Mineralizzazione del follicolo pilifero nel barboncino

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Corso di Laurea Magistrale in Medicina Veterinaria

Mineralizzazione del follicolo pilifero nel

Candidato:

Buonamici Sharon

Anno Accademico 2015

Mineralizzazione del follicolo pilifero nel

barboncino

Relatore:

Prof.ssa Abramo Francesca Correlatore:

Dott. Miragliotta Vincenzo Controrelatore:

Dott.ssa Tognetti Rosalba

Anno Accademico 2015-2016

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Mineralizzazione del follicolo pilifero nel

Prof.ssa Abramo Francesca

Dott. Miragliotta Vincenzo Controrelatore:

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Indice

1. Riassunto (p. 3)

2. Introduzione(p.4)

2.1 Il follicolo pilifero

2.2 Il cane di razza Barbone

3. Mineralizzazione(p.24)

3.1 Cos’è, quando si presenta e come può essere

evidenziata

3.2 Sindrome di Cushing, importanza diagnostica della

mineralizzazione

3.3 Scopo della tesi

4. Materiali e Metodi (p.32)

5. Risultati(p.35)

5.1 Segnalamento

5.2 Indagine istopatologica

5.3 Indagine campioni Von Kossa

6. Discussione e Conclusioni(p. 61)

7. Bibliografia(p. 64)

8. Ringraziamenti(p. 66)

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1. Riassunto

Questo studio sperimentale si basa sull’osservazione di 107 preparati istologici provenienti da biopsie cutanee di cani di razza Barbone di età compresa tra 1 e 15 anni, con almeno 5 unità follicolari normali, colorati con ematossilina-eosina per verificare la presenza di granulosità basofile della parete follicolare riferibili a possibili depositi di calcio. Di questi 91 casi provengono da lembi di cute sana alla periferia di piccole lesioni nodulari di varia natura (infiammatoria, neoplastica, simil neoplastica) e 16 provengono da soggetti con presunta diagnosi di Cushing, questi ultimi sono stati utilizzati come controllo positivo in quanto la calcificazione della membrana basale dei follicoli è una delle lesioni istologiche caratteristiche di questa endocrinopatia. Tutti i preparati sono stati colorati con tecnica di Von Kossa al fine di mettere a confronto l’efficacia delle due metodologie. In aggiunta ai Barboni sono stati utilizzati anche 40 preparati provenienti da biopsie di cani di altre razze, per confronto. Le granulazioni basofile riscontrate all’EE non sempre hanno trovato conferma con la colorazione Von Kossa, non è possibile quindi confermarne la natura calcica. E’ possibile ipotizzare quindi che il materiale basofilo rappresenti una alterazione diversa dalla mineralizzazione o una alterazione molto precoce nella deposizione dei Sali di calcio, non sufficiente a determinare una reazione alla colorazione specifica di Von Kossa. La mineralizzazione follicolare nel barboncino è un’evenienza riscontrabile, in assenza di lesioni infiammatorie vicine, soprattutto oltre gli 8 anni di età. Degno di nota è stato il riscontro granulazioni basofile evidenti all’EE nel follicolo pilifero di 2 dei 6 Schnauzer inclusi nello studio; anche questa razza , come il Barbone, è considerata una razza a crescita continua del mantello.

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2.1 Il follicolo pilifero

Il follicolo pilifero è un annesso cutaneo presente nei soli Mammiferi, con funzioni molteplici: barriera fisica contro i traumi, protezione

UV, termoregolazione/isolamento termico, sensoriale, messaggio visivo (piloerezione come avvertimento), idrorepulsione, trattenere gli odori, fonte di cellule staminali (regione bulge) nella riepitelizzazione durante la guarigione delle ferite e in alcuni casi mimetismo. I cani, come tutti i carnivori, hanno follicoli piliferi composti, raggruppati in triplette con follicolo centrale primario e due follicoli laterali, ciascuno a sbocco indipendente, circondati da numerosi follicoli secondari.

primari, quello centrale, è il più grosso mentre gli altri peli primari sono più piccoli e posti lateralmente (F

Figura 1 Schema della composizione del follicolo pilifero nel cane

Ai peli primari sono sempre associate una ghiandola sebacea, una ghiandola sudoripara apocrina (paratrichiale, con sbocco nel follicolo pilifero) e un muscolo piloerettore. I peli secondari emergono da un poro comune, possono essere da 3 a 15

più sottile e una cuticola più spessa rispetto ai peli primari; i peli secondari costituenti la lanuggine (che possiamo ritrovare nel mantello dei cuccioli) non hanno midollo. I follicoli piliferi degli animali a pelo lis

2. Introduzione

2.1 Il follicolo pilifero

Il follicolo pilifero è un annesso cutaneo presente nei soli Mammiferi, con barriera fisica contro i traumi, protezione

UV, termoregolazione/isolamento termico, sensoriale, messaggio visivo (piloerezione come avvertimento), idrorepulsione, trattenere gli odori, fonte di cellule staminali (regione bulge) nella riepitelizzazione durante la te e in alcuni casi mimetismo. I cani, come tutti i carnivori, hanno follicoli piliferi composti, raggruppati in triplette con follicolo centrale primario e due follicoli laterali, ciascuno a sbocco indipendente, circondati da numerosi follicoli secondari.

primari, quello centrale, è il più grosso mentre gli altri peli primari sono più piccoli e posti lateralmente (Figura 1).

Schema della composizione del follicolo pilifero nel cane

Ai peli primari sono sempre associate una ghiandola sebacea, una ghiandola sudoripara apocrina (paratrichiale, con sbocco nel follicolo pilifero) e un muscolo piloerettore. I peli secondari emergono da un poro comune, possono essere da 3 a 15 (de Lahunta et al., 2013),presentano un midollo più sottile e una cuticola più spessa rispetto ai peli primari; i peli secondari costituenti la lanuggine (che possiamo ritrovare nel mantello dei cuccioli) non hanno midollo. I follicoli piliferi degli animali a pelo lis

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Il follicolo pilifero è un annesso cutaneo presente nei soli Mammiferi, con barriera fisica contro i traumi, protezione contro i raggi UV, termoregolazione/isolamento termico, sensoriale, messaggio visivo (piloerezione come avvertimento), idrorepulsione, trattenere gli odori, fonte di cellule staminali (regione bulge) nella riepitelizzazione durante la te e in alcuni casi mimetismo. I cani, come tutti i carnivori, hanno follicoli piliferi composti, raggruppati in triplette con follicolo centrale primario e due follicoli laterali, ciascuno a sbocco indipendente, circondati da numerosi follicoli secondari. Uno dei peli primari, quello centrale, è il più grosso mentre gli altri peli primari sono più

Ai peli primari sono sempre associate una ghiandola sebacea, una ghiandola sudoripara apocrina (paratrichiale, con sbocco nel follicolo pilifero) e un muscolo piloerettore. I peli secondari emergono da un poro comune, presentano un midollo più sottile e una cuticola più spessa rispetto ai peli primari; i peli secondari costituenti la lanuggine (che possiamo ritrovare nel mantello dei cuccioli) non hanno midollo. I follicoli piliferi degli animali a pelo liscio sono diritti,

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mentre quelli di animali a pelo riccio tendono ad essere spiralati (Muller & Kirk’s Small Animal Dermatology, 7th edition).

Il follicolo pilifero maturo è una struttura complessa composta da numerosi cilindri concentrici di cellule epiteliali, noti con il termine di “guaine”, che circondano il fusto del pelo. Anche se è di origine prevalentemente epiteliale, il follicolo contiene alla sua base un pool di cellule dermiche specializzate, che giocano un ruolo fondamentale nella sua formazione e nella regolazione dei successivi cicli di crescita postnatali. Poichè il follicolo pilifero è suscettibile di marcate variazioni strutturali e funzionali durante le varie fasi di accrescimento e solo infundibulo e istmo rappresentano delle fasi permanenti, lo studio della sua anatomia è possibile solo se si considera la fase di completa crescita (fase anagena). Durante questo periodo del ciclo di accrescimento sono infatti evidenziabili tutte le sue componenti strutturali, nelle altre fasi al contrario solo infundibulo e istmo rappresentano porzioni permanenti, rappresentate da: infundibulo (porzione sempre presente), istmo (porzione sempre presente), bulbo (porzione transitoria evidenziabile solo nella fase anagena di crescita), guaina epiteliale interna ed esterna, membrana basale, guaina fibroconnettiavle, papilla dermica e fusto pilifero (Figura 2).

