• Non ci sono risultati.

3-AMINO RODANINO 3-, 5- BEI 3,5- PAK

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2021

Condividi "3-AMINO RODANINO 3-, 5- BEI 3,5- PAK"

Copied!
74
0
0

Testo completo

(1)

MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA

EDITA KELMELYTĖ

3-AMINO RODANINO 3-, 5- BEI 3,5- PAKEISTŲ DARINIŲ SINTEZĖ IR JŲ

ANTIBAKTERINIO BEI PRIEŠGRYBELINIO AKTYVUMO ĮVERTINIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Prof. habil. dr. Eduardas Tarasevičius

Konsultantas

Prof. habil. dr. Alvydas Pavilonis

KAUNAS

2013

(2)

TURINYS

SANTRAUKA ... 4 SUMMARY ... 5 SĄVOKOS ... 6 PADĖKA ... 7 SANTRUMPOS ... 7 ĮVADAS ... 8

DARBO TIKSLAS IR DARBO UŽDAVINIAI ... 10

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11

1.1. Mikrobų sukeltos infekcijos ir rezistentiškumas vaistams ... 11

1.2. Patogeniškų grybelių rūšys, sukeliamos infekcijos ir patogeniškumo veiksniai ... 12

1.3. Pagrindiniai priešgrybeliniai vaistai ir jų vartojimo galimybės ... 13

1.4. Priešgrybelinių vaistų veikimo mechanizmų principai ... 14

1.5. Rezistentiškumas vaistams ... 14

1.6. Nauji priešgybeliniai vaistai ... 15

1.7. Tiazolidinonų svarba kuriant naujus galimus priešmikrobinius preparatus ... 16

2. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 18

2.1. 3-Amino rodanino sintezė ... 18

2.2. 3-amino rodanino tautomerinės formos ... 19

2.3. 3-amino rodanino reakcijos ... 19

2.4. 3-amino darinių sintezė, identifikavimas ir grynumo nustatymas ... 24

2.4.1. 3-pakeistų 3-amino-2-tiokso-1,3-tiazolidin-4-onų sintezė (EK-1, EK-3, EK-9, EK-6) ... 24

2.4.2. 5-pakeistų 3-amino-2-tiokso-1,3-tiazolidin-4-onų sintezė (EK-2, EK-4, EK-7, EK-10, EK-15, EK-16, EK-22) ... 26

2.4.3. 3,5-pakeistų 3-amino-2-tiokso-1,3-tiazolidin-4-onų sintezė (EK-8, EK-11, EK-14) ... 27

2.4.4. Sintezė prijungiant aromatinį aldehidą, kai 3-amino rodanino žiedas išsiskleidžia ... 29

2.5. Junginių (EK-1 – EK-22) grynumo nustatymas ... 30

2.5.1. Elementinė sieros analizė Šionigerio metodu... 30

2.6. Tiazolidinono darinių antimikrobinio aktyvumo įvertinimas ... 34

(3)

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 40

3.1. 3-amino darinių antimikrobinio aktyvumo prognozės įvertinimas ... 40

3.2. 3-amino darinių toksiškumo prognozės įvertinimas ... 41

3.3. 3-amino rodanino darinių antimikrobinio veikimo rezultatų įvertinimas ... 42

3.3.1. 3-amino rodanino darinių su pakaitais trečioje padėtyje aktyvumo įvertinimas ... 43

3.3.2. 3-amino rodanino darinių su pakaitais penktoje padėtyje aktyvumo įvertinimas ... 45

3.3.3. 3-amino rodanino darinių su pakaitais trečioje ir penktoje padėtyje aktyvumo įvertinimas ... 46

3.4. PASS prognozės ir in vitro rezultatų palyginimas... 55

3.4.1. Aktyviausių in vitro ir PASS prognozuotų geriausiai veiksiančių junginių toksiškumo prognozė ... 56

4. IŠVADOS ... 58

5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 59

6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 60

1 PRIEDAS ... 65

(4)

3-amino rodanino 3-, 5-, 3,5- pakeistų darinių sintezė ir jų antibakterinio bei priešgrybelinio aktyvumo įvertinimas.

FF V kurso studentės Editos Kelmelytės magistro baigiamasis darbas.Mokslinis vadovas prof. habil. dr. E. Tarasevičius. Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, Farmacijos fakultetas, Vaistų chemijos katedra. - Kaunas; 2013.

Darbo tikslas – sintetinti potencialius antibakterinius ir priešgrybelinius 3-amino rodanino darinius su pakaitais 3-oje ir 5-oje padėtyse bei ištirti jų struktūros įtaką aktyvumui.

Tyrimo metodai – junginių antimikrobinio ir priešgrybelinio aktyvumo bei toksiškumo prognozė atlikta naudojant PASS programą. Antimikrobinis ir priešgrybelinis aktyvumas tirtas in vitro serijinio skiedimo standžioje terpėje metodu.

Tyrimo rezultatai – PASS programa priešgrybelinį aktyvumą prognozavo visiems junginiams didesne tikimybe nei antibakteriniam. Pastarojo neprognozavo trims junginiams. Junginiams, kuriems prognozuotas didžiausias aktyvumas – tikimybė būti toksiškiems taip pat buvo didžiausia. Atlikus tyrimus

in vitro paaiškėjo, kad nitrofurano liekana smarkiai padidina 3-amino rodanino aktyvumą prieš tiriamas

organizmų kultūras. Radikalo įjungimo vieta į 3-amino rodanino žiedą daro svarbią įtaką aktyvumui: aktyviausi junginiai turi pakaitus trečioje padėtyje, o neaktyvūs – penktoje. 3-amino rodanino žiedo išskleidimas įvedant pakaitą per amino grupę padidino priešgrybelinį veikimą. Gauti rezultatai parodė, kad aromatinių benzaldehidų įtaka aktyvumui priklauso nuo pakaitų pobūdžio ir vietos juose.

Išvados – aktyvumo programa PASS gali padėti iš anksto tikėtis rezultato ir pagal tai kryptingai pasirinkti junginius, tačiau būtina atlikti tyrimus ir in vitro. 3-amino rodanino darinių aktyvumas priklauso nuo pakaitų įvedimo padėties. Atsižvelgiant į gautus rezultatus, išskirti perspektyviausi junginiai prieš grybelius ir mikrobus turintys trečioje padėtyje 5-nitro-2-furaldehido radikalą: EK-1 bei EK-14. Stipriu priešgrybeliniu veikimu pasižymėjo junginiai kurių struktūroje buvo 2,6-dichlorbenzaldehidas bei para-clorbenzaldehidas prie išskleisto 3-amino rodanino žiedo: EK-3 bei EK-13.

(5)

Synthesis of 3-amino rhodanine 3-, 5-, 3,5- derivatives and evaluation of their antibacterial and antifungal activity.

Master thesis by Edita Kelmelytė, 5th

course student of the Faculty of Pharmacy, Department of Pharmaceutical Chemistry, Medical academy, Lithuanian university of health sciences, Kaunas. Tutor Eduardas Tarasevičius, Professor, D. Sc. habil.

Aim of study – synthesize potential antibacterial and antifungal 3-amino rhodanine compounds with

substitutes in 3 and 5 places and analyze their structure influence to the activity.

Study methods – prognosis of antifungal, antibacterial and toxicity of synthesized compounds was made by PASS program. Antibacterial and antifungal activity was tested in vitro by serial dilution in stiff environment.

Study results – PASS program predicted antifungal activity to all compounds with higher probability than antifungal. 3 compounds had no predictions to antibacterial activity. According to PASS results, the most active compounds could be the most toxic. Research in vitro showed, that moiety of nitrofuraldehyde increases activity of 3-amino rhodanine against microbes and fungi cultures. Activity depends on the place of derivative in the ring of 3-amino rhodanine: the most active compounds had derivatives in 3rd place, and inactive – in 5th. Opening of the ring of 3-amino rhodanine during reaction in 3rd place increased antifungal activity. Results showed, that the influence of aromatic benzaldehydes to the activity depends on derivatives nature and place in aldehydes.

Conclusions – activity program PASS could help predict result and accordingly choose compounds. However it is necessary to perform studies in vitro. Activity of 3-amino rhodanine compounds depends on derivatives place in the ring. With respect to results in vitro, 2 most active compounds were sorted: EK-1 and EK-14 which have 5-nitro-2-furaldehyde moiety in 3rd place. Strong antifungal activity showed compounds with 2,6-dichlorbenzaldehyde and para-chlorbenzaldehyde by opened 3-amino rhodanine ring: EK-3 and EK-13.

(6)

Minimali bakteriostatinė (fungistatinė) koncentracija – mažiausioji slopinančioji koncentracija (MSK), kurioje pasireiškė tiriamojo junginio bakteriostatinis (grybeliui – fungistatinis) veikimas.

Minimali letalinė (mikrobocidinė) koncentracija – mažiausia tiriamojo junginio koncentracija (MLK), kurioje sunaikinami mikrobai.

Rezistentiškumas - grybelinės ar mikrobinės infekcijos nereagavimas į gydymą vaistais. Rodaninas – cheminis junginys, pavadinimu 2-tiokso-1,3-tiazolidin-4-onas.

(7)

Nuoširdžiai dėkoju magistrinio darbo vadovui prof.habil. dr. E. Tarasevičiui, recenzentui prof. dr. H. Rodovičiui, konsultantui prof. habil. dr. A. Paviloniui už pagalbą ir rekomendacijas darant bei rašant baigiamąjį magistrinį darbą. Taip pat dėkoju dr. V. Petrikaitei už konsultacijas mikrobiologinių tyrimų klausimais, už sudarytas sąlygas atlikti ESC tyrimą bei naudingus patarimus - prof. dr. L.Ivanauskui. Nuoširdžiai dėkoju doktorantui M. Marksai už pagalbą atliekant ESC tyrimą, doktorantei J. Dambrauskaitei už naudingus patarimus, Ž. Kaupui, V. Pelakauskui, L. Remeikiui ir J. Saliui – už pagalbą ir paramą, vaistų chemijos, mikrobiologijos bei analizinės ir toksikologinės chemijos katedrų vadovams bei darbuotojams – už sudarytas sąlygas atlikti tyrimus.

