RODANINO-3-ACTO IR 3-PROPANO RŪGŠČIŲ DARINIŲ SINTEZĖ IR JŲ ANTIBAKTERINIO BEI PRIEŠGRYBELINIO

FARMACIJOS FAKULTETAS VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA

VYTIS PELAKAUSKAS

RODANINO-3-ACTO IR 3-PROPANO RŪGŠČIŲ DARINIŲ SINTEZĖ IR JŲ ANTIBAKTERINIO BEI PRIEŠGRYBELINIO

AKTYVUMO ĮVERTINIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas habil. dr. Eduardas Tarasevičius

Konsultantas dr. Alvydas Pavilonis

KAUNAS, 2013

SANTRAUKA ... 4

SUMMARY ... 5

SANTRUMPOS ... 7

SĄVOKOS ... 8

ĮVADAS ... 9

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12

1.1 Priešmikrobinių medžiagų poreikis ... 12

1.2 Rodanino dariniai ... 13

1.3 Rodanino-3-karboksirūgščių dariniai ... 15

1.4 Nitrofuranai ... 17

1.5 5-fenilfuranilrodanino dariniai ... 21

2. TYRIMO METODIKA ... 23

2.1 Rodanino darinių sintezė ... 23

2.1.1 Rodanino-3-karboksirūgščių sintezė ... 23

2.1.2 5-pakeistų rodanino-3-karboksirūgščių darinių sintezė ... 23

2.1.3 Lydymosi temperatūros nustatymas ... 25

2.1.4 Junginių grynumo nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodu .. 26

2.1.5 Sieros procento nustatymas Šionigerio metodu ... 27

2.2 Priešmikrobinio aktyvumo prognozė in silico ... 28

2.3 Priešmikrobinio aktyvumo tyrimas in vitro ... 29

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 32

3.1 Rodanino darinių sintezė ... 32

3.2 Susintezuotų junginių priešmikrobinis aktyvumas in silico ... 36

3.3 Susintezuotų junginių priešmikrobinis aktyvumas in vitro ... 38

3.4 Struktūros-aktyvumo ryšio dėsningumai ... 46

4. IŠVADOS ... 50

5. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 51

6. PRIEDAI ... 57

Rodanino-3-acto ir 3-propano rūgščių darinių sintezė ir jų antibakterinio bei priešgrybelinio aktyvumo įvertinimas. V. Pelakausko magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas prof. habil. dr. Eduardas Tarasevičius, konsultantas prof. dr. Alvydas Pavilonis; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Vaistų chemijos katedra. – Kaunas.

Darbo tikslas – susintetinti rodanino-3-acto ir 3-propano rūgšties darinius, atlikti jų priešmikrobinį tyrimą ir įvertinti struktūros-aktyvumo ryšio dėsningumus.

Darbo uždaviniai:

1. Susintetinti rodanino-3-acto ir 3-propano rūgštis bei jų darinius, 5-oje rodanino žiedo padėtyje turinčius furano fragmentą.

2. Patikrinti gautų junginių priešmikrobinį aktyvumą in silico (naudojant PASS) ir in vitro (serijinio skiedimo standžioje terpėje metodu).

3. Įvertinti gautų junginių struktūros-aktyvumo ryšio dėsningumus pasitelkiant gautus eksperimentinių tyrimų rezultatus.

Metodai. Junginiai susintetinti klasikiniais metodais. Priešmikrobinis aktyvumas įvertintas naudojant PASS programą ir serijinio skiedimo standžioje terpėje metodus.

Rezultatai. Susintetinta 10 rodanino-3-karboksirūgščių darinių, kurių 5-oje tiazolidinono žiedo padėtyje įjungtas furano fragmentas: 4 junginiuose – nitrofurano, o 6 – 5-fenilfurano žiedas.

PASS prognozuotas didesnis priešgrybelinis aktyvumas. Didesnis anibakterinis aktyvumas prognozuotas nitrofurano žiedą turintiems dariniams. Priešmikrobiniu aktyvumu in vitro pasižymi 5 junginiai – visi nitrofuranai (PV-1 – PV-4) ir vienas 5-fenilfuranas (PV-8). 1 junginys, turintis nitrofurano žiedą, pasižymi priešgrybeliniu aktyvumu (PV-1).