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L’infundibolo è la parte superiore del follicolo pilifero che si estende dall’ostio follicolare fino allo sbocco del dotto escretore della ghiandola sebacea (o, secondo la teoria di Dunstan, fino al punto in cui inizia la cheratinizzazione tricolemmale). Anche se la parete della regione infundibolare ripete la sratificazione tipica dell’epidermide interfollicolare, recenti studi hanno dimostrato che la prima struttura dell’organismo a cheratinizzare è la regione infundibolare e che quindi quest’ultima non è

una semplice continuazione dell’epidermide ma una struttura

funzionalmente differente. La cheratinizzazione della parete follicolare in questa porzione avviene attraverso la formazione di granuli di cheratoialina intensamente basofili (Figura 3).

Figura 3. Istologia dell’infundibolo. Da: Abramo e Noli, 2009

L’istmo è la parte intermedia del follicolo pilifero che si estende dallo sbocco del dotto della ghiandola sebacea fino all’inserzione del muscolo pilo erettore. Nei cheratinociti della parete dell’istmo non sono presenti granuli di cheratoialina ma di tricoialina, intensamente eosinofili.

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Figura 4 Istologia della regione follicolare istmica. Da Abramo e Noli, 2009

La guaina epiteliale interna della radice (o dall’inglese “inner root sheath”) prende origine dalle porzioni profonde e laterali del bulbo sottostante e si estende a tappezzare la parte intermedia (istmo) del follicolo fornendo sostegno alla parte piu’ profonda del fusto pilifero. E’ costituita da uno strato interno, la cuticola, formata da un monostrato di cellule appiattite, con nucleo atrofizzato, embricate con lo strato di rivestimento del pelo, una parte intermedia, lo strato di di Huxley, formato da 3-4 strati cellulari e una parte esterna, un singolo strato di cellule anucleate, lo strato di Henle (Cunningham’s textbook of anathomy, 5th edition) . ). A partire dalla guaina di Henle e progressivamente attraverso la guaina di Huxley, si assite alla sintesi di granuli di tricoialina e di filamenti intermedi che si dispongono parallelamente all’asse del pelo formando il cemento fibro-amorfo. Il processo di corneificazione della porzione dell’istmo avviene per la presenza di transglutaminasi e di una peptidilarginina desaminasi, enzima che permette la conversione dell’arginina (amminoacido presente nei granuli di tricoialina) in citrullina (amminoacido estremamente raro). Per ulteriore attivazione di proteasi si assiste negli strati piu’ interni (cuticola) alla progressiva disintegrazione (che inizia dagli organuli) con liberazione del fusto pilare dalla parete follicolare. Dal momento che la guaina interna della radice cheratinizza e si disintegra quando raggiunge l'istmo, la sua funzione

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principale è quella di fissare il pelo alla sua base durante la fase anagena. Nella fase di arresto della crescita (fase telogena) il follicolo non presenta né guaina interna né segmento inferiore e il pelo è trattenuto fermamente grazie a un complesso specializzato di giunzioni fornito da un gruppo di cheratinociti a ciclo lento localizzati al di sotto della ghiandola sebacea.

La guaina epiteliale esterna della radice (dall’inglese “outer root sheath”) riveste esteriormente tutte le porzioni del follicolo pilifero. Nelle zone sovrastanti il bulbo la guaina è a contatto con la guaina interna ed è spessa per la presenza di citoplasma ampio e chiaro e granuli di glicogeno intracitoplasmatici. Nella regione dell’istmo non è più ricoperta dalla membrana interna, gli strati che la compongono sono più sottili e presentano un tipo di cheratinizzazione trichilemmale, mentre al di sopra (porzione infundibolare), l’epitelio inizia a sintetizzare granuli di cheratoialina assumendo l’aspetto tipico di un epitelio malpighiano.

Lo strato più interno di cellule della membrana esterna della radice è uno speciale monostrato localizzato subito a ridosso dello strato di Henle, il pattern di differenziazione cellulare e cheratinizzazione di questo strato interno è ultrastrutturalmente e immunoistochimicamente differente da quello delle cellule che compongono lo strato principale della stessa guaina; queste cellule si presentano distintamente appiattite. La guaina esterna della radice appoggia esternamente su altre due strutture: la membrana basale che è un prolungamento di quella epidermica, struttura anatomica continua particolarmente evidente, in quanto piu’ spessa, nella regione bulbare e la guaina fibroconnettivale, strato di tessuto connettivo denso con fibre che, nel terzo inferiore del follicolo, sono disposte in uno strato interno concentricamente e in uno esterno longitudinalmente; nella parte superiore il follicolo è rivestito solo da uno strato longitudinale di fibre collagene e numerose fibre elastiche.

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Figura 5 Rappresentazione schematica della porzione inferiore di un follicolo in fase anagen. Da Ackerman et al. 2005

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La papilla dermica è la porzione piu’ profonda del follicolo che si trova totalmente incapsulata dalle cellule matricali del bulbo, coperta da un sottile strato di membrana basale, e che appog

detto di Aaro Perkins. Pur essendo una continuazione del connettivo dermico e quindi costituita da fibroblasti e connettivo (mucopolisaccaridi e fibre collagene) se ne discosta qualitativamente per la presenza di scarse fibre collagene e per la presenza peculiare tra i mucopolisaccaridi di condroitina e condroitin solfato. La guaina interna della radice e il pelo crescono a partire da uno strato di cellule epiteliali nucleate rotondeggianti che coprono la papilla. Queste c

denominate cellule della matrice

differisce durante il ciclo follicolare, raggiungendo il volume massimo durante la fase anagena

coinvolta nel determinismo della dimensione del follicolo e

conseguentemente del fusto pilifero. Nel pelo in fase anagena il volume della papilla dermica è proporzionato al volume del pelo, poiché la papilla dermica si accresce grazie all’intensa at

fase e alla differenziazione cellulare che ne deriva per dare origine alle componenti follicolari(Tanaka 1998

Figura 7. Istologia del segmento inferiore con cellule della matrice e papilla dermica

La papilla dermica è la porzione piu’ profonda del follicolo che si trova totalmente incapsulata dalle cellule matricali del bulbo, coperta da un sottile strato di membrana basale, e che appoggia su un cuscinetto fibroelastico detto di Aaro Perkins. Pur essendo una continuazione del connettivo dermico e quindi costituita da fibroblasti e connettivo (mucopolisaccaridi e fibre collagene) se ne discosta qualitativamente per la presenza di scarse ibre collagene e per la presenza peculiare tra i mucopolisaccaridi di condroitina e condroitin solfato. La guaina interna della radice e il pelo crescono a partire da uno strato di cellule epiteliali nucleate rotondeggianti che coprono la papilla. Queste cellule spesso si presentano in mitosi e sono denominate cellule della matrice (Lavker 2003). La morfologia della papilla differisce durante il ciclo follicolare, raggiungendo il volume massimo durante la fase anagena e il minimo in quella telogena

conseguentemente del fusto pilifero. Nel pelo in fase anagena il volume della papilla dermica è proporzionato al volume del pelo, poiché la papilla dermica si accresce grazie all’intensa attività mitotica che caratterizza questa fase e alla differenziazione cellulare che ne deriva per dare origine alle

Tanaka 1998).