(8)

SANTRUMPOS

ESC efektyvioji skysčių chromatografija

ŽIV žmogaus imunodeficito virusas (ang. human immunodeficiency virus )

AIDS įgytas imuniteto nepakankamumo sindromas (ang. acquired immunodeficiency syndrome) CDC ligų kontrolės ir prevencijos centras (ang. Centers for disease control and prevention) 5-FC 5-fluorocitozinas

DAMB amfotericino B deoksicholatas

ABCD amfotericino B koloidinė dispersija (ang. amphotericin B colloidal dispersijon) ABLC amfotericino B lipidų kompleksas (ang. amphotericin B lipid complex)

LAMB liposominis amfotericinas B (ang. liposomal amphotericin B) DNR deoksiribonukleorūgštis (ang. DNA – deoxyribonucleic acid) RNR ribonukleino rūgštis (ang. RNA – ribonucleic acid)

CYP450 citochromo P 450 fermentai

MIC minimali inhibitorinė koncentracija (ang. Minimum inhibitory concentration)

S.aureus Staphylococcus aureus ATCC 25923

B.subtilis Bacillus subtillis ATCC 6633

K.pneumoniae Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 E.colli Escherichia coli ATCC 25922 B.cereus Bacillus cereus NCIMB 50014 P.mirabilis Proteus mirabilis ATCC 12453 E.faecalis Enterococcus faecalis ATCC 29212 P.aeruginosa Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 C.albicans Candida albicans ATCC 60193

M molinė masė, g/mol UV ultravioletinė spinduliuotė DMSO dimetilsulfoksidas

MSK minimali slopinančioji koncentracija, μg/ml MLK minimali letalinė koncentracija, μg/ml

(9)

ĮVADAS

Darbo aktualumas:

Per pastaruosius du dešimtmečius išaugo grybelinių ir mikrobinių infekcijų grėsmė dėl vis didėjančio susirgimų jomis skaičiaus. Į mikrobinių infekcinių ligų rizikos grupę papuola sergantys žmogaus imunodeficito virusu (ŽIV), įgytu imuniteto nepakankamumo sindromu (AIDS), organų transplantacijos recipientai, sergantys kraujo ligomis, mažo svorio naujagimiai. Grybelinių infekcijų susirgimo paplitimas po inkstų transplantacijos yra 5%, po plaučių ir širdies – 35%, po kepenų – 40%, sergantiems ūmine leukemija – iki 30%. Burnos kandidozė pasireiškia 84% pacientų, užsikrėtusių ŽIV [54]. Vokietijoje atlikto tyrimo metu paaiškėjo, kad 2,1% vaikų, sirgusių ūmine leukemija, mirė dėl išsivysčiusios infekcijos. 21% šių atvejų sudarė grybelinės infekcijos [27]. Ligų kontrolės ir prevencijos centro duomenimis (CDC), Cryptococcus meningitis pasauliniu mastu per 1 metus sukelia 1 milijoną infekcijų, kurių daugumą sudaro ŽIV sergantys pacientai, o 625 000 atvejų baigiasi mirtimi [8].

Daugiau kaip 95% grybelinių infekcijų yra sukeliama Candida albicans (C.albicans), Aspergillus

fumigates, ir Cryptococcus neoformans [32, 43]. Candida species (spp.) užima 4 vietą tarp priežasčių,

sukeliančių kraujotakos infekcijas. Šių susirgimų skaičius ir toliau auga, nors nuo 1989 metų mirčių skaičius sumažėjo [19]. Candida spp. sukėlėjų kraujotakos infekcijos, pradėtos gydyti po 48 valandų, vis dar turi didelį mirtingumo laipsnį, o Candida glabrata, palyginus su C.albicans, ir žymiai didesnį rezistentiškumą vaistams [7]. 2007 metais 75 pasaulio šalyse buvo atlikas tyrimas, kuriame dalyvavo 14414 pacientai, gulintys intensyviosios terapijos skyriuje. Tyrimo dieną 51% buvo nustatyta infekcija, 69,8% iš jų - mikrobinė, o 19,4% - grybelinė. Gram neigiami sukėlėjai nustatyti dažniau (62,2% visų mikrobinių infekcijų). Iš jų - Escherichia coli (E.coli) sudarė 16%, o Pseudomonas spp. – 19,9%. Grybelinių infekcijų dažniausias sukėlėjas nustatytas Candida spp. (17%), o Aspergillus spp – 1,4% [23].

Dėl vis didėjančio grybelinių infekcijų skaičiaus bei sukėlėjų rezistentiškumo esamiems vaistams, vis rečiau užregistruojamų naujų antibiotikų, mokslininkai tebeieško naujų, efektyvesnių vaistų bei tinkamesnių gydymo strategijų [35]. Šiuo metu yra ribotas skaičius vaistų, gydančių grybelines infekcijas. Aspergilus spp. yra rezistentiškos flukonazoliui, o iki šiol vartoto vaisto amfotericino B veikimas prieš grybelius yra smarkiai sumažėjęs [9]. Plačiai išnagrinėtas atsparumo ne tik šiam vaistui mechanizmas, bet ir 5-fluorocitozinui, flukonazoliui, itrakonazoliui, vorikonazoliui [45].

Teorinė ir praktinė reikšmė:

2013 metų ligų kontrolės ir prevencijos (CDC) kasmetinėje ataskaitoje pranešama, kad mikrobų rezistentiškumas pasireiškia labai dažnai. Didėja mikrobinių infekcijų skaičius, kurias sunku gydyti net

(10)

kombinuotais vaistais [59]. Nuo 2009 metų užregistruot tik du nauji antibiotikai: telavancinas ir ceftalorino fozamilis. Dėl minėtų priežasčių skatinami moksliniai tyrimai ieškant sprendimo būdų šioje srityje [61].

Ryšys su tyrimo metodika ir rezultatais:

Daugelis autorių nurodo, kad 4-tiazolidinonai pasižymi įvairiu biologiniu aktyvumu: priešgrybeliniu, antimikrobiniu [4, 5, 16, 23], prieštuberkulioziniu [16], priešvėžiniu [12], priešvirusiniu [16], antidiabetiniu [41] ir antiaritminiu [2] poveikiais. Su rodanino ir 3-amino rodanino dariniais daug metų dirba Lietuvos sveikatos mokslų universiteto mokslininkai Eduardas Tarasevičius, Vilma Petrikaitė ir Raimondas Radžiūnas [1]. Jų tyrimų rezultatai paskatino sintezuoti 3-amino rodanino darinius ir plačiau panagrinėti jų antimikrobinį aktyvumą in vitro.

Tyrimo problema - sumažėjo naujai registruojamų antimikrobinių vaistų skaičius, o mikrobų rezistentiškumas padidėjo.

Tyrimo objektas – 3-amino rodanino darinių antimikrobinio aktyvumo priklausomybė nuo junginio struktūros.

Darbo tikslas - sintetinti potencialius antibakterinius ir priešgrybelinius 3-amino rodanino darinius su pakaitais 3-oje ir 5-oje padėtyse bei ištirti jų struktūros įtaką aktyvumui.

Darbo uždaviniai:

1. Susintetinti 3-amino rodanino darinius su pakaitais trečioje, penktoje ir abiejose padėtyse.

2. Nustatyti susintetintų 3-amino rodanino darinių antibakterinio ir priešgrybelinio aktyvumo bei cheminės struktūros ryšio dėsningumus.

3. Įvertinti 3-,5- bei 3,5- pakeistų 3-amino rodanino darinių priešgrybelinį ir antibakterinį

aktyvumą, galimą toksiškumą:

 naudojant PASS programą aktyvumui ir toksiškumui įvertinti;

serijinio skiedimo standžioje terpėje in vitro metodu aktyvumui nustatyti.

(11)

DARBO TIKSLAS IR DARBO UŽDAVINIAI

Tyrimo kryptis- biologiškai aktyvių junginių sintezė, analizė ir poveikio in vitro tyrimas.

Tyrimo problema- sumažėjo naujai registruojamų antimikrobinių vaistų skaičius, o mikrobų rezistentiškumas padidėjo.

Darbo tikslas - sintetinti potencialius antibakterinius ir priešgrybelinius 3-amino rodanino darinius su pakaitais 3-oje ir 5-oje padėtyse bei ištirti jų struktūros įtaką aktyvumui.

Darbo uždaviniai:

1. Susintetinti 3-amino rodanino darinius su pakaitais trečioje, penktoje ir abiejose padėtyse.

2. Nustatyti susintetintų 3-amino rodanino darinių antibakterinio ir priešgrybelinio aktyvumo bei cheminės struktūros ryšio dėsningumus.

3. Įvertinti 3-,5- bei 3,5- pakeistų 3-amino rodanino darinių priešgrybelinį ir antibakterinį aktyvumą, galimą toksiškumą:

 naudojant PASS programą aktyvumui ir toksiškumui įvertinti;

serijinio skiedimo standžioje terpėje in vitro metodu aktyvumui nustatyti.

Mokslinio tyrimo eiga: 3-amino rodanino darinių aktyvumo ir toksiškumo tikimybės nustatymas PASS programa. Junginių sintezė ir analizė. Sintezuotų junginių aktyvumo nustatymas prieš mikrobų kultūras. Duomenų vertinimas ir analizė.

(12)

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Mikrobų sukeltos infekcijos ir rezistentiškumas vaistams

Mikrobinės infekcijos kelia didelį mokslininkų susirūpinimą dėl jų gausos, ligų baigties ir didėjančio rezistentiškumo esamiems vaistams. Nuo 1900 iki 1980 metų mirtingumas sumažėjo nuo 797 mirties atvejų 100000 susirgimų iki tik 36. Toks pasiekimas siejamas su dvidešimties naujų antibiotikų sukūrimu. Tačiau nuo 1980 iki 2000 metų mirčių skaičius, daugiausiai tarp sergančių ŽIV, padvigubėjo. Tam įtakos turėjo išplitęs mikrobinių infekcijų rezistentiškumas vaistams: meticilinui atsparių

Staphylococcus aureus (S.aureus), vankomicinui – enterokokinių infekcijų, daugeliui vaistų atsparių

gram-neigiamų bakterijų bei tuberkuliozės sukelėjų [10].

S.aureus sukelta infekcija yra ne tik dažniausiai pasitaikanti klinikinėje praktikoje, bet ir viena

labiausiai linkusi į rezistentiškumą. Nuo 1942 metų šiuos sukelėjus pradėta gydyti penicilinu G, tačiau patogenai labai greitai tapo rezistentiški šiam vaistui. 1961 metais pradėti vartoti penicilinai, o netrukus paskelbta, kad atsirado meticilinui atspari S.aureus infekcija [15]. Atsparias rūšis pradėta gydyti rezerviniu antibiotiku vankomicinu, tačiau praėjus 45 metams paskelbti pirmieji rezistentiškumo ir šiam vaistui atvejai [29]. Buvo manoma, kad atsparumui vaistams įtakos turi šie faktoriai: trumpas laikas po hospitalizacijos ar operacijos, ilgas buvimas gydymo įstaigose, dializė, kateterizavimas. Vėliau pastebėta, kad infekcija gali pasireikšti ir rizikos faktorių neturintiems žmonėms [50].

Klebsiella pneumoniae (K.pneumoniae) yra kliniškai viena svarbiausių rūšių iš Klebsiella spp.

Nors tai opurtunistiniai patogenai, K.pneumoniae gali sukelti endokarditą, cholecistitą, viduriavimą, meningitą. Nustatant pneumonijos sukelėją, ši rūšis sudaro 7-14% visų tiriamų atvejų. Esant žaizdos infekcijai – 2-4% atvejų [46]. Karbapenemai, tokie kaip imipenemas ir meropenemas, yra rekomenduojami kaip pirmo pasirinkimo vaistai nuo Enterobacteriaceae sukėlėjų. Tačiau vis dažniau pranešami atvejai, kad jiems yra išsivystęs atsparumas [13, 14], kuris pirmą kartą buvo identifikuotas 1996 metais [16]. Mirtingumas nuo karbapenemams atsparių K.pneumoniae infekcijų svyruoja nuo 30,1% iki 44% [3].

(13)

1.2. Patogeniškų grybelių rūšys, sukeliamos infekcijos ir patogeniškumo veiksniai

Augalų ir grybų karalystėms priklauso tas pats vienaląstis protėvis, gyvenęs prieš maždaug 1 milijardą metų [17]. Grybeliai yra eukariotiniai mikroorganizmai, priskiriami grybų karalystei, kurie ląsteliniu lygiu yra daug artimesni žmogui nei bakterijos. Jų ląstelės sienelę sudaro chitino sluoksnis, o augimas gali vykti 2 būdais: kaip daugialąsčių, formuojant hifus, arba kaip mielių [31]. Ši savybė vadinama dimorfizmu: esant 37 Cº - jie auga kaip grybai, o 25 Cº - kaip mielės. Dimorfizmas būdingas ir kai kuriems patogeniškiems grybeliams, pavyzdžiui, C.albicans [18].

Žmogui patogeniški grybeliai skirstomi į 4 grupes: zigomicetai, aukšliagrybiai, papėdgrybiai ir grybšiai. Mikrobų patogeniškumas yra savitas. Sukelti sveikatos sutrikimų ar mirtiną ligą sergantiems kitomis ligomis gali: Aspergillus spp., Candida spp., Cryptococcus spp., Fusarium spp. ir Rhizopus spp.

Trichophyton spp., Epidermophyton spp., Histoplasma spp., Blastomyces spp., Sporothrix spp., Coccidioides spp., ir Paracoccidioides spp. gali sukelti infekcines ligas ir sveikiems žmonėms [31].

Didelis mirtingumas pastebimas nuo šių sukėlėjų: Candida spp., Aspergillus spp., Fusarium spp., ir

Trichosporum spp.[52], o pagrindiniai invazinių grybelinių infekcijų sukėlėjai yra C.albicans, Aspergillus fumigates, ir Cryptococcus neoformans [32, 43].

Grybelinės ligos plačiai skirstomos pagal tai, koks grybelis sukėlė infekciją: dermatofitozė, histoplazmozė, blastomikozė, koksidiomikozė, kandidozė, kriptokokozė, aspergiliozė, hialohifomikozė [32]. Kai kurios Candida rūšys yra natūraliai aptinkamos žmogaus organizme, kurių kolonijos normaliomis sąlygomis nesukelia jokių ligų, pavyzdžiui, ant odos, gleivių, žarnyne. Pasikeitus sąlygoms, gali išsivystyti infekcija, kuri vadinama kandidoze. Pagal veikimo vietą ji skirstoma į paviršinę (odos ir gleivių) ir invazinę. Dažniausiai kandidozę sukelia C.albicans, C.glabrata, C.tropicalis, C.krusei, C.dubliniensis, C.parapsilosis rūšys [21]. Maždaug 70% moterų vaginaline kandidoze suserga 1 kartą per

gyvenimą, o 20 % kenčia nuo ligos pasikartojimo. C.glabrata didžiausią pavojų kelia imunosupresinius vaistus vartojantiems pacientams, C.krusei – sergantiems kraujo ligomis ar po organų transplantacijos, C.

tropicalis – dažniausiai sukelia infekcijas sergantiems leukemija, o C. dubliniensis – sergantiems AIDS

[32].

Labai svarbi patologinių grybelių savybė yra sukurti bioplėvelę bei išskirti hidrolizinius fermentus. Sukibimas su daugelių paviršių - pagrindinis grybelių kolonozacijos žmogaus audiniuose veiksnys. Šis procesas yra kontroliuojamas ir indukuojamas tam tikrų ląstelės turimų kaskadų. Pavyzdžiui,

(14)

1 pav. Elektroniniu mikroskopu nuskenuota C.albicans bioplėvelė

1.3. Pagrindiniai priešgrybeliniai vaistai ir jų vartojimo galimybės

Šiuo metu vaistų rinkoje dominuoja šie invazinių infekcijų priešgrybeliniai vaistai: polienai (amfotericino B deoksicholatas (DAMB) ir 3 lipidinės amfotericino B formos, nistatinas), triazolai (ketokonazolas, flukonazolas, itrakonazolas, vorikonazolas ir posakonazolas), echinokandinai (kaspofunginas, mikafunginas ir anidulafunginas), alilaminai (terbinafinas) bei fluorpirimidinai (flucitozinas) [25, 43, 37]. Apsisprendimą, kurį vaistinį preparatą parinkti gydymui, lemia jų veikimo spektras, įsisavinimas, indikacijos, saugumas, vartojimo būdas bei kaina [25].

1890 metais sukūrus flukonazolą ir itrakonazolą atsirado puiki alternatyva gydymui DAMB. Pastebėta, kad gydant amfotericinu B yra tikslinga kartu skirti 5-fluorocitoziną (5-FC). Taip pat atrastos lipidinės amfotericino B formos, sukurta daug triazolų, alilaminų ir echinokandinų. Nuolat skelbiami nauji pasiekimai vaistų sintezės srityse, dedamos didelės pastangos sukurti idealų priešgrybelinį preparatą [6].

Iki šiol plačiai vartoto amfotericino B rekomenduojama dozė yra svyruojanti nuo 0,5mg/kg/per dieną gydant kandidozę, iki 1-1,5mg/kg/per dieną - ūmią išplitusią kandidozę. Gydant didesnėmis DAMB dozėmis pastebėtas reikšmingas nefrotoksiškumo padidėjimas [40]. Didesnis mirtingumas pastebimas pacientams, kuriems atliekama hemodializė tuo metu, kai gydoma DAMB bei skiriamas ciklosporinas.

(15)

Dėl didelio toksiškumo inkstų veiklai buvo sukurti amfotericino B dariniai su lipidais: amfotericino B koloidinė dispersija (ABCD), amfotericino B lipidų kompleksas (ABLC) bei liposominis amfotericinas B (LAMB), kurie pasižymi mažesniu toksiškumu ir tokiu pačiu veikimu prieš patogeniškus grybelius [29, 30]. Labai populiarus dėl savo mažesnio toksiškumo ir plataus veikimo yra flukonazolas. Šis triazolas yra aktyvus prieš daugelį patogeninių Candida spp., tačiau jis neveikia C.glabrata, C.krusei. Echinokandinų atstovai yra pasirenkamieji vaistai toms infekcijoms, kurių nebegalima gydyti tradiciniais vaistais. Taip pat atliekami tyrimai ieškant derinių su kitais vaistiniais preparatais. Itrakonazolas veikia Aspergillus spp., sukeltas infekcijas, taip pat turi stiprų veikimą in vitro prieš Candida spp. Nepaisant to, jo vartojimo galimybes riboja dažna tarpusavio sąveika su kitais vaistais ir mažas bioprieinamumas. Nustatyta, kad terbinafinas puikiai tiktų gydant dermatofitozę, tačiau atlikti farmakokinetiniai tyrimai jo pritaikymo galimybes apriboja. Šiuo metu jis naudojamas nagų grybeliui gydyti bei infekcijų sukelėjams, kurie jam yra jautrūs [6, 20].

1.4. Priešgrybelinių vaistų veikimo mechanizmų principai

Dėl vis didėjančio efektyvių priešmikrobinių vaistų poreikio mokslininkai plačiai tyrinėja vaistų veikimo mechanizmus. Nustatyta, kad kiekvienai vaistų grupei būdingas savitas veikimas. Polienų atstovai sąveikauja su plazminės membranos steroliais, ypač su ergosteroliu; azolai inhibuoja ergosterolio biosintezę, triazolai inhibuoja citochromo P450 14-alfa-demetilazę lanosteroliui, reguliuojamą geno ERG11. 5-FC patenka į grybelių ląsteles ir yra verčiamas citozino deaminazės į aktyvias molekules, kurios inhibuoja deoksiribonukleorūgšties (DNR) ir ribonukleino rūgšties (RNR) sintezes. Alilaminai veikia inhibuodami skvalino epoksidazę, kuri yra svarbi ankstyvose ergosterolio biosintezės stadijose. Naujausios klasės echinokandinai veikia inhibuodami beta-(1,3)-gliukano sintazę [43, 48].

1.5. Rezistentiškumas vaistams

Nepaisant to, kad vis sukuriami naujesni ir efektyvūs vaistai, patogeniškų grybelių atsparumas gydymui vystosi ir didėja, taip keldamas daug sunkumų gydant pacientus [24, 37].

(16)

Rezistentiškumas – grybelinės ar mikrobinės infekcijos nereagavimas į gydymą vaistais. Jis gali būti skirstomas į 3 tipus [11, 45]:

 pirminis (įprastinis) – atsiranda prieš vaistų poveikį;

 antrinis (įgytas) – atsiranda po vaistų poveikio;

 trečio tipo (dar vadinamas klinikiniu rezistentiškumu) apima infekcijos progresą ar recidyvą, nepaisant to, kad gydoma tinkamais vaistais ir reikiamomis dozėmis.