Išvados. Remiantis gautais rezultatais galima teigti, kad aktyvumą junginiams suteikia 5-oje

rodanino žiedo padėtyje esantys 5-nitrofurano pakaitai. Junginiai, kurių rodanino žiedo 3-oje padėtyje

yra propano rūgšties fragmentas, pasižymėjo didesniu aktyvumu. Įvardinti junginio PV-8 struktūros-

aktyvumo ryšio dėsningumus nepavyko, kadangi šis darinys vienintelis pasižymėjo antibakteriniu

aktyvumu iš 5-fenilfurano liekaną turinčių darinių grupės.

Synthesis and assessment of antibacterial and antifungal properties of rhodanine-3- acetic and 3-propionic acid derivatives. V. Pelakauskas Master's Thesis/ Scientific supervisor: prof.

habil. dr. Eduardas Tarasevičius, consultant – prof. dr. Alvydas Pavilonis; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Drug Chemistry. – Kaunas.

The aim of research – synthesis of rhodanine-3-acetic and 3-propionic acid derivatives, antimicrobial evaluation of synthesized compounds and assessment of the structure-activity relationships.

Tasks of research:

1. Synthesis of rhodanine-3-acetic and 3-propionic acid and their derivatives, bearing furan ring moiety in 5th position of rhodanine ring.

2. Evaluation of antimicrobial activity of compounds in silico (using PASS) and in vitro (using a serial dilution in agar technique).

3. Assessment of structure-activity relationship of compounds according experimental results.

Methods. Compounds were synthesized using conventional methods. Antimicrobial activity of compounds was tested using a PASS software and by a serial dilution in agar technique.

Results. Ten rhodanine-3-carboxylic acid derivatives were synthesized bearing furan moiety in the 5th position of thiazolidinone ring. Four compounds have nitrofuran moiety and six – 5- phenylfuran moiety. PASS prognozed higher antifungal activity. PASS prognozed higher antibacterial activity to nitrofuran moiety bearing derivatives. Antimicrobial activity in vitro was seen on five compounds – all nitrofurans (PV-1 – PV-4), and one 5-phenylfuran (PV-8). One compound bearing nitrofuran moiety has antifungal activity (PV-1).

Conclusions. According to results it can be concluded that activity of compounds were

granted by nitrofuran moiety. Activity of compounds is greater when propionic acid moiety is present

in rhodanine ring. Identifying structure-activity relationship patterns of PV-8 compound is complicated

since other five similar derivatives have no antibacterial activity.

PADĖKA

Noriu padėkoti daugeliui žmonių, kurie vienaip ar kitaip yra prisidėję prie šio magistrinio darbo atsiradimo. Esu dėkingas už jų pagalbą, bendradarbiavimą ir palaikymą įgyvendinant užsibrėžtus tikslus.

Visų pirma, norėčiau padėkoti savo mokslinio darbo vadovui prof. E. Tarasevičiui už suteiktą galimybę atlikti šį magistrinį darbą vaistų chemijos katedroje. Esu dėkingas už konsultacijas, pasiūlymus ir pastabas cheminių junginių sintezės klausimais. Taip pat dėkoju už kantrybę, supratimą ir palaikymą.

Esu dėkingas prof. A. Paviloniui už suteiktą galimybę atlikti mikrobiologinius tyrimus jo vadovaujamoje katedroje.

Dr. V. Petrikaitei už laiku suteiktas gaires vykdant mikrobiologinius tyrimus.

Dr. A. Ževžikovienei už magistrinio darbo recenzavimą, darbo klaidų taisymą, pasiūlymus ir pastabas.

Doktorantui L. Šlepikui už konsultacijas ir pasiūlymus junginių sintezės klausimais.

Doktorantui M. Marksai už pagalbą atliekant junginių grynumo įvertinimą.

Taip pat norėčiau padėkoti kolegoms: J. Saliui už pagalbą sintetinant junginius, L. Remeikiui

ir E. Kelmelytei už pagalbą ir palaikymą viso magistrinio darbo metu.

SANTRUMPOS

DMF – dimetilformamidas DMSO – dimetilsulfoksidas

DNR – dezoksiribonukleino rūgštis

ESC – efektyvioji skysčių chromatografija

MRSA – meticilinui atsparus S. aureus (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus) MSK – minimalioji slopinamoji koncentracija

Pa – tikimybė „turi būti aktyvus“ (PASS online vertinimo kriterijus) PASS – Prediction of Activity Spectra for Substances

PBP – peniciliną prijungiantis baltymas (Penicillin-Binding Protein) Pi – tikimybė „turi būti neaktyvus“ (PASS online vertinimo kriterijus) PSO – Pasaulio sveikatos organizacija