Figura 7. Istologia del segmento inferiore con cellule della matrice e papilla dermica

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La papilla dermica è la porzione piu’ profonda del follicolo che si trova totalmente incapsulata dalle cellule matricali del bulbo, coperta da un sottile gia su un cuscinetto fibroelastico detto di Aaro Perkins. Pur essendo una continuazione del connettivo dermico e quindi costituita da fibroblasti e connettivo (mucopolisaccaridi e fibre collagene) se ne discosta qualitativamente per la presenza di scarse ibre collagene e per la presenza peculiare tra i mucopolisaccaridi di condroitina e condroitin solfato. La guaina interna della radice e il pelo crescono a partire da uno strato di cellule epiteliali nucleate rotondeggianti ellule spesso si presentano in mitosi e sono La morfologia della papilla differisce durante il ciclo follicolare, raggiungendo il volume massimo e il minimo in quella telogena. Sembra essere

conseguentemente del fusto pilifero. Nel pelo in fase anagena il volume della papilla dermica è proporzionato al volume del pelo, poiché la papilla tività mitotica che caratterizza questa fase e alla differenziazione cellulare che ne deriva per dare origine alle

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Il fusto pilifero è’ costituito da 3 componenti che, a partire dall’interno sono rappresentati da midollare (che puo’ essere continua o discontinua a seconda del tipo di pelo), corteccia e cuticola. La

midollare

origina dalle cellule matricoli cuboidali presenti all’apice della papilla, cellule che organizzano in file longitudinali che si appiattiscono progressivamente, si caricano di granuli di glicogeno e tricoialina e in seguito si vacuolizzano. I vacuoli sono pieni di aria e conferiscono al pelo la leggerezza necessaria per il fenomeno dell’orripilizione. Le cellule della midollare possono contenere granuli di pigmento fini ed omogeneamente dispersi. La

corteccia, lo strato

intermedio,

è composta da cellule allungate completamente cheratinizzate con asse maggiore disposto parallelamente all’asse del pelo. Sintetizzano e accumulano cheratina e proteine di aggregazione specifiche che, grazie alla formazione di tenaci legami intercellulari, conferiscono le caratteristiche di resistenza al pelo. Queste cellule contengono il pigmento responsabile della colorazione del pelo; il pigmento può anche essere contenuto nel midollo, ma influisce in minor misura. La cuticola, lo strato più esterno, è formato da cellule piatte, corneificate e anucleate disposte come le tegole di un tetto, con il margine libero rivolto verso la sommità del pelo (Muller & Kirk’s Small Animal Dermatology, 7th edition).

Figura 8 Schema di un fusto pilifero

Il ciclo del follicolo pilifero nel cane

La crescita dei follicoli piliferi è ciclica per tutta la vita di un mammifero. Ciò richiede una stretta interazione tra epitelio e mesenchima, e l’intervento di numerosissimi fattori sia intrinseci che estrinseci, come fattori della

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crescita e citochine, ormoni, genetica, età, sesso, localizzazione intesa come regione del corpo, stimolazione neurologica, nutrizione, stato di salute, numerosi fattori ambientali (fotoperiodo, toelettatura e temperatura), sfregamento e traumi. Classicamente il ciclo del pelo consiste di tre fasi strettamente regolate di crescita (anagena), regressione (catagena) e quiescenza relativa (telogena), riconosciute dal punto di vista morfologico. Oggi se ne riconoscono almeno 5, sono state infatti aggiunte le fasi di exogen e kenogen.L’anagen è la fase di crescita durante la quale il follicolo dà origine al fusto.

La fase anagen è distinta in 6 sottofasi, le prime 4-5 di alta attività mitotica dei cheratinociti, la sesta invece è più differenziativa.

La fase catagen, fase di regressione relativamente rapida, è caratterizzata dall’arresto totale dell’attività mitotica dei melanociti e dei cheratinociti con un progressivo fenomeno di apoptosi nel segmento inferiore. Conseguenza dell’apoptosi dei cheratinociti è la risalita del follicolo verso la superficie, durante la quale il follicolo lascia dietro di sé una striscia fibrosa ("streamer"). La guaina epiteliale interna inizia a scomparire, quella esterna si assottiglia per formare il sacco epiteliale che avvolgerà le cellule del bulbo compresse a forma di “clava”. Contemporaneamente la papilla dermica, che rilascia i segnali chiave per l’induzione della sintesi del fusto del pelo, viene evaginata, ma resta ancora in profondità. Durante la fase catagena il pelo è ritenuto del follicolo.

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Figura 9 Raffigurazione del follicolo in fase

Alla fine della fase di involuzione il follicolo raggiunge le sue dimensioni più ridotte e viene considerato in stato di riposo o fase telogen.

la fase di riposo sia mitotico che differenziativo, in cui il fusto con il bulbo a clava è attaccato alla papilla dermica completamente risalita. La guaina epiteliale interna è scomparsa

è incluso in questa cherati

la papilla dermica rimane alla base del follicolo

corrisponde esattamente al tempo necessario affinché il nuovo anagen che lo rimpiazzerà attraversi le prime 5 sottofasi ed emerga in

momento del distacco del fusto. In realtà, il telogen è una fase virtuale proprio perché, mentre il pelo è in riposo, il follicolo è attivo per la formazione del nuovo pelo in anagen.

Raffigurazione del follicolo in fase catagen

Alla fine della fase di involuzione il follicolo raggiunge le sue dimensioni più ridotte e viene considerato in stato di riposo o fase telogen.

di riposo sia mitotico che differenziativo, in cui il fusto con il bulbo a clava è attaccato alla papilla dermica completamente risalita. La guaina epiteliale interna è scomparsa e sostituita da cheratina trichilemmale, il pelo è incluso in questa cheratina, il bulbo è ancora aderente al follicolo

la papilla dermica rimane alla base del follicolo. La durata del telogen corrisponde esattamente al tempo necessario affinché il nuovo anagen che lo rimpiazzerà attraversi le prime 5 sottofasi ed emerga in

momento del distacco del fusto. In realtà, il telogen è una fase virtuale proprio perché, mentre il pelo è in riposo, il follicolo è attivo per la formazione del nuovo pelo in anagen.

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Alla fine della fase di involuzione il follicolo raggiunge le sue dimensioni più ridotte e viene considerato in stato di riposo o fase telogen. La fase telogen è di riposo sia mitotico che differenziativo, in cui il fusto con il bulbo a clava è attaccato alla papilla dermica completamente risalita. La guaina e sostituita da cheratina trichilemmale, il pelo il bulbo è ancora aderente al follicolo mentre . La durata del telogen corrisponde esattamente al tempo necessario affinché il nuovo anagen che lo rimpiazzerà attraversi le prime 5 sottofasi ed emerga in superficie al momento del distacco del fusto. In realtà, il telogen è una fase virtuale proprio perché, mentre il pelo è in riposo, il follicolo è attivo per la

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Figura 10 Riassorbimento delle guaine del segmento infe

Dopo un tempo variabile in telogen avviene l’attivazione di una nuova fase anagena attraverso l’attivazione delle cellule staminali, probabilmente in risposta ai segnali di induzione provenienti dalla papilla dermica e mesenchima che la circonda

entra nuovamente nella fase di crescita (anagena) che è caratterizzata da proliferazione e differenziazione attiva dei cheratinociti. La porzione precedentemente involuta del follico

sintetizzato un nuovo pelo

Recentemente la caduta del fusto del pelo è stata descritta come una quarta fase distinta del ciclo, denominata

parte finale della fase telogen; il distacco del pelo dalle guaine follicolari e la sua caduta è imputabile all'azione di enzimi proteolitici, che all’inizio dell’exogen non agiscono a causa di una massiccia espressione di geni che

Riassorbimento delle guaine del segmento inferiore e risalita del fusto pilifero

Dopo un tempo variabile in telogen avviene l’attivazione di una nuova fase anagena attraverso l’attivazione delle cellule staminali, probabilmente in risposta ai segnali di induzione provenienti dalla papilla dermica e mesenchima che la circonda (Geyfman et al. 2015). Il follicolo dunque entra nuovamente nella fase di crescita (anagena) che è caratterizzata da proliferazione e differenziazione attiva dei cheratinociti. La porzione precedentemente involuta del follicolo pilifero viene ricostruita e viene sintetizzato un nuovo pelo(Muntener et al. 2011).

Recentemente la caduta del fusto del pelo è stata descritta come una quarta fase distinta del ciclo, denominata exogen e localizzata temporalmente nella ella fase telogen; il distacco del pelo dalle guaine follicolari e la sua caduta è imputabile all'azione di enzimi proteolitici, che all’inizio dell’exogen non agiscono a causa di una massiccia espressione di geni che

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riore e risalita del fusto pilifero

Dopo un tempo variabile in telogen avviene l’attivazione di una nuova fase anagena attraverso l’attivazione delle cellule staminali, probabilmente in risposta ai segnali di induzione provenienti dalla papilla dermica e dal Il follicolo dunque entra nuovamente nella fase di crescita (anagena) che è caratterizzata da proliferazione e differenziazione attiva dei cheratinociti. La porzione lo pilifero viene ricostruita e viene

Recentemente la caduta del fusto del pelo è stata descritta come una quarta e localizzata temporalmente nella ella fase telogen; il distacco del pelo dalle guaine follicolari e la sua caduta è imputabile all'azione di enzimi proteolitici, che all’inizio dell’exogen non agiscono a causa di una massiccia espressione di geni che

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codificano per inibitori delle proteasi. Questi inibitori decrescono in seguito all’apoptosi conseguente al completamento della differenziazione dei cheratinociti (Milner et al. 2002) e degradano le desmogleine, glicoproteine transmembrana dei desmosomi, deputate al mantenimento in situ del pelo in fase telogena(Koch et al. 1998) .

Nell’uomo viene descritta una ulteriore fase, la teloptosi , che rappresenta in realtà un momento isolato in cui il pelo viene allontanato dal follicolo e cade.

Ancora più di recente si pone invece l’individuazione di una nuova fase del ciclo, fase che segue il riposo follicolare fisiologico, prima che venga rimpiazzato da parte di un nuovo anagen, ma durante la quale il fusto pilifero è assente ovvero il follicolo rimane vuoto per un determinato intervallo di tempo; questa nuova fase è stata denominata kenogen(Guarrera 2011).Il kenogen è fenomeno fisiologico ma è più accentuato (più duraturo e frequente) nell’alopecia androgenetica umana, nella quale potrebbe giocare un ruolo patogenetico (Rebora et al. 2006).

La morfologia così come il susseguirsi delle fasi del ciclo risultano simili nelle differenti specie di mammiferi. Per la presenza di follicoli composti nel cane i singoli follicoli che compongono le unità hanno un ciclo indipendente gli uni dagli altri presentando dunque un pattern di crescita definito “a mosaico”.

Nella maggior parte delle razze il mantello subisce dei cambiamenti rispondenti al fotoperiodo, traducibili con un aumento della perdita del pelo nel fotoperiodo lungo e una maggior densità del mantello nel fotoperiodo corto; la perdita anche di ingenti quantità di pelo correlata alla stagione viene definita

muta

e avviene in due periodi dell’anno con dinamiche e risultati differenti: nel periodo primaverile avviene la muta principale, che porta a un alleggerimento del mantello, mentre nel periodo autunnale avviene una muta più modesta dovuta a un’accelerazione dei processi produttivi del pelo per cui alcuni vengono “rinnovati”, quest’ultima porta alla formazione di un mantello più denso. L'attività follicolare e quindi il tasso di crescita è massimo in estate e minimo in inverno. Per esempio più

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del 50% dei follicoli piliferi possono essere in fase telogena durante il periodo estivo, ma questa percentuale può arrivare al 90% in inverno. I peli in fase catagena costituiscono sempre una piccola percentuale del totale, di solito attorno al 4-7% (Muller & Kirk’s Small Animal Dermatology, 7th edition). L’ambiente domestico può influire su questo tasso, molti cani esposti a diverse ore di luce artificiale perdono pelo anche profusamente per tutto l'anno. Oltre ai cambiamenti stagionali esistono grandi differenze tra le varie razze di cane soprattutto riguardo la durata delle fasi anagen e telogen (Muller & Kirk’s Small Animal Dermatology, 7th edition).

Nell’uomo così come negli animali i peli crescono fino a raggiungere una lunghezza predefinita, che varia a seconda della regione del corpo ed è determinata geneticamente, dopodichè i follicoli entrano in una fase di riposo, che può durare per un tempo considerevole. Per ogni regione del corpo la lunghezza definitiva del pelo è predeterminata, oltre quella lunghezza il pelo non cresce più. Questo fenomeno è alla base della distintiva lunghezza del mantello di varie razze ed è determinata geneticamente (Muller & Kirk’s Small Animal Dermatology, 7th edition). Poichè il pelo è costituito prevalentemente da proteine, l'alimentazione ha un importante effetto sulla sua quantità e sulla qualità del mantello. Un'alimentazione inadeguata può provocare un mantello opaco, secco, fragile o sottile con o senza alterazioni della pigmentazione. In condizioni di malattia o patologie generalizzate la fase anagen può accorciarsi considerevolmente; di conseguenza una grande percentuale di peli si ritroveranno al tempo stesso in fase telogena. Poichè in questa fase il pelo tende ad essere perso più facilmente, l'animale può perdere eccessivamente pelo. Gli stati di malattia possono inoltre inficiare la formazione della cuticola del pelo, che porta il pelo ad essere spento e opaco. Malattie gravi o stress sistemico possono provocare la telogenizzazione contemporanea di molte unità follicolari. La perdita di questi peli (effluvio telogen) spesso porta a un visibile diradamento del mantello o una vera e propria alopecia. Il ciclo follicolare e il mantello sono anche influenzati dai cambiamenti ormonali. Generalmente la fase anagen è indotta e stimolata e il tasso di

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crescita pilifero aumenta grazie a ormoni tiroidei e della crescita. Al contrario un eccesso di glucocorticoidi o estrogeni inibisce la fase anagena e sopprime il tasso di crescita pilifero. Si pensa che le cellule della papilla dermica, che sono la componente mesenchimale del follicolo pilifero, giochino un ruolo fondamentale nell'induzione della differenziazione epiteliale. Queste cellule sono morfologicamente e funzionalmente differenziate dai fibroblasti del derma e si pensa siano il bersaglio primario di risposta agli ormoni e medino il segnale di stimolo della crescita alle cellule epiteliali follicolari. I fattori che controllano il ciclo follicolare sono generalmente differenti dai fattori che controllano la struttura follicolare. Alterazioni dei fattori che regolano il ciclo follicolare (per esempio ormoni) provocano atrofia follicolare. Alterazioni dei fattori che regolano la struttura follicolare (per esempio morfogenetici) provocano displasia follicolare (Muller & Kirk’s Small Animal Dermatology, 7th edition).

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2.2 Il cane di razza Barbone

Il Barbone (o barboncino nelle sue varianti nana e toy) è una razza antica di origine incerta che in Francia ha avuto un grande successo e una conseguente minuziosa selezione. Le fonti concordano che derivi da un cane d’acqua (quindi utilizzato per la caccia alle anatre) oggi estinto chiamato Barbet (ENCI. Libro Genealogico Barboni). Ne compaiono le prime citazioni in letteratura già a partire dal Seicento, nelle quali viene descritto come cane da lavoroe denominato

Caniche

(da canard=anatra selvatica in francese). Oggigiorno è classificato come cane da compagnia e ne esistono 4 varianti di taglia, ossia grande (o gigante, dai 45 ai 60-62 cm al garrese), medio (dai 35 ai 45 cm al garrese), nano (dai 28 ai 35 cm al garrese) e toy (dai 23-24 ai 28 cm al garrese). Per quanto riguarda il mantello, esistono due varianti: pelo riccio e pelo cordato (raro); in entrambi i casi il pelo è abbondante, di tessitura fine e lanosa (FCI Standard No 172/18.04.2007).

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Per il riccio inoltre la tessitura deve essere ben arricciata, elastica e resistente alla pressione della mano e il mantello spesso, fitto, di lunghezza uniforme e a formare riccioli regolari.

Figura 12 Barbone bianco variante cordata

Per il cordato invece deve formare corde sottili molto palesi di almeno 20 cm di lunghezza.

I colori ammessi sono solo monocolore bianco, nero, marrone, grigio, rosso fulvo e albicocca (FCI Standard 172; ENCI Libro Genealogico Barbone).

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Figura 6 Barbone riccio fulvo

Caratteristiche tipiche del Barbone rilevate da esperti nel settore dell’allevamento e della toilettatura dei cani, ma in assenza di studi scientifici condotti, sono di non avere sottopelo e non presentare un periodo di muta. Il pelo è a crescita continua e necessita di periodiche tosature e toelettatura molto frequente, perché i peli che cadono non vengono dispersi nell’ambiente ma restano intrecciati nel mantello. Per queste caratteristiche la razza è prediletta da persone con problemi di allergie al pelo del cane. Questa conformazione è molto rara e si riscontra in poche altre razze di cane non molto diffuse, ad esempio il Lagotto Romagnolo, il Pumi e il Bedlington Terrier. Gli studi svolti sui geni responsabili della conformazione del mantello dei cani hanno rilevato che tre sono i geni le cui possibili variazioni e combinazioni danno origine a tutte le tipologie conosciute(Cadieu et al. 2009). I geni coinvolti sono FGF5, RSPO2 e KRT71.

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 FGF5 presenta due loci che influenzano la lunghezza del mantello in rapporto di epistasi dominante (ossia l'espressione di un allele dominante nel locus epistatico può mascherare il genotipo espresso dall'altro locus), e codificaun ligando endogeno della famiglia delle chinasi, il fibroblast growth factor–5 (Dierks et al. 2013; Housley et al. 2006).

 KRT71 codifica per una cheratina di tipo II, la keratin-71 e determina la ricciutezza del pelo (Harel et al. 2012); è studiata anche nella specie umana per la correlazione tra il “pelo lanoso” e l’ipotricosi (Fujimoto et al. 2012) .

 RSPO2 codifica per una proteina, la R-spondin–2 ( che viene secreta dalle cellule e attiva la cascata Wnt- βcatenin, che a sua volta a livello del follicolo pilifero attiva le cellule staminali del bulbo, ne provoca l’entrata nella localizzazione fisiologica e recluta le cellule dal compartimento della matrice di crescita) ed è associato alla tessitura ondulata e al pattern di crescita (Clevers. 2006; Parker et al. 2010; Kazanskaya et al. 2004).

Questi tre geni rispetto all'assetto genotipico ancestrale codificante per il fenotipo di mantello corto sono mutati in razze la cui selezione genetica ha portato al fenotipo mantello lungo, riccio e baffuto tipico del Barbone(Cadieu et al. 2009).

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22 .Fenotipo FGF5 RSPO2 KRT71 Corto - - - Ondulato - + - Ondulato e riccio - + + Lungo + - -

Lungo con baffi + + -

Riccio - - +

Riccio con baffi + + +

Tabella 1: tipi di mantello in relazione all’espressione dei geni FGF5,RSPO2 e KRT71. Cadieu et al.2009.

Esistono altre classificazioni delle diverse tipologie di mantello riscontrabili nella specie canina, ma nessuna “ufficiale”. Nei testi di dermatologia veterinaria solitamente la classificazione si limita a prendere in considerazione la lunghezza (normale, corto e lungo) e poi classificare in sottotipi. Il fenotipo normale non ha sottotipi, coincide con il fenotipo ancestrale rilevabile nel pastore tedesco e corrisponde a una lunghezza intermedia. Il corto ha due sottotipi, ossia grossolano (molti peli primari e pochi secondari, come nel Rottweiler) e sottile (pelo molto denso con numerosi peli secondari, come nel Boxer). Il lungo ha anch'esso due sottotipi, ossia sottile (come nel Cocker) e lanoso (come nel Barbone)(Muller & Kirk’s Small Animal Dermatology, 7th edition; Pathel et al. 2008). Molto più completa è invece la classificazione “Coat type” proposta da Muntener et al. nel 2012, basata oltre che sull'aspetto macroscopico del mantello anche sul pattern di crescita e le caratteristiche riscontrabili istologicamente.

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Il barboncino rientra nel “Coat type 7”, ossia l'anagen dominated per la caratteristica crescita continua del mantello e l'assenza di un periodo di muta percepibile in questa razza. In virtù delle caratteristiche precedentemente citate, a differenza delle altre specie, l'assenza di peli in fase anagen nel tricogramma di un Barbone deve sempre far sospettare disordini nel ciclo pilifero (Pathel et al. 2008). Se si escludono le endocrinopatie i disordini del ciclo pilifero nel Barbone, sono infrequentemente cause di alopecia(Pathel et al. 2008).

Coat type Descrizione 1 Normale 2 Corto sottile 3 Lungo sottile 4 Plush coated 5 Riccio

6 Lungo, sottopelo fitto

7 Anagen dominated

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3. Mineralizzazione

3.1 Cos’è, quando si presenta e come può essere evidenziata

La mineralizzazione è un processo fisiologico nel tessuto osseo e nei denti ed è definibile come un deposito di ioni inorganici in gran parte costituiti da calcio; in alcuni casi la mineralizzazione, definita patologica, può interessare anche i tessuti molli. Nella patogenesi si ipotizza un anomalo aumento dei livelli di fosfato di calcio nei mitocondri che porta a depositi di cristalli e morte delle cellule (Walsh et al. 1995) . Le calcificazioni patologiche possono essere classificate in quattro categorie principali a seconda delle cause:

distrofiche

,

metastatiche

,

iatrogene

o

idiopatiche

.

Le

calcificazioni distrofiche

sono depositi di sali di calcio in tessuti danneggiati, degenerati o morti e possono riguardare aree localizzate o aree estese. Nel caso di aree localizzate le cause possono essere lesioni infiammatorie sia di natura infettiva/parassitaria tipo tubercolosi, demodicosi e pododermatite stafilococcica, che non infettiva come nel caso di granulomi da corpo estraneo; le lesioni estese sono invece riconducibili a ipercortisolemia (derivante da altre patologie o iatrogena), diabete mellito, penetrazione percutanea di calcio o infezioni micotiche sistemiche; anche la calcinosis universalis descritta nell’uomo viene considerata una calcificazione distrofica estesa.

Le

calcificazioni metastatiche

sono depositi di sali di calcio associati a metabolismo anormale di calcio e fosforo con alterazioni dimostrabili dei livelli sierici, come nell'insufficienza renale cronica.

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Le

calcificazioni iatrogene

sono effetti collaterali di terapie, nelle quali calcio e fosforo vengono introdotti con la procedura medica sia inavvertitamente che per la natura della terapia stessa (Sawke et al. 2016).

Le

calcificazioni idiopatiche

infine sono depositi di calcio senza danni tissutali apprezzabili o difetti metabolici dimostrabili e di cui in generale non si conosce la causa; possono essere anch'esse localizzate (calcinosis circumscripta idiopatica dei cani di razza grande) o estese (calcinosis universalis idiopatica del cane giovane)(Muller & Kirk’s Small Animal Dermatology, 7th edition).

Indipendentemente dalla causa a livello macroscopico le mineralizzazioni si presentano come placche o noduli ricoperti da cute, duri, rosei o biancastri, gessosi, con tendenza ad ulcerare. Il sezionamento è agevole, il materiale è di tipo gessoso e pertanto non stride al taglio. Solo nei casi in cui la calcificazione è avanzata e si sono instaurati dei fenomeni di metaplasia ossea la lama del tagliente può “stridere” o “grattare”. Una volta processato il campione e sottoposto a sezionamento con il microtomo è possibile che la lama possa stridere. Istologicamente queste lesioni sono di colore blu scuro all'ematossilina-eosina per la grande affinità con il colorante basico, l'ematossilina e hanno margini frastagliati. La natura calficica delle lesioni può essere dimostrata con colorazioni specifiche e tra queste il metodo Von Kossa è quello più utilizzato. Si tratta di una impregnazione argentica in corso della quale si ha la fissazione da parte dei sali di calcio dell’argento metallico ottenuto per riduzione dal nitrato mediante esposizione alla luce solare o ultravioletta. La colorazione con l'alizarina rosso S che invece è indicato per evidenziare piccole quantità di calcio, con il quale il colorante forma dei complessi grazie a un processo di chelazione; i depositi si presentano come cristalli birifrangenti rosso arancio (Pernick 2015).

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26

3.2 Sindrome di Cushing e importanza diagnostica della

mineralizzazione

La Sindrome di Cushing o iperadrenocorticismo è una malattia ormonale comune nel cane e molto rara nel gatto. Con il termine sindrome di Cushing si intende una serie di sintomi clinici, cutanei e sistemici, legati all’aumento cronico di cortisolo in circolo. La causa dell’ipercortisolemia può essere spontanea, cioè legata ad una neoplasia del surrene

(iperadrenocorticismo primario, 15% dei casi) o ipofisaria

(iperadrenocorticismo secondario, 85% dei casi), o può essere di natura iatrogena in seguito alla somministrazione esogena di cortisonici. Raramente l’iperadrenocorticismo consegue ad una iperplasia ipofisaria (non neoplastica) e in rarissimi casi è possibile osservare sia una duplice sede neoplastica (ipofisaria e surrenalica) sia una neoplasia surrenalica bilaterale. Nel cane viene riscontrata solitamente in età adulta-anziana. Le razze di

piccola taglia sembrano essere maggiormente affette da

iperadrenocorticismo ipofisario, come accade per esempio nel Barboncino, nel Bassotto e nello Yorkshire, mentre le razze di taglia grande e gigante, come Boxer, Pastore tedesco e dei Pirenei, sono più frequentemente interessate da una neoplasia surrenalica (Abramo et al. 2009).

Tralasciando gli innumerevoli sintomi sistemici di pertinenza della medicina interna, i cani con iperadrenocorticismo possono essere sottoposti a visita clinica per una serie di lesioni cutanee più o meno caratteristiche. Le manifestazioni dermatologiche sono molteplici e possono presentarsi singolarmente o in associazione tra loro. Tra i sintomi dermatologici più frequenti ritroviamo: alopecia simmetrica e diffusa non infiammatoria che interessa tutto il tronco e che solitamente risparmia le estremità, cute addominale atrofica di consistenza ipoelastica e tanto sottile da far apprezzare la trama vascolare dermica sottostante, comedoni di grandi dimensioni per lo più localizzati all’addome ed intorno ai capezzoli, iperpigmentazione a macchie o diffusa, papule, placche, noduli ed ulcere legate al deposito di sali di calcio (calcinosis cutis). Come accennato, la cute

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addominale dei cani con iperadrenocorticismo diventa sottilissima ed ipoelastica e per questo motivo, se la si solleva in plica e si esercita un contemporaneo movimento di rotazione, essa resta sollevata ed arricciata; questo segno clinico è molto suggestivo di iperadrenocorticismo. I comedoni in corso di iperadrenocorticismo hanno forma e dimensioni diverse da quelli osservabili in altre malattie: l’atrofia dell’epidermide che riveste il follicolo rende quest’ultimo meno resistente alla quantità di materiale cheratinico che tende ad accumularsi nel lume follicolare fino a deformarne la silhouette; per questo motivo i comedoni sono molto larghi e asimmetrici ed in alcuni casi possono trasformarsi in vere e proprie dilatazioni cistiche (milia), soprattutto in aree con cute normalmente molto sottile come le ascelle e inguine. Altri segni clinici associati sono l’addome pendulo legato alla ptosi dei muscoli addominali che conferisce una caratteristica silhouette definita “cushingoide” (anche detta “addome a botte”) e la presenza di accumuli di tessuto adiposo nella regione lombare in seguito alla ridistribuzione dei grassi (Abramo et al. 2009).

In presenza di alopecia simmetrica del tronco devono essere escluse le altre endocrinopatie (ipotiroidismo, neoplasie gonadiche e alopecia X) e le displasie follicolari. La presenza di comedoni deve far escludere la demodicosi che è spesso associata all’iperadrenocorticismo. La calcinosi cutanea è un sintomo molto suggestivo di iperadrenocorticismo, ma in sua presenza devono comunque essere escluse le malattie che alterano il metabolismo di calcio e fosforo e che possono causare mineralizzazione della cute. La presenza di sintomi sistemici caratteristici quali poliuria, polidipsia e polifagia sono di notevole aiuto al clinico soprattutto in presenza di lesioni dermatologiche aspecifiche.

All’esame microscopio del pelo è comune osservare la quasi totalità dei bulbi in fase telogena; questa condizione è spiegabile se si considerano gli effetti catabolici dell’eccesso di cortisolo sul ciclo follicolare che si manifestano attraverso l’inibizione della follicolare fase anagena. Purtroppo questa condizione non è patognomonica di iperadrenocorticismo in quanto presente in tutte le endocrinopatie ed in numerose displasie, ma il suo

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28

riscontro può contribuire ad orientare il sospetto clinico; gli esami del sangue e delle urine sono di importanza fondamentale per ottenere un quadro più completo.

E’ possibile ottenere una diagnosi definitiva mediante la valutazione della funzionalità surrenalica che consente di diagnosticare la malattia ma non di individuarne la causa e la sede anatomica. A tale scopo si deve ricorrere al test di soppressione ad alte dosi o ad esami di diagnostica per immagini.

Non esistono quadri citologici suggestivi di iperadrenocorticismo ed i rilievi si limitano alle complicazioni secondarie, quali le piodermiti o le infezioni da

Malassezia

. Nei casi in cui si individuano aree di calcinosi cutanea l’agoaspirazione può fornire quadri rappresentati da materiale cristallino rifrangente circondato e talora fagocitato da macrofagi.

Le lesioni che maggiormente suggeriscono la presenza della malattia e che si devono preferire per l’esecuzione di una biopsia, sono l’atrofia cutanea e la calcinosi

.

A piccolo ingrandimento, il quadro dermatopatologico è caratterizzato da derma spesso assottigliato senza infiltrato infiammatorio e telogenizzazione diffusa dei follicoli. Nelle forme complicate il quadro è meno specifico in quanto si osserva iperplasia e infiltrato infiammatorio ma, nonostante ciò, la telogenizzazione diffusa dei follicoli consente di sospettare una endocrinopatia. L’epidermide è atrofica e pertanto ridotta ad un unico strato di cheratinociti nucleati (aspetto fortemente diagnostico) o di spessore normale; in entrambi i casi si osserva una sproporzionata cheratosi ortocheratosica “a canestro”. Nel derma non si rileva infiltrato infiammatorio; può essere presente assottigliamento per riduzione di numero e spessore dei fasci di collagene (aspetto difficile da accertare e che può dipendere dalla diversa localizzazione anatomica). In casi di calcinosi cutanea si osservano materiale granulare intensamente basofilo e strutture cristalline riferibili a deposizione di sali di calcio sulle fibre collagene. Dal momento che i depositi minerali fungono da corpo estraneo spesso si osserva reazione macrofagica con cellule giganti alla loro periferia. Può essere rilevata eliminazione transepidermica e transfollicolare di sali di

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calcio il più delle volte accompagnata da iperplasia delle strutture coinvolte. In rari casi, in associazione alla riduzione di spessore del derma, si osservano piccole strutture vasali ectasiche (flebectasie). I follicoli sono tutti in arresto di crescita, in fase telogen e pertanto localizzati in modo caratteristico nella porzione più superficiale del derma. Gli infundibuli sono dilatati, cheratosici e, analogamente all’epidermide, la loro parete può essere atrofica e pertanto costituita da un unico strato di cheratinociti (l’atrofia è più facilmente apprezzabile nella parete follicolare). Alcuni infundibuli sono marcatamente dilatati (comedoni) e contengono abbondante materiale cherato-seborroico. Può essere presente calcificazione della membrana basale dei follicoli, reperto fortemente diagnostico di iperadrenocorticismo. Le ghiandole sebacee sono atrofiche (Abramo et al. 2009) .

Per quanto riguarda il barboncino però è stato riscontrato che la calcificazione della parete follicolare può comparire anche in assenza di ipercortisolemia e soprattutto in assenza di problematiche dermatologiche quali l'alopecia, quindi è stato ipotizzato che possa esserre un riscontro normale nel barboncino, in particolare nei soggetti anziani(Seaman et al. 1984) Queste mineralizzazioni risultano localizzate nella membrana basale del follicolo pilifero, sono di aspetto granuloso e intensamente colorate di blu all'ematossilina-eosina, nere al Von Kossa e blu brillante al Prussian Blue(Seaman et al. 1984). Altri autori lo riscontrano anche nel Bedlington Terrier anziano (fonte Muller & Kirk's Small Animal Dermatology), che come conformazione del mantello risulta molto simile al barboncino. La segnalazione di Seaman del 1984 non è stata seguita negli anni da ulteriori approfondimenti. Altri spunti in letteratura veterinaria derivano da studi sulla mineralizzazione del follicolo pilifero in cavie alle quali venivano indotte lesioni cutanee: se le lesioni indotte erano severe (ad esempio provocate dallo strizzamento di un lembo di pelle con pinza emostatica) potevano portare a calcificazioni distrofiche cutanee, se queste erano più blande (ad esempio un semplice pizzicotto) portavano alla sola mineralizzazione della membrana vitrea follicolare(Pierce et al. 1971).E’ stato dimostrato che i follicoli piliferi delle cavie contengono enzimi

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proteolitici concentrati nella matrice e nella membrana basale e in caso di danneggiamento questi vengono liberate, ma non modificano le proteine precheratiniche del follicolo, né si forma un nucleatore (sostanza proteica capace di fungere da starter per il processo di mineralizzazione) attivo a partire da un precursore inattivo (Pierce et al. 1973)come precedentemente sospettato; gli autori perciò proponevano due ipotesi: che il danneggiamento alterasse le barriere di diffusione del follicolo, permettendo a nucleatori già presenti di indurre la formazione di minerali, oppure che portasse alla rimozione o alla modificazione di una sostanza che in condizioni di normalità fungesse da inibitore (Pierce et al. 1973).

In un altro studio del 2011, su preparati istologici ottenuti da cute sana di ratto (

Rattus

norvegicus

) sono state condotte ricerche sulla immunolocalizzazione di due proteine, la DSP (Dentin-sialoprotein) e la PP (Phosphophoryn), due costituenti responsabili della mineralizzazione dei denti che sono risultati presenti anche nei follicoli piliferi (Tang et al. 2011) e che potrebbero dunque svolgere il ruolo di nucleatore proposto dallo studio precedente.

3.3 Scopo della tesi

Lo scopo di questa tesi è di verificare la presenza di depositi di calcio nella parete dei follicoli piliferi nel cane di razza Barbone in aree cutanee normali, in diverse classi di età rappresentative di soggetti giovani, adulti e anziani.. Le osservazioni saranno estese anche a preparati istologici cutanei provenienti da altre razze diverse dalle razze Anagen-dominated per valutare se questi depositi siano effettivamente una caratteristica della razza Barbone o possano interessare anche altre razze con diverse tipologie di mantello. Lo studio da noi condotto comparerà inoltre l’efficacia di due colorazioni istochimiche per il rilievo della mineralizzazione, l’ematossilina-eosina e il

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Von Kossa, al fine di verificare la sensibilità e la specificità di queste due metodologie e permettere di poter stabilire se i depositi colorati di blu intenso ed aspetto granulare localizzati nella membrana vitrea del follicolo pilifero risultano sempre ed effettivamente contenere del calcio. L’identificazione di depositi di calcio nella parete follicolare è un rilievo patognomonico in corso di Cushing e la presenza fisiologica della mineralizzazione nei follicoli in una razza anagen-dominated come il Barbone, predisposto allo sviluppo di questa malattia, potrebbe generare incertezza diagnostica.

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4. Materiali e Metodi

Per questa tesi sono state esaminate 371 biopsie cutanee di cani di razza Barbone. I campioni provengono da materiale archiviato nel database di Diagnostica Dermatologica del Dipartimento di Scienze Veterinarie dell’Università di Pisa. In una prima fase si è proceduto alla revisione dei 371 preparati istologici: questi preparati erano stati inviati per accertamento diagnostico per problemi dermatologici di natura neoplastica e simil-neoplastica nei cani di razza Barbone. Tra le diagnosi formulate vi erano neoplasie mammarie, neoplasie delle ghiandole perianali, neoplasie nodulari cutanee di diversa natura, lesioni infiammatorie focali e lesioni amartomatose e cistiche. Da questi preparati sono stati selezionati i casi con lesioni piccole, ben circoscritte comprensive alla loro periferia di lembi di cute sana nel contesto della quale si individuavano almeno 5 unità follicolari normali. A questi casi sono stati aggiunti anche quei campioni di cute di cani di razza Barbone per i quali era stata formulata una diagnosi di dermatosi atrofica compatibile con endocrinopatia.

Inoltre, sono stati valutati 40 preparati istologici di cute provenienti da altre razze di cane con ciclo follicolare del tipo non Anagen-dominated. Anche questi campioni erano pervenuti al database di Diagnostica Dermatologica del Dipartimento di Scienze Veterinarie per accertamento diagnostico, erano casi con patologie non connesse a problemi dermatologici ma con patologie cutanee neoplastiche e simil-neoplastiche nodulari, piccole, circoscritte e ben delimitate con almeno 5 unità annessiali con follicoli normali nei lembi di cute alla periferia delle diverse lesioni. Le biopsie cosi’ selezionate provenivano da cani di età compresa tra 5 e 13 anni di razza: Dalmata, Rottweiler, Chow Chow, Golden Retriever, Akita Inu, Schnauzer, Boxer, Beagle, Syberian Husky, Border Collie, Pastore Tedesco, Pechinese, Cocker, Pastore Maremmano, Basset Hound e Chihuahua. Anche in questo caso sono stati selezionati preparati con almeno 5 unità follicolari, con follicoli normali.

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Tutti i preparati selezionati ( da Barboni e altre razze) provenivano da biopsie precedentemente fissate in formalina tamponata, processate routinariamente, incluse in paraffina e colorate con ematossilina-eosina (EE). L’EE è una colorazione bicromica usata per la colorazione dei preparati istologici, in quanto permette di evidenziare in blu violetto tutte le strutture acide e quindi basofile (che si legano all’ematossilina), come il nucleo, i ribosomi e i secreti acidi, mentre le strutture basiche e quindi acidofile come le fibre muscolari e il collagene vengono colorate in rosa intenso dall’eosina. La mineralizzazione viene visualizzata sotto forma di materiale finemente granulare e intensamente basofilo, nei casi di mineralizzazione avanzata è possibile anche rilevare vere e proprie spicule calcificate. La procedura per ottenere questi preparati istologici prevede che la sezione in esame sia sparaffinata, reidratata e quindi immersa per 10 minuti in ematossilina di Mayer, fatta virare per 15-20 minuti in acqua di fonte corrente, immersa per 3-5 minuti in eosina 1% in acqua distillata e lavata con lavaggio brevissimo in acqua di fonte per poi essere nuovamente disidratata, chiarificata in xilene e infine montata. I preparati istologici selezionati, colorati con questa metodica, sono stati studiati per verificare l'entità della mineralizzazione eventualmente presente nella parete dei follicoli piliferi; per svolgere l’indagine si è proceduto a definire uno score da 0 a 3 dove 0 indica l'assenza di mineralizzazione visibile, 1 mineralizzazione lieve o incerta, 2 mineralizzazione evidente e 3 mineralizzazione molto marcata/con presenza di spicole.

Per la visualizzazione di foci di mineralizzazione è stata eseguita, sugli stessi campioni selezionati, una colorazione specifica mediante tecnica di Von Kossa (kit commerciale cod 04-170801, Bio-Optica Milano SpA, Milano, IT) eseguito secondo i passaggi indicati dal produttore e di seguito riportati:

-Portare la sezione all'acqua distillata

-Porre sulla sezione 10 gocce di reagente A (soluzione satura di litio carbonato)

-Lasciar agire 10 minuti

-Lavare bene in acqua distillata

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-Lasciar agire per 1 ora all'oscurità

-Lavare bene in acqua distillata

-Porre sulla sezione 10 gocce di acqua distillata e aggiungere 10 gocce di reagente B (soluzione riducente)

-Lasciar agire 5 minuti (fino ad annerimento dei sali d'argento)

-Lavare in acqua distillata

-Porre sulla sezione 10 gocce di reagente D (soluzione di sodio iposolfito)

-Porre sulla sezione 10 gocce di reagente E (Carmallume Mayer)

-Disidratare in serie ascendente di alcoli, fissare in xilene e montare.

Analogamente a quanto eseguito per i preparati colorati con EE anche per la valutazione del Von Kossa è stato attribuito uno score da 0 a 3 dove 0 indica Von Kossa negativo, 1 positività scarsa, 2 positività evidente e 3 positività molto evidente.

Nei casi dove è stato possibile, considerando le dimensioni molto ridotte della struttura in esame, si è ricercato il confronto del singolo follicolo pilifero dei preparati in ematossilina-eosina con lo stesso follicolo colorato con tecnica di Von Kossa, al fine di stabilire se quello che all'ematossilina-eosina veniva interpretato come calcio risultasse effettivamente tale al Von Kossa.

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5. Risultati

5.1 Segnalamento

In 107 casi è stato possibile, nella razza Barbone, selezionare aree di cute con almeno 5 unità annessiali con follicoli normali da sottoporre a colorazioni EE e Von Kossa per la visualizzazione di foci di mineralizzazione. Dei 107 preparati selezionati provenienti da cani con un range di età variabile tra 1 e 15 anni, 94 sono barboncini (quindi cani di razza Barbone taglia nana o toy) e 13 barboni (quindi cani di razza Barbone di taglia media o gigante). Quarantotto provengono da soggetti maschi e 58 da soggetti femmine, mentre di un cane non è stato riportato il sessoin cartella clinica. Dei totali 107, 16 campioni appartengono a soggetti con con sindrome di Cushing specificata in cartella clinica o dermatosi atrofica suggestiva di endocrinopatia. Tra i restanti 91 invece erano state formulate le seguenti diagnosi: 13 adenomi mammari,3 iperplasia mammaria, 21 carcinomi mammari, 2 adenocarcinomi delle ghiandole epatoidi, 2 adenoma delle ghiandole epatoidi,1 metastasi di neoplasia mammaria, 7 cisti follicolari (di vario tipo, ibride, istmo-catagene, matricali, infundibolari),1 acantoma infundibulare, 2 tricoblastomi,1 tricoepitelioma basaloide, 1 pilomatricoma, 2 amartomi (1 fibroannessiale e 1 cutaneo), 1 dermatofibroma,2 iperplasia delle ghiandole sebacee, 2 assenza delle ghiandole sebacee, 1 adenoma delle ghiandole sebacee, 2 epitelioma sebaceo, 5 carcinoma squamoso, 2 emangiomi cutanei, 1 papilloma virale, 1 angiocheratoma, 2 mastocitomi, 1 istiocitoma, 1 plasmacitoma, 1 Schwannoma mixoide,1 linfocitosi cutanea, 3 pannicolite settale, 1 edema subepidermico, 2 flogosi piogranulomatose, 1 dermatite perivascolare aspecifica, 1 dermatite spongiotica su base allergica, 1 alopecia ciclica dei fianchi, 1 coda da stallone, 1 iperpigmentazione cutanea, 1 campione non diagnostico. I 107 preparati sono stati suddivisi in 3 classi di età: gruppo A da 1 a 5 anni (17 non endocrinopatici), gruppo B da 6 a 9 anni (40 non endocrinopatici) e gruppo C da 10 a 15 anni (34 non endocrinopatici). Questo per valutare la progressione dell’insorgenza della lesione, tenendo in considerazione che lo studio di Seaman et al. (1984) si basava

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sull’osservazione di cute di barboncini oltre i 9 anni di età e che sul testo Muller & Kirk’s Small Animal Dermatology (2013) gli autori definisconola mineralizzazione della BMZ come “a senile change”. Le seguenti tabelle (tabella 3, 4 e 5) illustrano nello specifico le caratteristiche dei singoli casi, seguendo la suddivisione in 3 gruppi per età, prima citata.

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Tabella 3 Gruppo A (da 1 a 5 anni compresi)

Caso Razza Età Sesso Diagnosi

1A Barboncino 1 M Cisti matricali

2A Barboncino 2 M Campione non diagnostico 3A Barboncino 2 M Flogosi piogranulomatosa 4A Barboncino 3 M Pannicolite

5A Barbone 3 F Assenza ghiandole sebacee 6A Barbone 3 M Assenza ghiandole sebacee 7A Barboncino 3 M Edema subepidermico 8A Barboncino 4 F Ciste follicolare ibrida 9A Barbone 4 F Pilomatricoma

10A Barboncino 4 F Iperplasia mammaria modesta 11A Barboncino 4 M Dermatite perivascolare aspecifica 12A Barboncino 4 F Piodermite a sfondo eosinofilico

13A Barboncino 4 F Displasia follicolare, possibile disendocrinia

14A Barboncino 4 M Dermatosi atrofica compatibile con disendocrinopatia 15A Barboncino 4 M Papilloma virale

16A Barboncino 5 F Fibroadenosi mammaria 17A Barboncino 5 Plasmacitoma

18A Barboncino 5 F Mastocitoma

19A Barboncino 5 M Dermatite atrofica su possibile base endocrina (Cushing) 20A Barboncino 5 M Dermatite atrofica su possibile base endocrina (Cushing) 21A Barboncino 5 F Alopecia ciclica dei fianchi

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Tabella 4 Gruppo B (da 6 a 9 anni compresi)

1B Barboncino 6 F Adenoma mammario tubulare complesso, grado I

2B Barboncino 6 F Carcinoma mammario tubulo-papillare complesso di grado I 3B Barboncino 6 F Modica iperplasia lobulare mammaria

4B Barboncino 6 F Piccolo carcinoma tubulopapillare 5B Barboncino 6 F Adenocarcinoma tubulare

6B Barbone 6 F Schwannoma mixoide 7B Barbone 7 M Ciste follicolare infundibolare 8B Barboncino 7 M Amartoma cutaneo

9B Barboncino 7 F Adenoma mammario tubulare

10B Barboncino 7 F Adenoma mammario tubulare complesso 11B Barboncino 7 M Ciste istmo-catagena proliferante

12B Barboncino 7 F Acantoma infundibulare cheratinizzante 13B Barboncino 7 M Linfocitosi cutanea

14B Barboncino 7 F Adenocarcinoma mammario tubulo-papillare

15B Barboncino 8 F Atrofia follicolare non infiammatoria, sospetta endocrinopatia 16B Barboncino 8 F Adenoma mammario complesso, Cushing e diabete già in diagnosi 17B Barboncino 8 F Dermatofibromi

18B Barboncino 8 F Carcinoma mammario tubulare

19B Barboncino 8 M Ciste follicolare ibrida parzialmente cheratinizzata 20B Barboncino 8 F Tricoblastoma

21B Barboncino 8 F Ciste follicolare ibrida

22B Barboncino 8 F Carcinoma mammario papillare semplice 23B Barboncino 8 F Area focale di pannicolite settale

24B Barbone 8 M Adenoma delle ghiandole epatoidi 25B Barbone 8 F Dermatite e pannicolite

26B Barboncino 8 M Adenocarcinoma ghiandole perianali 27B Barboncino 8 M Adenocarcinoma ghiandole perianali 28B Barboncino 8 F Carcinoma tubulo-papillare complesso 29B Barboncino 8 M Tricoepitelioma basaloide

30B Barboncino 8 M Adenoma epatoide ghiandole perianali 31B Barboncino 8 F Carcinoma mammario tubulo-papillare

32B Barboncino 8 F Dermatosi atrofica compatibile con endocrinopatia 33B Barboncino 8 F Carcinoma mammario

34B Barboncino 8 F Carcinoma mammario 35B Barbone 8 F Cistoadenoma mammario 36B Barbone 9 M Angiocheratoma

37B Barboncino 9 F Carcinoma mammario 38B Barboncino 9 M Iperpigmentazione cutanea

39B Barboncino 9 F Carcinoma mammario tubulo-papillare semplice, grado I 40B Barboncino 9 F Adenoma mammario complesso

41B Barboncino 9 F Carcinoma mammario tubulo-papillare 42B Barboncino 9 F Adenoma tubulare semplice

43B Barboncino 9 F Adenoma mammario complesso 44B Barboncino 9 M Dermatopatia su base endocrina

(39)

39

1C Barboncino 10 F Adenoma mammario complesso 2C Barboncino 10 F Iperplasia mammaria

3C Barboncino 10 M Dermatosi atrofica su possibile base endocrina 4C Barboncino 10 M Dermatosi atrofica su possibile base endocrina 5C Barboncino 10 M Coda da stallone

6C Barboncino 10 F Carcinoma mammario

7C Barboncino 10 F Adenoma mammario tubulare 8C Barboncino 10 F Carcinoma mammario solido grado I

9C Barboncino 10 M Dermatosi atrofica compatibile con endocrinopatia 10C Barboncino 10 F Carcinoma mammario

11C Barboncino 10 M Atrofia cutanea e follicolare compatibile con disendocrinopatia 12C Barboncino 10 M Atrofia cutanea e follicolare compatibile con disendocrinopatia 13C Barbone 10 F Carcinoma mammario tubulo-papillare

14C Barbone 11 M Emangioma

15C Barboncino 11 M Cisti follicolare ibrida

16C Barboncino 11 F Carcinoma papillare semplice grado II 17C Barboncino 11 M Emangioma cavernoso cutaneo 18C Barboncino 11 F Iperplasia delle ghiandole sebacee

19C Barboncino 11 F Metastasi linfatiche cutanee di carcinoma di sospetta origine mammaria 20C Barboncino 11 M Istiocitoma

21C Barboncino 11 F Carcinoma mammario tubulo-papillare complesso, grado I 22C Barboncino 11 M Dermatite spongiotica su possibile base allergica

23C Barbone 12 F Adenoma mammario complesso 24C Barbone 12 M Adenoma delle ghiandole sebacee

25C Barboncino 12 M Dermatosi atrofica compatibile con disendocrinia (Iperadrenocorticismo) 26C Barboncino 12 M Epitelioma sebaceo

27C Barboncino 12 M Tricoblastoma "ribbon type" 28C Barboncino 12 M Carcinoma squamoso 29C Barboncino 13 M Carcinoma squamoso 30C Barboncino 13 M Carcinoma squamoso

31C Barboncino 13 M Dermatopatia su base endocrina compatibile con Cushing 32C Barboncino 13 M Epitelioma sebaceo

33C Barboncino 13 M Carcinoma squamoso 34C Barboncino 13 F Carcinoma mammario solido 35C Barboncino 14 F Mastocitoma

36C Barboncino 14 F Adenoma mammario tubulare

37C Barboncino 14 M Dermatosi atrofica compatibile con disendocrinia 38C Barboncino 14 F Fibroadenosi mammaria

39C Barboncino 14 M Carcinoma squamoso 40C Barboncino 15 F Carcinoma mammario

41C Barboncino 15 F Iperplasia nodulare delle gh sebacee e piccolo epitelioma sebaceo 42C Barboncino 15 M Amartoma fibroannessiale