Mokslinių straipsnių autoriai Dominique Sanglard, Michael A. Pfaller, Dimitrios P. Kontoyiannis ir Russell E. Lewis apžvelgė daugelį mokslinių darbų ir pateikė patogeniškų grybelių atsparumo vaistams mechanizmų apžvalgą:

 Nurodoma, kad amfotericinui B ir jo lipidinėms formoms rezistentiškumas atsiranda dėl pokyčių specifiniuose ergosterolio biosintezės žingsniuose;

 5-FC – dėl sumažėjusio vaisto pasisavinimo ir grybeliams toksinių antimetabolitų formavimo;

 Flukonazolui – dėl padidinto išskyrimo, kurį reguliuoja transporteriai per genus;

 Itrakonazolui – taikinio deformacija dėl įvykusių mutacijų;

 Vorikonazolui - taikinio deformacija dėl įvykusių mutacijų;

 Pozakonazolui - dėl pokyčių specifiniuose ergosterolio biosintezės žingsnių keliuose;

 Terbinafinui, kaspofunginui ir amorolfinui – kol kas dar nežinoma [37, 43, 45].

Kai paskirtas gydymas vaistais grybelinės infekcijos negydo, pirmiausia įtariama, kad yra rezistentiškumas. Tačiau būtina atsižvelgi ir į kitus rizikos faktorius:

a) Susilpnėjusi vaisto absorbcija (pvz.: itrakonazolio kapsulės paskirtos agranuliocitoze sergantiems pacientams);

b) Padidėjęs vaisto metabolizmas (pvz.: dėl rifampicino vartojimo kartu su azolais);

c) Mažas vaisto prasiskverbimas į infekcijos vietą ( pvz.: amfotericino B, sergant meningitu); d) Antagonizmas (pvz.: azolų sąveika su amfotericinu B);

e) Prietaisai hospitalizuojant (pvz.: kateteriai padidina riziką kandidozei) [43].

(17)

Prie naujų priešgrybelinių preparatų yra priskiriami azolų atstovai: pozakonazolas, ravukonazolas bei vorikonazolas. Jų spektras yra platus: veikia prieš Candida spp., Trichosporon beigelii, Cryptococcus

neoformans, Aspergillus spp., Fusarium spp. Echinokandinų preparatai, labai vertinami dėl veikimo į Candida spp. bei Aspergillus spp. Jie pasižymi gera tolerancija ir tuo, kad nėra metabolizuojami

citochromo P450 (CYP450) fermentų. Didelį mokslininkų susidomėjimą sukėlė naujai susintetintas junginys, pavadintas izavukonazoliu (BAL4815), kuris yra priskiriamas azolų grupei ir šiuo metu yra klinikinių tyrimų 3 stadijoje [34]. Atlikus palyginamuosius tyrimus su esamais priešgrybeliniais vaistais, izavukonazolis buvo aktyvesnis nei daugelis seniai vartojamų vaistų, o minimali letalinė (mikrobocidinė) koncentracija (MLK) visoms tirtoms grybelių kultūroms buvo artima itrakonazoliui. Pagal gautus tyrimus, izavukonazolas Candida spp. veikė šiek tiek silpniau nei itrakonazolas, tačiau geriau nei vorikonazolas ir flukonazolas; C.neoformans veikimas visų šių preparatų buvo panašus. Izavukonazolis parodė didelį aktyvumą prieš Aspergillus spp. bei dermatofitų rūšis, taip pat veikė B. dermatitidis ir H. Capsulatum su MLK reikšmėmis <0,01mg/L [47, 51]. Cheshta Sharma ir kitų mokslininkų 2013 metais atlikto tyrimo duomenimis, izavukonazolis aktyviai veikia prieš C. nivariensis, kai MLK ribos 0.015–0.25 μg/ml [8].

1.7. Tiazolidinonų svarba kuriant naujus galimus priešmikrobinius preparatus

Tiazolidinonai – cheminiai junginiai, kurių cheminės struktūros pagrindą sudaro penkianaris ciklo žiedas su vienu sieros ir azoto atomais ir vienu arba dviem prie anglies prijungtais deguonies atomais. 4-Tiazolidinonai vis dar kelia didelį mokslininkų susidomėjimą dėl savo plataus pritaikymo spektro: jie pasižymi priešgrybelinėmis ir antimikrobinėmis [4, 5, 16, 23, 26], prieštuberkulioziniu [16], priešvėžiniu [12], priešvirusiniu [16], antidiabetiniu [41], antiaritminiu [2] poveikiais. Plačiai išnagrinėtos jų aktyvios padėtys, todėl į jas vedami skirtingi ir nauji pakaitai, tiriamas biologinis aktyvumas ir aiškinamasi struktūros-aktyvumo ryšys [2, 22].

Rodanino žiedas priimtas kaip potencialus radikalas būsimiems vaistams [49]. Kadangi rodaninas (2 pav.) pasižymi įvairiu biologiniu aktyvumu, mokslininkai jungia įvairius pakaitus tirdami gautų naujų junginių struktūros aktyvumo ryšį. Nustatyta, kad 3-amino rodaniną jungiant su spiro junginiais gaunamas antidiabetinis aktyvumas [41], sudarant benzilideno jungtis – stiprus priešmikrobinis aktyvumas [30] bei cholesterolio esterazę inhibuojantis poveikis [44].

(18)

3-amino rodaninas savo struktūra nuo rodanino skiriasi tik pakaitu 3 padėtyje. Joje esantiamino grupė aktyvumą prieš grybelį C.albicans palyginus su rodaninu padidino 64 kartus [55]. 3-amino rodanino junginių biologinis aktyvumas mokslinėje literatūroje retai minimas, o jo struktūros pagrindas yra tiazolidinonas. Kadangi padidėjo mokslininkų susidomėjimas šią struktūrą turinčiais junginiais [2, 22], nusprendėme susintetinti 3-amino rodanino darinius ir patyrinėti jų stuktūros-aktyvumo ryšį bei nustatyti antimikrobinį aktyvumą. N H S O S Rodaninas N S O S NH2 3-amino rodaninas 2 pav. Rodanino ir 3-amino rodanino struktūra

(19)

2. TYRIMO METODIKA IR METODAI

2.1. 3-Amino rodanino sintezė

3-amino rodaninas buvo sintetintas pagal prof. habil. dr. E. Tarasevičiaus pasiūlytą metodiką. 10 gramų hidrazinhidrato (0,2 mol, M=50,06 g/mol, d=1,03g/cm3) sumaišoma su 30 mililitrų metanolio,

tirpalas šaldomas ledo vonioje iki 0ºC. Į atšaldytą tirpalą, veikiant magnetinei maišyklei, lėtai lašinamas padarytas tirpalas iš 6 ml anglies disulfido (0,1mol, M=76,16 g/mol, d=1,263) 20-je mililitrų eterio. Lašinant nuolat sekama temperatūra, leidžiant jai pakilti iki 8ºC. Sulašinus visą hidrazinhidrato tirpalą metanolyje iškrenta baltos spalvos nuosėdos, kurios maišomos magnetine maišykle 20 minučių esant 5 ºC temperatūrai. Gautos nuosėdos filtruojamos vakuuminiu vandens siurbliu, praplaunamos eteriu ir džiovinamos. Gautos druskos lydimosi temperatūra 120-122 ºC (gauta 12,2 gramai). 8,5 gramai monochloracto rūgšties (0,09 mol) ištirpinama 25 mililitruose distiliuoto vandens, neutralizuojama su natrio karbonatu. pH tikrinamas universaliuoju lakmuso popierėliu. Gautas tirpalas atšaldomas iki 0ºC, veikiant magnetinei maišyklei mažais kiekiais dedama gauta druska, stebima tirpalo temperatūra, leidžiant jai pakilti iki +4ºC. Paliekama maišytis 30 min. Gautas tirpalas praskiedžiamas du kartus po 25 mililitrus distiliuoto vandens, paliekamas stovėti 2 valandas kambario temperatūroje. 70 mililitrų 6N vandenilio chlorido rūgšties šildoma iki virimo, į ją lėtai pilamas išlaikytas tirpalas. Kaitinama iki 90-95ºC, atšaldžius iškrenta 3-amino rodanino kristalai, kurie nufiltravus vakuuminiu vandens siurbliu perkristalinami etanolyje arba ledinėje acto rūgštyje (1 gramas medžiagos kristalinasi 5ml tirpiklio. Lydymosi temperatūra 92-93ºC). Reakcijos schema pateikiama 3 pav.

Reakcijos eiga buvo stebima plonasluoksnės chromatografijos metodu. Sistemos parinktos eksperimentiškai: chloroformas:acetonas (1:4), toluenas:acetonas (1:10). Ryškinama ultravioletiniais (UV) spinduliais bei vario sulfatu. Galutinis produktas buvo lyginamas su tarpiniu, taip pat buvo nustatinėjama jų lydymosi temperatūros ir lyginamos su literatūros duomenimis.

(20)

N H2 NH2 H2O CS2 N H2 NH S SH N H2 NH2 N H2 NH S SH

+

O OH Cl

*

*

S N S NH2 O 3-amino rodaninas 3 pav. 3-amino rodanino sintezė

2.2. 3-amino rodanino tautomerinės formos

3-amino rodaninas gali egzistuoti dviem pavidalais: kaip hidrazininė (a) ir tiolinė forma (b). S N S NH2 O S N+ SH NH -O a b

Spiritinėje aplinkoje egzistuoja hidrazininė forma, o amoniako aplinkoje – 3-amino rodaninas praranda rūgštines savo savybes ir pasikeičia į tiolinę formą [56]. Atsižvelgiant į šią savybę, tam tikroje aplinkoje galima jungti įvairius pakaitus 3-ioje ir 5-oje padėtyse. Šiuo principu buvo paremta 3-amino rodanino junginių sintezė šiame darbe.

2.3. 3-amino rodanino reakcijos

Nustatyta, kad 3-amino rodanino chemiškai aktyvios padėtys yra trečia ir penkta. Etanolio aplinkoje 3-amino rodaninas reaguoja būdamas hidrazininės formos su aromatiniais aldehidais, sudarydamas 3-ariliden darinius [36] (4 pav.).