QRSA – chinolonui atsparus S. aureus (quinolone-resistant Staphylococcus aureus) RNR – ribonukleino rūgštis

UV-Vis – ultravioletinės spinduliuotės ir regimosios šviesos spektrofotometrija VRE – vankomicinui atsparus E. faecium

µg/ml – mikrogramai mililitre (koncentracijos reiškimo būdas) µM/ml – mikromoliai mililitre (koncentracijos reiškimo būdas) B. cereus – Bacillus cereus

B. subtilis – Bacillus subtilis C. albicans – Candida albicans E. coli – Escherichia coli

E. faecalis – Enterococcus faecalis E. faecium – Enterococcus faecium H. pylori – Helicobacter pylori

K. pneumoniae – Klebsiella pneumoniae M. tuberculosis – Mycobacterium tuberculosis P. aeruginosa – Pseudomonas aeruginosa P. mirabilis – Proteus mirabilis

S. aureus – Staphylococcus aureus

S. pyogenes – Streptococcus pyogenes

S. pneumoniae – Streptococcus pneumoniae

in silico – bandymo metodas panaudojant sudėtingus kompiuterinius modelius.

in vitro – procesas (bandymas, tyrimas), atliekamas arba stebimas ne organizme, bet dirbtinėje sistemoje.

Klasikinis sintezės metodas – sintezė, kuri atliekama nenaudojant naujųjų įrengimų (pvz., mikrobangų, ultragarso ir pan.).

Nitrofuranai –

PASS online – internetu prieinama programinė įranga, skirta į vaistus panašių molekulių biologiniui

potencialui įvertinti.

ĮVADAS

Temos aktualumas.

Pastaraisiais dešimtmečiais pasaulyje susirūpinta vis didėjančiu mikroorganizmų atsparumu antibiotikams. Pasaulio sveikatos organizacija (PSO) imasi priemonių, kad sumažintų neracionalų antibiotikų vartojimą ir tokiu būdu sumažintų mikroorganizmų atsparumo didėjimą [55]. Atsparumas antibiotikams kelia rimtą grėsmę žmonijos sveikatai ir gerovei, daro neigiamą įtaką pasaulio nacionalinėms ekonomikoms. Metiniai finansiniai nuostoliai, patiriami dėl atsparumo antibiotikams, svyruoja nuo 21 000 mln. iki 34 000 mln. dolerių Jungtinėse Amerikos Valstijose ir apie 1500 milijonų eurų Europoje [67]. Nepaisant didėjančio atsparumo antibiotikams, didžiosios farmacijos kompanijos vis mažiau domisi naujų antibakterinių vaistų kūrimu [61]. Pasaulio mokslininkai vieningai pripažįsta poreikį sukurti tokius priešmikrobinius vaistus, kurie veiktų atsparias bakterijų padermes, o nuo dabartinių pirmo pasirinkimo gydymo vaistų skirtųsi savo struktūra ir veikimo mechanizmu [31, 48].

Rodanino dariniai pasižymi plačiu biologiniu veikimu [59]. Įrodytas junginių antibakterinis, priešgrybelinis, priešvirusinis, antimaliarinis, insekticidinis, herbicidinis poveikis. Žinomas šių junginių aktyvumas prieš gramteigiamas ir gramneigiamas bakterijas, tuberkuliozės sukėlėją, grybelius bei pirmuonis. Priešmikrobinių rodanino junginių savybės plačiai tyrinėjamos iki šių dienų.

Išsiaiškinta, kokius galimus bakterijų ląstelių taikinius jie veikia [53]. Pastebimas rodanino darinių gebėjimas veikti atsparias S. aureus padermes [28, 48, 57].

Nitrofuranai atrasti 20 amžiaus viduryje. 2-(5-nitro)-furfurolo semikarbazonas, žinomas nitrofurazono (nitrofuralio) pavadinimu, buvo pirmasis šios klasės atstovas [65]. Nuo to laiko susintetinta daugiau nei 3500 šios klasės junginių, kurie pasižymi priešmikrobiniu aktyvumu [22].

Nitrofuranai veikia gramteigiamas ir gramneigiamas bakterijas, antibiotikams atsparias padermes, pirmuonis ir grybelius [29, 56]. Nitrofuranų aktyvumui būtina 5-oje padėtyje esanti nitro grupė. Šios grupės modifikacija lemia junginių priešmikrobinio veikimo sumažėjimą [65]. Nepaisant šio dėsningumo aptinkama junginių, kurie vietoje minėtos 5-oje padėtyje esančios nitro grupės turi benzeno žiedą su įvairiais jame esančiais pakaitais. Šie dariniai taip pasižymi priešmikrobiniu veikimu, tačiau turi skirtingą veikimo mechanizmą nei nitrofuranai. Pastebėtas stiprus šios struktūros junginių poveikis S. aureus [53, 68].

Lietuvos sveikatos mokslų universiteto vaistų chemijos katedroje daugelį metų sintezuojami

rodanino dariniai, tiriamos šių junginių priešmikrobinės savybės. Šioje srityje daug dirbę Lietuvos

mokslininkai Eduardas Tarasevičius [5], Faustas Malinauskas [1], Raimondas Radžiūnas [4], Vilma

Petrikaitė [3], Augusta Ževžikovienė [6]. Susintetinti keli šimtai 2- ir 5-pakeistų rodanino darinių ir

ištirtas jų priešmikrobinis aktyvumas.

Teorinė ir praktinė tyrimo reikšmė.

Kaip jau minėta temos aktualumo skiltyje, mikroorganizmų atsparumas antibiotikams kelia dideles problemas. Kadangi pasaulio mokslininkai sutaria, kad reikia kurti kitokiu veikimo mechanizmu pasižyminčius junginius, vienas iš tokių galimų junginių yra rodaninas. Literatūroje aprašyta, kad rodaninas gali veikti daug ląstelės taikinių [53], todėl biologinio aktyvumo tyrinėjimai pasirenkant kaip pagrindą rodaniną, atrodo perspektyvūs. Teorine reikšme, šio tyrimo rezultatai galėtų prisidėti prie Lietuvos mokslininkų tyrinėjamų rodanino junginių duomenų bazės, nes apžvelgus lietuvių mokslininkų darbus, neaptikta duomenų apie rodanino-3-karboksirūgščių darinius. Esant geriems rezultatams, galima kitų mokslininkų ar magistrantų junginių sintezė ir priešmikrobiniai tyrimai aktyviausių junginių kryptimi. Praktine reikšme, susintetinti junginiai pasižymi antibakteriniu veikimu. Norint gauti išsamesnius rezultatus, reikalingi tolimesni tyrimai sintetinant ir nustatant rodanino-3-karboksirūgščių darinių aktyvumą.

Temos ryšys su tyrimo metodika ir rezultatais.

Darbo temos pavadinimas yra „Rodanino-3-acto ir 3-propano rūgščių darinių sintezė ir jų antibakterinio bei priešgrybelinio aktyvumo įvertinimas“. Tema – visiškai įgyvendinta. Metodika buvo pasirinkta tokia, kad būtų susintetintos norimos rodanino-3-acto ir 3-propano rūgštys bei 5-pakeisti šių rūgščių dariniai. Sintezė laikoma sėkminga, nes, lyginant su pradiniais dariniais, gauti junginiai turi skirtingą lydymosi temperatūrą ir UV-Vis spektrą. Priešmikrobinis tyrimas taip pat įgyvendintas panaudojant in silico ir in vitro metodus. Gauti mikrobiologinio tyrimo rezultatai padėjo paaiškinti galimus struktūros-aktyvumo ryšio dėsningumus.

Darbo tikslas – susintetinti rodanino-3-acto ir 3-propano rūgšties darinius, atlikti jų

priešmikrobinį tyrimą ir įvertinti struktūros-aktyvumo ryšio dėsningumus.

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Tyrimo kryptis – vaistų chemija.

Tyrimo problemos. Šio darbo pagrindinė tyrimo problema atskleidžiama probleminiais klausimais: koks yra antibakterinių medžiagų poreikis; kokios struktūros aktyvius junginius verta sintetinti; kokie struktūros ypatumai lemia junginių priešmikrobinį aktyvumą?

Mokslinio tyrimo eiga.

1. Mokslinės literatūros bei mokslinių straipsnių analizė ir sintetinamų rodanino junginių plano sudarymas.

2. Rodanino junginių sintezė.

3. Rodanino junginių tyrimas in silico ir in vitro.

4. Struktūros-aktyvumo ryšio dėsningumų vertinimas remiantis gautais rezultatais.

Tyrimo instrumentai: susintezuotų junginių priešmikrobinio aktyvumo įvertinimui – mikrobiologinio tyrimo duomenys.

Darbo tikslas – susintetinti rodanino-3-acto ir 3-propano rūgšties darinius, atlikti jų priešmikrobinį tyrimą ir įvertinti struktūros-aktyvumo ryšio dėsningumus.

Uždaviniai:

1. Susintetinti rodanino-3-acto ir 3-propano rūgštis bei jų darinius, 5-oje rodanino žiedo padėtyje turinčius furano fragmentą.

2. Patikrinti gautų junginių priešmikrobinį aktyvumą in silico (naudojant PASS) ir in vitro (serijinio skiedimo standžioje terpėje metodą).

3. Įvertinti gautų junginių struktūros-aktyvumo ryšio dėsningumus pasitelkiant gautus

eksperimentinių tyrimų rezultatus.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1 Priešmikrobinių medžiagų poreikis

20 amžiaus pirmoje pusėje atrasti penicilinai ir sulfanilamidai sukėlė revoliuciją gydant infekcines ligas. Kitų priešmikrobinių vaistų klasių atradimas lėmė platų antibiotikų vartojimą terapijoje. Dėl šios priežasties antibakterinė chemoterapija tapo svarbia medicinos dalimi ir tokiu būdu lėmė šiuolaikinės visuomenės sveikatos pagerėjimą ir gyvenimo trukmės pailgėjimą [19].

Bakterijos, kurios yra jautrios antibiotikams, anksčiau ar vėliau tampa jiems atsparios.

Nereikalingas ir netinkamas antibiotikų vartojimas sąlygoja naujų atsparių padermių atsiradimą ir plitimą [55]. Bakterijos tampa atsparios antibiotikams įvairiais būdais. Atsparumas antibiotikams atsiranda dėl mikroorganizmų genomo pokyčio. Esant tokiems pokyčiams pasireiškia biologiniai atsparumo mechanizmai: antibiotiko molekulės suardymas arba transformacija, antibiotiko pašalinimas iš ląstelės tam tikrais „siurbliais“, antibiotiko taikinio ląstelėje modifikacija. [8, 64]. 1945 metais Aleksandras Flemingas perspėjo, kad netinkamas penicilino vartojimas gali lemti atsparios S. aureus formos susidarymą, kuri sukeltų labiau komplikuotas infekcijas. Jis buvo teisus, nes per vienerių metų laikotarpį atsirado daug, atsparių penicilinui, šios bakterijos padermių, o praėjus keliems metams – daugiau nei 50 % S. aureus padermių penicilinas nebeveikė [8, 16].

Daug mikroorganizmų rūšių tapo atsparios antibiotikams, o kai kurios iš jų išvystė atsparumą daugeliui antibiotikų ir chemoterapinių medžiagų, ir šis reiškinys žinomas kaip dauginis atsparumas antibiotikams (angl. multidrug resistence). Kai kurios bakterijų padermės tapo atsparios praktiškai visiems įprastai vartojamiems vaistams. Infekcijos, kurias sukelia meticilinui atsparus S. aureus (MRSA), vankomicinui atsparus E. faecium (VRE) ir fluorochinolonui atspari P. aeruginosa, sparčiai plinta. MRSA yra atsparus ne tik meticilinui (kuris ir buvo sukurtas kovoti prieš penicilinazę gaminantį S. aureus), bet ir aminoglikozidams, makrolidams, tetraciklinams, chloramfenikoliui ir linkozamidams [64]. Dar didesnį nerimą kelia antibiotikams visiškai atsparios (angl. panantibiotic- resistant) padermės, kurioms priskiriami Acinetobacter rūšies atstovai, karbapenemui atsparios Klebsiella rūšys bei dauginį atsparumą antibiotikams turinti P. aeruginosa [21].

Yra keletas priežasčių, kodėl atsparumas antibiotikams turi kelti susirūpinimą. Pirma, šis reiškinys dažnai baigiasi nesėkmingu gydymo rezultatu, o tai turi rimtų pasekmių sunkiai sergantiems ligoniams. Netinkamas empirinis antibakterinis gydymas, apibūdinamas kaip pradinis antibiotikų vartojimas esant nejautriam sukėlėjui, buvo susietas su padidėjusiu pacientų mirtingumu dėl sepsio.

Antra, atsparių padermių plitimas iš gydymo įstaigų į visuomenę didina su infekcijos kontrole

susijusias problemas. Kliniškai svarbios padermės, tokios kaip meticilinui atsparus S. aureus (MRSA)

ir padidinto spektro β-laktamazes produkuojanti E. coli, vis labiau aptinkamos visuomenėje.

Galiausiai, dėl atsparumo antibiotikams didėja gydymo kaštai [52].

Ši problema kaupėsi per dešimtmečius, todėl šiandien dauguma paprastų ir gyvybei pavojingų infekcijų tampa sunkiai arba visiškai nepagydomomis, o kartais paprasta infekcija tampa pavojinga gyvybei [54]. Dėl šios priežasties dabartinių, kliniškai efektyvių, priešmikrobinių vaistų efektyvumas vis mažėja [31]. Yra du pagrindiniai būdai, kuriais šiuolaikinis pasaulis siekia užkirsti kelią šio reiškinio plitimui. Pirmasis paremtas PSO ir kitų pasaulio šalių sveikatinimo organizacijų skatinimu antibiotikus vartoti racionaliai, o antrasis – naujų vaistų sukūrimu [54]. Mokslininkai vieningai sutaria, kad yra neatidėliotinas poreikis susintetinti naujus priešmikrobinius vaistus, kurių veikimo mechanizmas būtų skirtingas nuo dabar esančių medžiagų ir veiktų atsparias bakterijų padermes [31, 52].

1.2 Rodanino dariniai

Įvairiapusis rodanino (2-tioksotiazolidin-4-onas) ir jo analogų biologinis aktyvumas žinomas nuo 20 amžiaus pradžios. Farmakologiškai svarbia rodaninų ir tiazolidin-2,4-dionų heterociklinių junginių klase jie tapo tada, kai į klinikinę praktiką buvo įvesti glitazonai, skirti II tipo cukrinio diabeto gydymui, ir epalrestatas – diabeto komplikacijų gydymui. Cheminė modifikacija šiuose heterocikliniuose junginiuose lėmė platų farmakologinio spektro atsiradimą. Kadangi antimikrobinis rodanino darinių aktyvumas žinomas daugiau nei 50 metų, jo pagrindu buvo bandymų sukurti antibakterinių vaistų [54]. Be minėto poveikio rodanino dariniai pasižymi priešgrybeliniu, antimaliariniu, insekticidiniu, herbicidiniu, priešvėžiniu, priešuždegiminiu ir kardiotoniniu poveikiais.

Jie potencialiai gali būti naudojami diabeto, nutukimo, Alzheimerio ligos, cistinės fibrozės, trombocitopenijos, vėžio gydymui, taip pat esant lėtiniam uždegimui, miego, nuotaikos ir centrinės nervų sistemos sutrikimams [53].

Daug rodanino darinių buvo sintezuojami siekiant paveikti specifinius bakterijų fermentus.

Nustatyta nemažai taikinių, kuriuos veikia rodanino dariniai: UDP-galaktopiranozės mutazė (UGM) [46], UDP-N-Acetilmuramoil-L-alanino sintetazė (MurC) [43], nukleozido difosfo-glikoziltransferazė (MurG) [30], peniciliną prijungiantis baltymas (PBP) [67], C klasės β-laktamazė [25], ribonukleino rūgšties (RNR) polimerazė (RNAP) [26], dihidrolipoamido aciltransferzė (DlaT) [12], juodligės letaliojo faktoriaus metalo proteazė [61], DNR girazė [14]. Yra susintetintų rodanino junginių, kurie veikia grybelių manoziltransferazę 1 (PMT1) [36].

Dėl minėto plataus farmakologinio poveikio yra pavojus, kad rodanino junginiai gali veikti

neselektyviai ir taip sukelti pašalinius nepageidaujamus poveikius. Nepaisant to, šios klasės

antibakterinių vaistų kūrimas atrodo tikslingas. Remiantis identifikuotais taikiniais, rodanino dariniai gali veikti tą patį ląstelės procesą skirtingais mechanizmais, pvz., ląstelės sienelės sintezės slopinimas inhibuojant skirtingus fermentus. Kadangi yra poreikis, jog nauji vaistai veiktų skirtingais mechanizmais arba turėtų skirtingą struktūrą, rodanino dariniai gali būti pasirenkami šiam iškeltam tikslui įgyvendinti.

Tiriant ir plėtojant šią junginių klasę prisidėjo ir Lietuvos mokslininkai, kurie susintetino kelis šimtus junginių ir nustatė jų priešmikrobinį aktyvumą. Didžiosios daugumos lietuvių susintetintų junginių modifikacijos atliktos 2-oje ir 5-oje rodanino žiedo padėtyse prijungiant įvarius pakaitus.

Lietuvos mokslininkų susintetintų rodanino darinių, kuriuose 3-oje tiazolo žiedo padėtyje būtų pakaitai, susintetinta nedaug. Vienu iš didžiausių pasiekimų galima laikyti E. Tarasevičiaus susintetintą junginį, kuriam atlikti ikiklinikiniai tyrimai. Šiai molekulei suteiktas nifumezino pavadinimas (10 pav.) [1, 3, 4, 5, 6].

Rodaninui reaguojant su aromatiniais aldehidais gaunami 5-pakeisti dariniai (1 pav.). Ši reakcija vadinama aldoline arba Knoevenagelʼio kondensacija, kurią galima atlikti medžiagas tiesiog virinant etanolyje [44] ar panaudojant įvairius katalizatorius atitinkamuose tirpikliuose: piperidiną ar 2,2,6,6-tetrametilpiperidiną etanolyje, tetrabutilamonio bromidą vandenyje, natrio acetatą ledinėje acto rūgštyje arba etanolyje bei piperidinijaus benzoatą toluene. Galima sintezė mikrobangų metodu panaudojant kietas neorganines daleles, pvz., Al

O

[33]. Tokiu būdu gautas paprastą struktūrą turintis 5-(2,3,4-trifluorbenziliden)rodaninas (5 pav.), pasižymintis dideliu aktyvumu prieš S. aureus (MSK = 0,5 µg/ml), tačiau mažesniu – prieš MRSA (MSK = 32 µg/ml) [54].

S

NH S

O

S

NH S

O R¹

R² R² O R¹

1 pav. 5-pakeistų rodanino darinių gavimas

2-pakeisti rodanino dariniai gaunami 2-metilrodaninui reaguojant su aromatiniais aminais (2 pav.). Pats 2-metilrodaninas gaunamas rodaniną veikiant kalio metilatu ir jodmetanu [5, 6]. Lietuvos mokslininkai yra susintetinę daug junginių, kurių 2-oje rodanino žiedo padėtyje yra sulfanilamidų liekanos. Taip pat tokiu būdu gautas ir nifumezinas.

Kadangi Lietuvos mokslininkai yra sukaupę nemažai duomenų apie rodanino darinių sintezę ir jų priešmikrobinį aktyvumą, verta ir toliau tirti, plėtoti bei kaupti duomenis apie šią junginių klasę.

Kaip minėta anksčiau, junginių, kurie turėtų 3-oje rodanino žiedo padėtyje pakaitus, susintetinta

nedaug, o tokių junginių, kurie turėtų karboksirūgšties liekaną – neaptikta. Remiantis šiuo pastebėjimu,

nutarta tirti rodanino darinius, kurių 3-oje padėtyje yra trumpos alifatinių karboksirūgščių liekanos.

S

N O

SH S

N O

SK S

N O

SCH₃

CH

OK CH

I

-KI

S

N O

SCH₃ S

N O N NH

H₂

+

2 pav. 2-pakeistų rodanino darinių gavimas

1.3 Rodanino-3-karboksirūgščių dariniai

Rodanino žiedą turinčių junginių farmacinis interesas yra labai mažas nepaisant fakto, kad junginiai pasižymi įvairiu biologiniu veikimu. Viena galima priežastis – blogas šių medžiagų tirpumas vandenyje. Šią problemą galima išspręsti paruošiant tinkamas karboksirūgščių druskas [20].

Paprasčiausiu rodanino dariniu, kuris 3-oje padėtyje turi karboksirūgšties funkcinę grupę, galima laikyti rodanino-3-acto rūgštį (3-karboksimetilrodaninas). Šią molekulę pirmą kartą susintetino Körner 1908 metais. Nuo to laiko susintetinti ir tirti rodanino-3-acto rūgšties dariniai, kurie pasižymėjo priešmikobakteriniu, priešgrybeliniu, pesticidiniu, antihipertenziniu ir priešvėžiniu veikimu. Rodanino karboksirūgščių dariniai taip pat patentuoti metabolinių kaulų sutrikimų gydymui ir profilaktikai.

Vienintelis šios klasės junginys, kuris naudojamas klinikinėje praktikoje, yra aldozės reduktazės inhibitorius epalrestatas (3 pav.). Šis vaistas registruotas Japonijoje ir naudojamas dėl diabeto atsiradusiam akių pažeidimui sumažinti bei apsaugai nuo periferinės neuropatijos [20].

S N O

COOH

S

3 pav. Epalrestato cheminė formulė

3-pakeistų rodanino darinių gavimo principas yra skirtingas lyginant su 2- ir 5-pakeistais

rodanino dariniais, kurie gaunami į atitinkamas tiazolo žiedo padėtis prijungiant įvairius pakaitus. 3-

pakeisti dariniai gaunami iš atitinkamų alifatinių ar aromatinių aminų. Galimi įvairūs N-pakeistų

rodanino darinių gavimo būdai naudojant tiek klasikinę, tiek mikrobangų metodiką [35, 69]. Vienas iš

būdų – trijų stadijų tiesioginė aminų reakcija su anglies disulfidu (CS

) ir monochloracto rūgštimi

vandeninėje šarminėje aplinkoje. N-pakeistas rodanino žiedas sudaromas vykdant ciklizaciją rūgštinėje

aplinkoje [69] (4 pav. A reakcija). Galimas greitesnis, tačiau brangesnis metodas, kuris atliekamas

mikrobangų sintezės metodu, panaudojant bis(karboksimetil)tritiokarbonatą vandeninėje aplinkoje (4 pav. B reakcija) [35]. Yra ir kitų gavimo būdų, pvz., atitinkamus izotiocianatų darinius paveikiant monochloracto rūgštimi [6] arba metiltioglikolatu [44]. N-pakeisti rodanino karboksirūgščių dariniai gaunami iš alifatinių arba aromatinių aminorūgščių [28].

NH₂

R N S

H

S

SNa O

R N

R

S O

S SNa

N H

S

CS₂ (1.1 ekv.) R

NaOH

HCl (perteklius) (1.1 ekv.)

OH O Cl

NH₂

R N

R

S O

S S

O H

O

S S

OH

O

H₂O

+

A

B

4 pav. 3-pakeistų rodanino darinių gavimas

3-oje rodanino žiedo padėtyje karboksirūgšties įvedimas daro įtaką junginių priešmikrobiniam aktyvumui [14, 31, 47, 48, 54]. Dažniausiai aktyvumas padidėja. Tiriant tuberkuliozės sukėlėją veikiančius junginius pastebėta, kad rodanino-N-acto rūgšties fragmentą turinčios molekulės veikia mažesnėmis koncentracijomis negu tą pačią struktūrą turintys junginiai be acto rūgšties fragmento 3- oje rodanino žiedo padėtyje [9]. Sintetinant DNR girazę B inhibuojančius 5-(2- hidroksibenziliden)rodanino darinius pastebėta, kad didžiausias slopinantis poveikis pasireiškia esant propano rūgšties fragmentui, lyginant su 3-oje padėtyje esančiomis m-nitrofenilo ar m-karboksifenilo liekanomis. Verta paminėti, kad šie junginiai, vietoje propano rūgšties turintys acto rūgšties fragmentą, aktyvumu nepasižymi [14]. Žinoma atvejų, kai karboksirūgšties įvedimas daro neigiamą įtaką biologiniui aktyvumui. 5-(2,3,4-trifluorbenziliden)rodaninas (5 pav.) pasižymi stipriu veikimu prieš S.

aureus (MSK = 0,5 µg/ml), tačiau jo analogas, turintis acto rūgšties liekaną šį aktyvumą praranda (MSK > 128 µg/ml) [54].

F F

F

S N O

S R

5 pav. 5-(2,3,4-trifluorbenziliden)rodanino dariniai. R: -H, -CH

COOH

Aktyvumui didelę įtaką turi naudojama aminorūgštis. Susintetinta N-pakeistų rodanino

darinių su įvairiomis α-aminorūgštimis, kurios veikia S. aureus ir MRSA bakterijų padermes [28, 31,

48, 57]. Tyrimai patvirtina iškeltą hipotezę, kad šoninių hidrofobinių aminorūgščių liekanos didina

aktyvumą prieš šias bakterijų padermes. Manoma, kad padidėjęs lipofiliškumas lemia geresnį

molekulės perėjimą pro plazminę membraną ir patekimą į ląstelę. Molekulės su fenilalanino šoniniu

fragmentu pasižymi didesniu aktyvumu prieš MRSA lyginant su molekulėmis be šio šoninio radikalo [31, 58, 48].

Galima aminorūgščių įtaka aktyvumui prieš S. aureus nustatyta sintezuojant skirtingas (Z)-5- (4-(2-okso-2-feniletoksi)benziliden)-2-tioksotiazolidin-4-ono junginių serijas (6 pav.) ir tiriant aktyvumą prieš gramteigiamą bakteriją S. aureus ir gramneigiamą bakteriją E. coli. