009). Nell'occhio umano, è stata rilevata l'espressione di Sirt1 nell'epitelio del cristallino di pazienti con cataratta senile (Zheng e Lu, 2011) e nella retina (Maloney et al., 2012).

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Sirt1 protegge le cellule della retina da danni legati allo stress ossidativo (Peng et al., 2010), dalla morte apoptotica della retina (Anekonda e Adamus, 2008) e anche da processi infiammatori (Shindler et al., 2007; Kubota et al., 2011). I topi adulti carenti di Sirt1 presentano molti difetti nello sviluppo fisiologico, in quanto alla nascita sono più piccoli del normale e di solito muoiono durante il primo periodo postnatale. I difetti morfologici sono presenti anche a livello oculare, poiché questi topi non riescono ad aprire uno o entrambi gli occhi e presentano gli strati di cellule retiniche più sottili rispetto che negli occhi normali, e gli strati nucleari interni ed esterni sono disorganizzati; anche i segmenti cellulari interni ed esterni dei fotorecettori sono difficili da rilevare. Sirt1 ha un ruolo importante nella morfogenesi oculare e, di conseguenza, nella longevità (Cheng et al., 2003).

Figura 15: Localizzazione di Sirt1 a livello oculare. Nella cornea, Sirt1 è localizzata nelle cellule epiteliali, nei cheratociti e nelle cellule endoteliali; nella retina, essa si trova nell'epitelio pigmentato retinico (RPE), nello strato nucleare esterno (ONL), nello strato nucleare interno (INL) e nello strato di cellule gangliari (GCL) (Mimura et al., 2013).

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Nella retinopatia diabetica, alcuni studi hanno documentato la presenza di alterazioni della vascolarizzazione retinica, tra cui l'aumento della permeabilità vascolare, la degenerazione dei capillari e la riduzione della densità vascolare. (Karbasforooshan e Karimi, 2018). I topi affetti da diabete che sovra esprimono Sirt1 sono protetti dallo sviluppo di capillari degenerativi e la struttura delle loro retine ha una normale densità vascolare; essi vengono quindi risparmiati dal danno neuronale retinico (Mishra et al., 2018).

Il diabete diminuisce la regolazione di Sirt1 in molti tessuti, tra cui la retina ed il rene; uno dei meccanismi implicati nella sua inattivazione è l'aumento dello stress ossidativo. Una diminuzione di Sirt1 aumenta l'iperglicemia nel diabete di tipo 2, contribuendo alla progressione della retinopatia diabetica (Jaliffa et al., 2009).

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4.5 Approcci per incrementare l'attività di Sirt1

I numerosi effetti protettivi che sono stati attribuiti a Sirt1 hanno portato alla ricerca di suoi potenziali attivatori: vista l’importanza di Sirt1 nella regolazione del metabolismo cellulare e il suo coinvolgimento in molti processi fisiologici, tra i quali l'invecchiamento, un grande interesse è rivolto alla scoperta di nuove sostanze che siano capaci di modulare e di mimare l’attività della stessa Sirt1. Tra i più noti attivatori di Sirt1 vi è il Resveratrolo (Figura 16).

Il Resveratrolo (3,5,4'-triidrossi-trans-stilbene) è un polifenolo presente negli acini di uva rossa e nel vino rosso, ed in piccole quantità anche in pistacchi, pomodori, arachidi e frutta secca. Quello che viene utilizzato nei prodotti salutistici è quasi sempre estratto dal Polygonum cuspidatum, che ne contiene elevate quantità (Lekli et al., 2010). Il Resveratrolo è uno dei metaboliti secondari più interessanti del fitocomplesso presente nella Vitis vinifera, e la sua scoperta è legata al “Paradosso francese”, un'analisi svolta negli anni '80 inerente alla correlazione tra la mortalità dovuta alla malattia coronarica e l'assunzione di grassi animali nella dieta. I campioni di popolazione studiati mostrarono la presenza di un legame diretto tra il consumo giornaliero di grassi animali e la mortalità. Tra tutti i Paesi esaminati, solo la Francia fornì dei risultati contrari a questa conclusione: nonostante l'elevato consumo di grassi animali nella loro dieta, i francesi facevano registrare il più basso tasso di mortalità dovuto alla malattia coronarica (Sun et al., 2002).

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L'elaborazione statistica del maggior consumo di vino in terra francese fece scaturire l'ipotesi che tale bevanda potesse controbilanciare gli effetti dell'elevata ingestione di grassi animali. Il passo successivo fu di ipotizzare che alla base del paradosso francese non vi fosse l'alcool, ma altre sostanze sempre presenti nel vino, non ancora oggetto di indagini approfondite: i polifenoli. Da quell'ipotesi (attualmente ritenuta “ingenua”), emerse il possibile contributo di un polifenolo presente quasi solo nel vino e nell'uva, il Resveratrolo, e di altre sostanze quali picetannolo, pterostilbene e piceide (Sun et al., 2002).

Oltre alle note proprietà antiossidanti, antinfiammatorie, cardioprotettive e neuroprotettive, il Resveratrolo è anche un forte attivatore naturale di Sirt1, che agisce in modo dose-dipendente mimandone le varie attività. Tuttavia, questi rinomati effetti anti-invecchiamento si osservano solo a dosi di Resveratrolo molto più elevate di quelle che possono riguardare il “Paradosso francese”: il consumo giornaliero di vino e alimenti consente un apporto non superiore a 5-10 mg/die. Inoltre il Resveratrolo, a differenza di quanto accade con i cibi funzionali, può avere effetti sia favorevoli che nocivi a seconda delle dosi impiegate (Straniero et al., 2010).

Nelle retine trattate con Resveratrolo si ha aumento di espressione del fattore BDNF (brain-derived neurotrophic factor, fattore neurotrofico di derivazione cerebrale) e dei suoi recettori. Il BDNF è una proteina presente nel cervello dei mammiferi appartenente alla famiglia delle neurotrofine, che è implicato nel differenziamento neuronale, nella formazione delle sinapsi e delle connessioni neuronali, nella neurogenesi del cervello adulto e nell'aumentato rapporto di crescita. Una riduzione del fattore BDNF è connessa alla riduzione della vista. Il Resveratrolo, stimolando Sirt1, esercita i suoi effetti neuroprotettivi legandosi ad alcuni promotori del fattore BDNF e ne aumenta l'espressione, promuovendo la sopravvivenza retinica (Wiciński et al., 2017)

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Il Resveratrolo è uno dei più potenti attivatori di Sirt1, nonostante abbia due aspetti negativi: una scarsa specificità d'azione ed una bassa biodisponibilità. Come agente farmacologico, infatti, il Resveratrolo ha un vasto numero di target che ne determinano una scarsa specificità d'azione; inoltre, presenta una bassa biodisponibilità a tal punto che le dosi richieste per attivare Sirt1 in vivo non vengono mai raggiunte, o si raggiungono solo per un breve intervallo. Da qui è nata la necessità di ricercare delle nuove molecole che incrementino l'attività di Sirt1 e superino i difetti presenti nel Resveratrolo (Figura 17). Di recente sono stati segnalati una serie di farmaci sperimentali, chiamati SRT (SRT1720, SRT2183, SRT1460), che risulterebbero importanti per l'attivazione di Sirt1 (Howitz et al., 2003; Pacholec et al., 2010; Dittenhafer-Reed et al., 2011). Sono molecole strutturalmente diverse e con un meccanismo d'azione mille volte più potente rispetto al Resveratrolo, ancora in corso di studio.

Figura 17: Confronto tra le strutture degli attivatori sintetici di Sirt1 (SRT 1720, SRT 2183, SRT 1460) e quella del Resveratrolo (Pacholec et al., 2010).

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5 CONCLUSIONI

Dall'inizio del secolo, la famiglia delle Sirtuine ha ricevuto interesse ed attenzione per il loro importante ruolo regolatorio principalmente a livello del metabolismo e nell'invecchiamento.

Nei mammiferi esistono sette isoforme di Sirtuine (Sirt1-Sirt7), che agiscono in vari compartimenti cellulari con differenti attività: deacetilano proteine e fattori di trascrizione, regolano il metabolismo dei grassi e del glucosio in risposta ai cambiamenti dei livelli di energia, agendo come regolatori dell'omeostasi e come protettori dallo stress ossidativo. Sirt1 è l'isoforma più caratterizzata tra le Sirtuine e può essere considerata un candidato appetibile per lo sviluppo di strategie terapeutiche volte a prevenire l'invecchiamento, comprendendo anche l'invecchiamento oculare. I dati disponibili indicano che Sirt1 è localizzata anche nel nucleo e nel citoplasma delle cellule che formano le strutture oculari, tra cui cornea, cristallino, iride, corpo ciliare e retina.

Molti studi sugli animali hanno dimostrato che Sirt1 regola l'invecchiamento oculare e la resistenza dei tessuti oculari allo stress ossidativo mediante la deacetilazione di proteine in modo NAD+-dipendente. Sirt1, ed eventuali suoi

attivatori, possono quindi avere un importante effetto protettivo a livello oculare e possono prevenire l'invecchiamento e le patologie ad esso annesse, quali AMD, uveiti, retinopatia diabetica e la sindrome dell'occhio secco.

Nonostante ciò, non è ancora chiaro se i dati sugli animali siano applicabili anche alle malattie oculari dell'uomo. Alcune prove di attivatori sintetici di Sirt1 sono già state iniziate per il trattamento di malattie cardiovascolari, nel diabete e in patologie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer. Future sperimentazioni cliniche dovrebbero concentrarsi sull'ulteriore definizione del ruolo di Sirt1 nell'invecchiamento oculare, con la speranza che possano fornire nuove terapie per attenuare tutti i cambiamenti associati all'età.

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