(21)

S N S NH2 O

+

R O H

+

O H2 S N S N O R

4 pav. Radikalų įvedimo į 3 padėtį reakcijos schema

Šiomis reakcijos sąlygomis buvo atliktos reakcijos (I-IV) ir gauti junginiai pavadinti EK-1, EK-3, EK-9, EK-6 (5 pav.).

EK-1 I II S N O S N Cl Cl III EK-6 IV S N S N O N+ O -O EK-3 S N O S N O N+ O -O EK-9 S N S N O N+ O -O S N S NH2 O

5 pav. Junginių sintezė įvedant pakaitus į 3 padėtį

Kai aromatiniai aldehidai jungiami su 3-amino rodaninu Girard metodu, gaunami 5-ariliden dariniai, o amino grupė trečioje padėtyje lieka laisva [36] (6 pav.).

S N S NH2 O

+

R O H NH4OH S N S NH2 O R

+

O H2

6 pav. Radikalų įvedimo į 5 padėtį reakcijos schema

(22)

Kadangi kai kurie tiazolidinonai penktoje padėtyje turintys radikalus pasižymi stipriomis antimikrobinėmis savybėmis [33], o mokslininko Yoshihiko Inamori straipsnyje [55] pateikiama išvada, kad 3-amino rodanino dariniai su neblokuota amino grupe pasižymi didesniu priešgrybeliniu aktyvumu, buvo nuspręsta šiomis reakcijos sąlygomis atlikti reakcijas (V-XI). Iškelta hipotezė, kad šie junginiai pasižymės stipriu antimikrobiniu aktyvumu. Gauti junginiai pavadinti EK-2, EK-4, EK-7, EK-10, EK-15, EK-16, EK-22 (7 pav.).

S N S NH2 O S N S NH2 O Cl S N S NH2 O Cl Cl V VI VII VIII IX X XI EK-4 EK-2 EK-7 EK-10 EK-15 EK-16 EK-22 S N S NH2 O N+ O -O S N S NH2 O N CH3 C H3 S N S NH2 O C H3 N+ O -O S N S NH2 O S N S NH2 O O O C H3 O C H3 C H3 O CH3 O

7 pav. Junginių sintezė įvedant pakaitus į 5 padėtį

Jei cheminė reakcija vykdoma ledinės acto rūgšties aplinkoje su dvigubu kiekiu aromatinio aldehido, reakcija vyksta į abi padėtis: [36] (8 pav.).

(23)

S N S NH2 O

+

R O H 2 CH3COOH led. S N S N O R R

+

H O 2 2

8 pav. Radikalų įvedimo į 3 ir 5 padėtį reakcijos schema

Šiomis reakcijos sąlygomis buvo atliktos reakcijos (XII-XIV) ir gauti junginiai pavadinti EK-8, EK-11, EK-14 (9 pav.).

S N S NH2 O XII XIII XIV S N N O N+ O -O N+ O -O S EK-8 EK-11 EK-14 S N N O N+ O -O S N+ O -O S N S N Cl Cl O N+ O -O O

9 pav. Junginių sintezė įvedant pakaitus į 5 padėtį

Jei reakcija vykdoma metanolinėje arba etanolinėje aplinkoje su katalizatoriumi 37% vandenilio chlorido rūgšties, aromatinis aldehidas prisijungia prie amino grupės, tačiau 3-amino rodanino žiedas išsiskleidžia [28] (10 pav.).

(24)

S N S NH2 O

+

HCl OH -R H N NH S S O O CH3 R O H

10 pav. Sintezė išskleidžiant 3-amino rodanino žiedą

3-amino rodanino žiedo atsidarymo cheminės reakcijos metu mechanizmas [28] (11 pav.):

11 pav. 3-amino rodanino žiedo atsidarymo reakcijos metu mechanizmas

Kadangi buvo įdomu išsiaiškinti, ar junginiai su atvertu 3-amino rodanino žiedu turi antimikrobinį aktyvumą, šiomis reakcijos sąlygomis buvo atlikta reakcija (XV) ir gautas junginys pavadintas EK-13 (12 pav.).

S N S NH2 O

+

H N NH S S O O CH3 Cl EK-13 XV O H Cl HCl/C2H5OH

12 pav. Cheminė reakcija, jungiant pakaitą į 3 padėtį atidarant 3-amino rodanino žiedą

Alifatiniai aldehidai pasižymi priešgrybelinėmis savybėmis [42], aromatiniai - suteikia stiprų antimikrobinį veikimą [30]. 5-ariliden-4-tiazolidinonai su fluoro, chloro, nitro pakaitais yra biologiškai aktyvūs [38]. Taip pat įvairių pakaitų įvedimas į tiazolidinonų aktyvias padėtis suteikia jiems antimikrobinių savybių [33]. Todėl į 3-ią ir 5-ą 3-amino rodanino padėtis buvo jungiami aromatiniai aldehidai su chloro, amino, nitro, etilo radikalais -orta, -meta arba -para padėtyse. Tikėtasi, kad laisva

(25)

amino grupė suteiks didesnį aktyvumą [46], todėl sintezė buvo orientuota į penktos padėties radikalų įvedimą, palyginant gautų junginių aktyvumą su kitais sintezuotais junginiais.

2.4. 3-amino darinių sintezė, identifikavimas ir grynumo nustatymas

Susintetinta penkiolika 3-amino rodanino junginių su pakaitais 3-ioje ir 5-oje padėtyse. Iš jų 4 (EK-9, EK-11, EK14 ir EK16) mokslinėje duomenų bazėje (pubchem, chemspider, emolecules) yra neaprašyti ir neminimi. Junginys EK-1 sintetintas klasikiniu būdu, aprašytu literatūroje leidžiant C02 dujas

ir jungiant 5-nitro-2furaldehid-diacetatą į trečią aktyvią 3-amino rodanino padėtį, bei mikro bangų įtakoje. Vykdytos reakcijos sunumeruotos romėniškais skaitmenimis I-XV.

Gautų perkristalintų junginių lydymosi temperatūros nustatytos Koflerio lydymosi temperatūros nustatymo aparatu su mikroskopu ir yra nekoreguotos.

Reakcijų eiga stebėta chromatografiškai. Naudota Silufol UV 150x150 mm Avalier plokštelės, ryškinta UV spinduliais, purškiama vario sulfatu. Lyginama su pradinėmis medžiagomis.

Gautų junginių grynumas tirtas su Waters 2695 chromatografu.

2.4.1. 3-pakeistų 3-amino-2-tiokso-1,3-tiazolidin-4-onų sintezė (EK-1, EK-3, EK-9,

EK-6)

I reakcija mikro bangų aplinkoje. 1,5 g 3-amino rodanino (0,0101 mol) 10-je ml izopropilo alkoholio susmulkinama ultragarso vonelėje. Maišant šildoma ant magnetinio kaitintuvo kol ištirps. 1,424 g (0,0101 mol) nitrofuraldehido tirpinama šiltame 5 ml izopropilo alkoholyje, kuris supilamas į 3-amino rodanino tirpalą ir kaitinamas prijungtas prie grįžtamojo šaldytuvo mikrobangų krosnelėje 5 minutes, 400 W. Iškrenta geltonos spalvos nuosėdos, kurios filtruojamos vakuuminiu siurbliu, plaunamos etanoliu ir džiovinamos kambario temperatūroje. Kadangi reakcijos išeiga panaši į klasikinio metodo (klasikinio 72%, mikro bangų – 85%), o reakcijos greitis sutrumpėjo 5 kartus, aprašomos EK-1 junginio charakteristikos darytos šiuo metodu.

(26)

II-IV reakcijos. 0,5 g 3-amino rodanino (0,003 mol) 10-yje ml izopropilo alkoholio susmulkinama ultragarso vonelėje. Maišant šildoma ant magnetinio kaitintuvo kol ištirps. Pridedama 0,003 mol atitinkamo aldehido. Kaitinama iki nuosėdų iškritimo. Susidariusios nuosėdos filtruojamos vakuuminiu siurbliu, plaunamos etanoliu ir džiovinamos kambario temperatūroje. EK-3 kaitintas 1,5 valandos, EK-9 – 1 valandą, EK-6 – 3 valandas.

Šiomis reakcijų sąlygomis sintezuoti šie junginiai: 3-[(5-nitrofuran-2-yl)metilidenamino]-2-sulfaniliden-1,3-tiazolidin-4-onas (EK-1), [(2,6-dichlorofenil)metilidenamino]-2-sulfaniliden-1,tiazolidin-4-onas (EK-3), [(4-nitrofenil)metilidenamino]-2-sulfaniliden-1,[(2,6-dichlorofenil)metilidenamino]-2-sulfaniliden-1,tiazolidin-4-onas (EK-9), 3-[(3-nitrofenil)metilidenamino]-2-sulfanilidene-1,3-tiazolidin-4-onas (EK-6).

Junginiai EK-1, EK-6, EK-9 kristalinti iš ledinės acto rūgšties, o EK-3 izopropilo alkoholyje. Jų lydimosi temperatūros, šifrai, molekulinė masė ir išeiga nurodoma 1 lentelėje.

1 lentelė. 3-pakeistų 3-amino-2-tiokso-1,3-tiazolidin-4-onų (EK-1, EK-3, EK-6, EK-9) charakteristikos S N S N O R

Junginio šifras R Išeiga (%)/reakcijos

laikas (min.) Lydimosi t. (ºC)

Mol. Formulė (Mr.) EK-1 C H3 O N+ O -O 80/5 180-183 C8H5N3O4S2 271,27 EK-3 H3C Cl Cl 82/90 199-201 C10H6Cl2N2OS2 305,20 EK-6 C H3 N+ O -O 50/180 250-253 C10H7N3O3S2 281,31 EK-9 H3C N+ O -O 78/60 198-201 C10H7N3O3S2 281,31

(27)

2.4.2. 5-pakeistų 3-amino-2-tiokso-1,3-tiazolidin-4-onų sintezė (EK-2, EK-4, EK-7,

EK-10, EK-15, EK-16, EK-22)

V-XI reakcijos. 0,5 g 3-amino rodanino (0,003 mol) 10-yje ml izopropilo alkoholio susmulkinama ultragarso vonelėje. Maišant šildoma ant magnetinio kaitintuvo kol ištirps. Į maišomą tirpalą pilama 0,6 ml koncentruoto amoniako tirpalo ir 0,3 g amonio chlorido ištirpinto 0,6 ml distiliuoto vandens. Tirpalas paraudonuoja. Pridedama 0,003 mol atitinkamo aldehido, kaitinama iki nuosėdų susidarymo. Maišoma šildant dar 15 minučių. Nuosėdos filtruojamos vakuuminiu siurbliu, plaunamos etanoliu ir džiovinamos kambario temperatūroje. EK-2 kaitintas 1h, EK-4 - 20min, EK-7 - 20min, EK-10 - 30min, EK-15 - 30min, EK-16 - 45min, EK-22 - 3val.

Šiomis reakcijų sąlygomis sintezuoti šie junginiai: (5Z)-3-amino-5-(4-chlorobenziliden)-2-tiokso-1,3-tiazolidin-4-onas (EK-2), (5Z)-3-amino-5-(2,6-dichlorobenzilidene)-2-tiokso-(5Z)-3-amino-5-(4-chlorobenziliden)-2-tiokso-1,3-tiazolidin-4-onas (EK-4), (5Z)-3-amino-5-(3-nitrobenziliden)-2-thiokso-1,3-tiazolidin-4-onas (EK-7), (5Z)-3-amino-5-(4-nitrobenzilidene)-2-tiokso-1,3-tiazolidin-4-onas (EK-10), (5E)-3-amino-5-{[4-(dimethylamino)phenyl]metilidene}-2-sulfaniliden-1,3-tiazolidin-4-onas (EK-15), 3-amino-5-[(4-etilfenil)metiliden]-2-sulfaniliden-1,3-tiazolidin-4-onas (EK-16), 3-amino-5-[(2S,6`R)-7-chloro-2`,4,6-trimetoksi-6`metil-3H,4`-spiro[1-benzofuran-2,1`-cikloheks[2]en-3,4-dion-2-tiokso-1,3-tiazolidin-4-onas (EK-22).

Junginiai 2, 4, 10, 15, 16, 22 kristalinti iš ledinės acto rūgšties, o EK-7 iš butanolio. Jų lydimosi temperatūros, šifrai, molekulinė masė ir išeiga nurodoma 2 lentelėje.

2 lentelė. 5-pakeistų 3-amino-2-tiokso-1,3-tiazolidin-4-onų (2, 4, 7, 10, EK-15, EK-16, EK-2) charakteristikos

S N S NH2 O R

Junginio šifras R Išeiga (%)/reakcijos

laikas (min.) Lydimosi t. (ºC)

Mol. Formulė (Mr.)

(28)

EK-2 Cl CH3 61/60 216-219 C10H7ClN2OS2 270,75 EK-4 CH3 Cl Cl 76/20 157-161 C10H6Cl2N2OS2 305,20 EK-7 N+ O -O CH3 81/20 250-254 C10H7N3O3S2 281,31 EK-10 N+ CH3 O -O 83/30 238-241 C10H7N3O3S2 281,31 EK-15 N CH3 C H3 C H3 45/30 231-233 C12H13N3OS2 279.38 EK-16 CH3 C H3 50/45 118-120 C12H12N2OS2 264,37 EK-22 O CH3 C H3 O O C H3 O CH3 Cl O 40/180 225-229 C20H19ClN2O6S2 482,96

2.4.3. 3,5-pakeistų 3-amino-2-tiokso-1,3-tiazolidin-4-onų sintezė (8, 11,

EK-14)

(29)

XII-XIII reakcijos. 0,5 g 3-amino rodanino (0,003 mol) 10-yje ml ledinės acto rūgšties susmulkinama ultragarso vonelėje. Maišant šildoma ant magnetinio kaitintuvo kol ištirps. Pridedama 0,006 mol atitinkamo aldehido, kaitinama iki nuosėdų susidarymo. Maišoma šildant dar 15 minučių. Nuosėdos filtruojamos vakuuminiu siurbliu, plaunamos ledine acto rūgštimi, eteriu, džiovinamos kambario temperatūroje. EK-8 kaitintas 2 valandas, o EK-11 - 1,5 valandos.

XIV reakcija. 0,7 g EK-1 (0.0025 mol) 10-yje ml ledinės acto rūgšties susmulkinama ultragarso vonelėje. Maišant šildoma ant magnetinio kaitintuvo kol ištirps. Pridedama 0,003 mol atitinkamo aldehido, kaitinant tirpalas tamsėja. Šildoma iki nuosėdų susidarymo. Nuosėdos filtruojamos vakuuminiu siurbliu, plaunamos ledine acto rūgštimi, eteriu, džiovinamos kambario temperatūroje. EK-14 kaitintas 3,5 valandos.

Šiomis reakcijų sąlygomis sintezuoti šie junginiai: 5-[(3-nitrofenil)metiliden]-3-[(3-nitrofenil)metilidenamino]-2-sulfaniliden-1,3-tiazolidin-4-onas (EK-8), 5-[(4-nitrofenil)metiliden]-3-[(4-nitrofenil)metilidenamino]-2-sulfaniliden-1,3-tiazolidin-4-onas (EK-11), 5-[(5-nitrofuran-2-yl)metiliden]-3-[(2,6-dichlorofenil)metilidenamino]-2-sulfaniliden-1,3-tiazolidin-4-onas (EK-14).

Junginys EK-8 kristalintas iš ledinės acto rūgšties, o EK-11 ir EK-14 iš butanolio. Jų lydimosi temperatūros, šifrai, molekulinė masė ir išeiga nurodoma 3 lentelėje.

3 lentelė. 3,5-pakeistų 3-amino-2-tiokso-1,3-tiazolidin-4-onų (EK-8, EK-11, EK-14) charakteristikos S N S N O R1 R2 Junginio šifras R1 R2 Išeiga (%)/reakcijos laikas (min.) Lydimosi t. (ºC) Mol. Formulė (Mr.) EK-8 CH3 N+ O -O C H3 N+ O -O 48/120 174-176 C17H10N4O5S2 414,42 EK-11 N+ CH3 O -O C H3 N+ O -O 58/90 208-213 C17H10N4O5S2 414,42

(30)

EK-14 CH3 Cl Cl C H3 O N+ O -O 40/210 175-178 C15H9N3O4S2 426,25

2.4.4. Sintezė prijungiant aromatinį aldehidą, kai 3-amino rodanino žiedas

išsiskleidžia

XV reakcija. 0,5 g 3-amino rodanino (0,003 mol) 10-yje ml etanolio susmulkinama ultragarso vonelėje. Maišant šildoma ant magnetinio kaitintuvo kol ištirps. Pridedama 0,0045 mol p-chlorbenzaldehido, tirpalas parūgštinamas 3 lašais 37% vandenilio chlorido rūgštimi. Kaitinama iki nuosėdų susidarymo. Maišoma šildant dar 15 minučių. Nuosėdos filtruojamos vakuuminiu siurbliu, plaunamos ledine acto rūgštimi, eteriu, džiovinamos kambario temperatūroje traukos spintoje. EK-13 kaitintas 5 valandas.

Šia reakcijos sąlyga sintezuotas junginys etoksikarbonilmetil-3-(4-chlorobenziliden)-ditiokarbazatas (EK-13).

Junginys EK-13 kristalintas iš ledinės acto rūgšties. Jo lydimosi temperatūra, šifras, molekulinė masė ir išeiga nurodoma 4 lentelėje.

4 lentelė. Etoksikarbonilmetil-3-(4-chlorobenziliden)-ditiokarbazato (EK-13) charakteristikos H N NH S S O O CH3 R

Junginio šifras R Išeiga (%)/reakcijos

laikas (min.) Lydimosi t. (ºC)

Mol. Formulė (Mr.)

EK-13 Cl CH3 70/300 145-147 C12H13ClN2O2S2

(31)

2.5. Junginių (EK-1 – EK-22) grynumo nustatymas

Grynumo tyrimams taikytas efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) pokolonėlinis metodas. Analizė atlikta su Waters 2695 chromatografu. Veikliųjų junginių atskyrimui naudota C 18 4,6×250 mm, 5 µm ACE kolonėlė, kuri analizės metu laikyta išoriniame termostate, palaikant 25ºC temperatūrą. Analizės metu injekuota 10 µl tiriamo tirpalo. Mobilios fazės greitis 1ml min-1

. Naudota tokia gradiento sistema: tirpalas A – 0,05% trifluoracto rūgštis vandenyje, tirpalas B – acetonitrilas; 0 min – 30% A ir 70% B, 15 min – 20% A ir 80% B, 20 min – 10% A ir 90% B, 21 min – 30% A ir 70% B. Atskirti veiklieji junginiai tirti su fotodiodų matricos detektoriumi Waters 996 PDA esant tokiam bangos ilgiui, prie kurio jų absorbicija didžiausia. Gauti chromatografinio grynumo rezultatai bei bangos ilgis (-iai), prie kurio(-ių) absorbcija yra didžiausia (Λmax), pateikiami 5 lentelėje. ESC tyrimo rezultatai

grafiškai pateikiami 1 priede, nurodant atsiskyrusius priemaišų ir grynos medžiagos pikus ir jų UV spektrus.

2.5.1. Elementinė sieros analizė Šionigerio metodu

Bario chlorato tirpalo gamyba:

Mikroanalitinėmis svarstyklėmis atsveriama 0,9868 g bario karbonato, išdžiovinto 105ºC. Atsverta medžiaga supilama per piltuvėlį į 1l matavimo kolbą. Į ją įlašinama 2 g 57% perchlorato rūgšties, kurios lyginamasis svoris 1,500 g/cm3, V= 1,3 ml. Aliuminio folija, ant kurios buvo sveriamas bario karbonatas, praplaunama 10 ml distiliuoto vandens ir į matavimo kolbą įpilama dar 10 ml distiliuoto vandens. Kolbos turinys maišomas, kol ištirpsta bario karbonatas, įlašinant dar 5 lašus perchlorato rūgšties. Po to įpilama 80 ml distiliuoto vandens, tirpalas praskiedžiamas etanoliu iki 1 l. Tirpalo pH~ 3.

Sieros kiekio nustatymas:

Pasveriamas tikslus kiekis analizuojamos medžiagos (apie 0,003-0,005 g.). Sveriama ant specialios formos bepelenio filtro mikroanalitinėmis svarstyklėmis. Kiekvienos tiriamos medžiagos

(32)

daroma po 3 mėginius. Į kolbas su šlifais pripilama po 4ml distiliuoto vandens ir įlašinama po 4 lašus 30% perhidrolio. Sulankstytas bepelenis filtras įdedamas tarp platininės vielos gabaliukų, pritvirtintų prie kolbos kamščio. Kolbos pripildomos deguonimi, filtras su medžiaga padegamas ir sudeginamas uždarius kolbas deguonies aplinkoje. Kolbos purtomos apie 30 min, kol išsisklaido kolboje susidaręs rūkas. Kolbos sienelės ir platinos vielos tinklelis praplaunami 16 ml acetono. Tirpalas titruojamas 0,005 M bario chlorato tirpalu, įlašinus indikatorių: 3 lašus 0,2% vandenilio torino tirpalo ir 2 lašus 0,0125% vandenilio metileno mėlio tirpalo. Titruojama, kol tirpalo spalva iš melsvai žalios pasikeičia į žalsvai rožinę. Sieros kiekis procentais tiriamajame junginyje nustatomas pagal formulę:

S%=n x M x V x F x 100 / a kai n – sieros atomų skaičius junginio molekulėje;

M – bario chlorato molinė koncentracija;

V – titravimui sunaudotas bario chlorato tirpalo kiekis ml; F – faktorius

a – atsvertas tiriamojo junginio kiekis mg.

Apskaičiuotas ir rastas S% rezultatų vidurkis (n=3) nurodomas 5 lentelėje.

5 lentelė. Junginių (EK-1 – EK-22) grynumas (%) ir jų UV spektro absorbcijos maksimumas (λmax)

Junginio struktūrinė formulė/šifras Grynumas

(%) Λmax Elementinė sieros apskaičiuota/ rasta (%) S N O S N O N+ O -O EK-1 93,48 231,2 294,8 23,64/23,54 S N S NH2 O Cl EK-2 99,67 374,2 23,69/23,73

(33)

S N O S N Cl Cl EK-3 97,91 218,3 290,1 21,01/22,11 S N S NH2 O Cl Cl EK-4 95,88 339,9 21,01/22,23 S N S N O N+ O -O EK-6 94,46 264,1 359,7 22,80/22,68 N+ O -O S N S NH2 O EK-7 99,64 264,1 362,7 22,80/22,75 S N N O N+ O -O S N+ O -O EK-8 85,56 279,5 15,45/14,20

(34)

S N S N O N+ O -O EK-9 100 291,3 22,80/22,84 N+ O -O S N S NH2 O EK-10 100 377,8 22,80/22,75 S N N O N+ O -O N+ O -O S EK-11 72,97 281,8 380,2 15,45/15,18 H N NH S S O O Cl CH3 EK-13 87,58 287,7 20,24/20,01 S N S N Cl Cl O N+ O -O O EK-14 85,59 311,4 415,0 15,05/14,89

(35)

S N S NH2 O N CH3 C H3 EK-15 98,54 313,8 472,9 22,95/22,91 S N S NH2 O C H3 EK-16 99,76 380,2 24,26/24,33 S N S NH2 O O O C H3 O C H3 Cl C H3 O CH3 O EK-22 99,13 235,9 292,5 13,28/13,19

2.6. Tiazolidinono darinių antimikrobinio aktyvumo įvertinimas

2.6.1. 3-amino rodanino darinių biologinio aktyvumo įvertinimas

Biologinio aktyvumo įvertinimas buvo atliktas naudojant PASS (Prediction of Activity Spectra for Substances) programą. Pagal junginio struktūrinę formulę programa nuspėja junginiui galimą biologinį veikimą iš 3678 farmakologinio veikimo variantų, veikimo mechanizmus, toksiškumą, įskaitant mutageniškumą, kancerogeniškumą, teratogeniškumą ir embriotoksiškumą [57, 58]. Rodiklis Pa parodo junginio tikimybę turėti tam tikrą biologinį aktyvumą. Rodiklis Pi – tikimybę, kad tokio aktyvumo neturės. PASS programa sukurta naudojant 20000 pagrindinių junginių iš MDDR (ang. MDL Drug Data Report) duomenų bazės, kurią sudaro daugiau kaip 180000 biologiškai svarbių junginių. Duomenų bazė yra nuolat atnaujinama [53, 60].

(36)

Pasak autorių, net esant mažoms Pa>Pi reikšmėms, junginių atmesti nereikėtų, nes jie vis tiek priimami kaip galimai aktyvūs. Kai Pa>0,700, tikimybė, kad eksperimentiškai bus nustatytas aktyvumas yra didelė, tačiau kai kuriais atvejais preparatas gali būti žinomų farmacinių preparatų analogas. Kai 0,5<Pa<0,7 – tikimybė, kad bus nustatytas aktyvumas yra mažesnė, tačiau junginys nėra toks panašus į jau žinomus farmacinius preparatus. Kai Pa<0,5 - tikimybė nustatyti aktyvumą yra dar mažesnė, tačiau jei būtų nustatyta – junginys gali būti nauja chemine medžiaga, galbūt tapsiančia vaistu (ang. New Chemical Entity, NCE) [53, 60]. Pagal FDA (U.S. Food and Drug Administration, JAV Maisto ir vaistų ministerija), NCE – naujas cheminis junginys, turintis reikšmingą aktyvumą, kuris nėra patvirtintas ir (ar) registruotas [58].

Susintezuotų junginių (EK-1 – EK-22) biologinio aktyvumo ir toksiškumo PASS prognozė pateikiama 6 lentelėje.

6 lentelė. PASS programos biologinio aktyvumo ir toksiškumo prognozė sintezuotiems junginiams

Junginys Pa>Pi Anti b ak te rin is Pr iešgr yb eli n is T er atoge n išk as E m b riotok siš k as M u tage n išk as Karc in oge n išk as EK-1 0,514>0,015 0,601>0,018 0,496>0,050 0,516>0,046 0,367>0,012 0,613>0,010 EK-2 - 0,394>0,051 - - - - EK-3 - 0,394>0,051 - - - 0,159>0,137 EK-4 - 0,347>0,064 - - - - EK-6 0,291>0,064 0,295>0,083 - - 0,233>0,024 0,331>0,044 EK-7 0,208>0,110 0,353>0,062 - - 0,083>0,078 0,188>0,100 EK-8 0,254>0,081 0,336>0,068 - - 0,110>0,061 0,231>0,082 EK-9 0,320>0,053 0,320>0,730 - - 0,204>0,03 0,315>0,048 EK-10 0,234>0,092 0,381>0,054 - - - 0,184>0,104 EK-11 0,281>0,067 0,363>0,059 - - 0,092>0,071 0,219>0,089 EK-13 0,229>0,095 0,441>0,041 0,376>0,073 0,382>0,069 0,120>0,056 0,655>0,008 EK-14 0,446>0,022 0,610>0,017 0,460>0,055 0,493>0,049 0,272>0,019 0,813>0,005 EK-15 0,177>0,139 0,284>0,088 - - - 0,150>0,136

(37)

EK-16 0,184>0,133 0,348>0,064 - - - - EK-22 0,365>0,039 0,604>0,018 0,720>0,020 0,694>0,023 - 0,313>0,049

2.6.2. 3-amino rodanino darinių priešmikrobinio aktyvumo tyrimai in vitro

Susintetintiems junginiams (EK-1 – EK-22) buvo atliktas mikrobiologinis tyrimas in vitro, tiriant aktyvumą šioms bakterijų ir grybelių kultūroms:

Staphylococcus aureus ATCC 25923

Bacillus subtillis ATCC 6633

Klebsiella pneumoniae ATCC 13883

Escherichia coli ATCC 25922

Bacillus cereus NCIMB 50014

Proteus mirabilis ATCC 12453

Enterococcus faecalis ATCC 29212

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

Candida albicans ATCC 60193

1 parą prieš tyrimą, bakterijų ir grybelių kultūros buvo auginamos termostate 10 ml talpos mėgintuvėliuose ant nuožulnaus Miulerio-Hintono agaro (bakterijos) ir ant nuožulnaus saburo agaro (grybelis). Termostate (35 ºC) laikomos 20-24 valandas. Po tyrimo laikomos šaldytuve (2–8 ºC

temperatūroje).

Šios kultūros sintezuotų junginių biologinio aktyvumo tyrimui buvo pasirinktos dėl savo skirtingos struktūrinės sandaros. Gram+ (S.aureus, B.subtillis, B.cereus, E.faecalis), Gram- (E.coli, P.mirabilis, P.aeruginosa, K.pneumoniae) bakterijos ir mielinis grybelis (C.albicans). Iš jų sudarančios sporas:B.subtilis ir B.cereus, šliaužianti - P.mirabilis, sudaranti kapsulę - K.pneumoniae.

Bakteriostatinės (fungistatinės) junginių koncentracijos nustatytos serijinio skiedimo būdu standžioje terpėje (Mueller-Hinton agar oxoid LTD Basingstoke, Hamgshire, England).

Etaloninių mikroorganizmų kultūrų paruošimas. 1 parą prieš junginių biologinio aktyvumo nustatymą, etaloninės kultūros buvo auginamos 20-24 val. 35-37 ºC temperatūroje ant Miulerio-Hintono

(38)

agaro (grybelis ant Saburo agaro). Mikrobų suspensija gaminta iš išaugintų mikrobų kultūrų fiziologiniame natrio chlorido tirpale (0,9 %). Į kelis mililitrus tirpalo sterilia kilpele buvo perkeliama pasirinkta kultūra. Mėgintuvėlis supurtomas ir matuojamas jo drumstumas standartiniu McFarland indikatoriumi. Kai jo reikšmė lygi 0,5 (1ml mikrobų suspensijos yra 1,5 x 108 mikrobų ląstelių) suspensija laikoma standartizuota.

Tiriamųjų junginių paruošimas mikrobiologiniam tyrimui. Sintezuotus junginius nuspręsta tirpinti dimetilsulfokside (DMSO), nes jie blogai arba visai netirpūs vandenyje bei alkoholyje. Atsižvelgiant į sintezuotų junginių grynumą (%), paskaičiavimui, kiek reikia atsisverti medžiagos tirpalo gamybai, buvo taikoma formulė:

Svoris(mg) = gaminamo tirpalo tūris(ml) x reikiama koncentracija μg/ml / veikimo potencija μg/mg

Pvz.: 99,4 % junginio grynumo veikimo potencija yra 994 μg/mg [39].

Medžiagos buvo sveriamos analizinėmis svarstyklėmis. Pagamintas pagrindinis tiriamųjų junginių tirpalas (8000 μg/ml) DMSO buvo skiedžiamas taip gaunant mažesnių koncentracijų (4000 μg/ml, 2000 μg/ml, 1000 μg/ml, 500 μg/ml, 250 μg/ml ) tirpalus. Atitinkamas kiekis praskiesto tiriamo junginio tirpalo aseptinėmis sąlygomis buvo perkeliamas sterilia automatine pipete į sterilų matavimo cilindrą. Išlydyta Miulerio-Hintono terpė buvo laikoma šiltoje vandens vonioje (56 ºC ), kad nesustengtų. Į cilindrą su tiriamojo junginio tirpalu buvo pilama šilta Miulerio-Hintono terpė iki 10 ml. Terpė gerai sumaišius greitai buvo išliejama į sterilią Petri lėkštelę. Kai terpė sustengo, buvo sėjamos standartizuotos mikrobų kultūrų suspensijos su sterilia kilpele po 0,1 ml. Kiekvienai mikrobų kultūrai naudota vis kita sterili kilpelė. Pasėtai mikrobų kultūrų suspensijai išdžiūvus, Petri lėkštelės įdėtos į termokamerą ir laikytos 24 valandas esant 37 ºC.

DMSO pasižymi priešmikrobinėmis savybėmis, todėl lygiagrečiai buvo atliekamas kontrolinis bandymas be tiriamosios medžiagos. Nustatyta koncentracija, kurioje DMSO veikimas nepasireiškia.

Išėmus bandinius iš termokameros buvo vertinamas mikrobų augimas ir lyginamas su kontroliniu bandymu. Nustatomas mažiausias praskiedimas, kuriame mikrobai neauga. Tai yra mažiausioji slopinančioji koncentracija (MSK), kurioje pasireiškė tiriamojo junginio bakteriostatinis (grybeliui – fungistatinis) veikimas.

Prieš atliekant sintezuotų junginių biologinį tyrimą, nuspręsta, kad didžiausia koncentracija, kuri bus tikrinama – 400 μg/ml. Atsižvelgiant į tirpalo koncentracijos mažėjimą tirpalą skiedžiant Miulerio-Hintono agaru iki 10 ml, imti atitinkami mažesnių pagrindinio tirpalo koncentracijų tirpalų kiekiai ir

(39)

aktyvumas tirtas esant koncentracijoms: 400, 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,5625 μg/ml. Junginių aktyvumo palyginimui pasirinktas 3-amino rodaninas, nes jis yra pagrindinė sintezuotų junginių struktūrinė dalis. Taip pat antibiotikas nitrofurantoinas dėl savo struktūrinio panašumo. Tirtų junginių MSK pateikiamas 7 lentelėje. Tyrimai kartoti 3 kartus, n=3. Visi rezultatai pasikartojo, be to buvo lyginama su standartais (3-amino rodaninu, nitrofurantoinu, DMSO ir kontrole), todėl rezultatai statistiškai patikimi.

7 lentelė. Antimikrobinio aktyvumo tyrimų rezultatai (vidurkis,n=3)

Junginys MSK, μg/ml S. aure us AT C C 25923 B.subti ll is AT C C 6633 K. pne umoni a e AT C C 13883 E. coli AT C C 25922 B. ce re us NCIMB 50014 P. mirabi li s AT C C 12453 E. faec ali s AT C C 29212 P. ae rugi nosa AT C C 27853 C. albi cans AT C C 60193 1 2 3 4 5 6 7 8 9 EK-1 3,125 3,125 100 12,5 1,5625 25 25 50 25 EK-2 >400 >400 >400 >400 >400 >400 >400 >400 >400 EK-3 25 400 >400 >400 200 >400 >400 >400 50 EK-4 >400 >400 >400 >400 >400 >400 >400 >400 200 EK-6 400 >400 >400 >400 >400 >400 >400 >400 400 EK-7 >400 >400 >400 >400 >400 >400 >400 >400 >400 EK-8 25 400 >400 >400 400 >400 >400 >400 100 EK-9 200 200 >400 >400 >400 >400 >400 >400 100 EK-10 >400 >400 >400 >400 >400 >400 >400 >400 >400 EK-11 400 >400 >400 >400 >400 >400 >400 >400 200 EK-13 25 200 >400 >400 200 >400 >400 >400 50 EK-14 6,25 50 >400 >400 3,125 >400 50 >400 50 EK-15 >400 >400 >400 >400 >400 >400 >400 >400 >400 EK-16 >400 >400 >400 >400 >400 >400 >400 >400 >400

(40)

EK-22 >400 >400 >400 >400 >400 >400 >400 >400 400 3-amino

rodaninas 25 400 >400 >400 200 400 >400 200 100

(41)

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1. 3-amino darinių antimikrobinio aktyvumo prognozės įvertinimas

EK-1 – EK-22 aktyvumo prognozė buvo nustatyta PASS programa [62]. Iš penkiolikos sintezuotų junginių visiems buvo prognozuojamas priešgrybelinis aktyvumas, o 12 – priešmikrobinis. Pa>0,7 nebuvo prognozuojamas nei vienam junginiui. 3 junginiams (EK-2, EK-3, EK-4) priešmikrobinio aktyvumo tikimybė nebuvo pateikiama. Daugumai junginių ji svyravo tarp 0,1<Pa<0,4, tik trims buvo prognozuojama Pa>0,6 priešgrybeliniam aktyvumui (EK-1, EK-14, EK-22). Didžiausia antimikrobinė tikimybė (Pa>0,5) buvo pateikta junginiui EK-1. Atsižvelgiant į prognozuotų aktyvumo reikšmių santykį, sintezuoti junginiai turėjo pasižymėti labiau priešgrybelinėmis nei antibakterinėmis savybėmis. Būtina paminėti, kad visiems junginiams, išskyrus EK-22, EK-2, EK-3, buvo prognozuojamas antituberkuliozinis veikimas. EK-1 prognozuotas Pa>Pi = 0,805>0,003, o EK-6, EK-8, EK-9, EK-11 - Pa>0,6. Taip pat daugeliui junginių prognozuojamas antihelmintinis aktyvumas, todėl būtų tikslinga eksperimentiškai ištirti ir patikrinti prognozes. Sintezuotų junginių antibakterinio ir priešgrybelinio aktyvumo prognozė pateikiama 13 pav.

(42)

3.2. 3-amino darinių toksiškumo prognozės įvertinimas

PASS programa gali nustatyti ne tik aktyvumo, bet ir toksiškumo tikimybę. Todėl buvo įdomu sužinoti kokie galimi žalingi poveikiai prognozuojami sintezuotiems junginiams EK-1 – EK-22. Paaiškėjo, kad teratogeniškumas yra galimas 4 junginiams (EK-1, EK-13, EK-14, EK-22) , mutageniškumas – 8, embriotoksiškumas – 4, o kancerogeniškumas – 12. Tik 3 junginiams toks toksiškas poveikis nebuvo pateikiamas (EK-2, EK-4, EK-16). EK-3, EK-10 ir EK-15 junginiams prognozuota tik po 1 toksiškumo rūšį – kancerogeniškumą, su tikimybe <0,2. Didžiausią toksiškumo tikimybės reikšmę turi junginys EK-14 (kancerogeniškumo Pa>Pi=0,813>0,005), taip pat jam prognozuojami: teratogeniškumas, mutageniškumas ir embriotoksiškumas. Visomis tirtomis toksiškumo rūšimis pasižymi ir EK-13, tačiau tikimybių reikšmės yra mažesnės nei EK-14 (14 pav.).

14 pav. Sintezuotų junginių toksiškumo prognozė atlikta PASS programa

Atsižvelgiant į gautus rezultatus, tik 3 junginiai su Pa>0,5 buvo prognozuojami kaip galimai aktyvūs: EK-1, EK-14 ir EK-22. Junginių EK-1 ir EK-14 struktūra labai panaši. Jos pagrindą sudaro nitrofurano žiedas, prijungtas prie amino grupės trečioje 3-amino rodanino padėtyje. Vienintelis skirtumas – EK-14 turi prijungtą 2,6-dichlorbenzaldehidą penktoje 3-amino rodanino padėtyje. Pastarasis radikalas

(43)

šiek tiek sustiprino priešgrybelinio veikimo prognozę, lyginant su EK-1, tačiau sumažino antimikrobinio veikimo tikimybę. Vienintelis junginys EK-1 perkopia 0,5 tikimybę tiek antibakteriniam, tiek priešgrybeliniam veikimui. Šių junginių struktūrinės formulės ir antimikrobinio veikimo prognozė pateikiama 8 lentelėje

8 lentelė. Aktyviausių prognozuojamų junginių struktūrinės formulės

Junginys Pa>Pi Antibakterinis Priešgrybelinis S N O S N O N+ O -O EK-1 0,514>0,015 0,601>0,018 S N S N Cl Cl O N+ O -O O EK-14 0,446>0,022 0,610>0,017 S N S NH2 O O O C H3 O C H3 Cl C H3 O CH3 O EK-22 0,365>0,039 0,604>0,018

3.3. 3-amino rodanino darinių antimikrobinio veikimo rezultatų įvertinimas

EK-1 – EK-22 buvo sintezuoti įvedant įvairius pakaitus į 3,5 arba abi 3-amino rodanino padėtis. Su pakaitais trečioje padėtyje susintezuoti 4 junginiai ir 1 prie amino grupės turintis pakaitą, tačiau su

Riferimenti

Documenti correlati

Modello 730Istruzioni per la compilazione 2016 Se il lavoratore dipendente (ad esempio colf, baby-sitter o assistente delle persone anziane) non è in possesso della

L’andamento della curva di durata rispecchia il regime idrometrico del corso d’acqua su cui sono state fatte le misure di portata: la Stura di Demonte a monte della

wû pýûyü

[r]

Nella Dimissione Protetta il paziente fragile, che ha superato la fase di acuzie ma non ha ancora esaurito il suo stato di bisogno, viene supportato nella continuità di cura

[r]

[r]

[r]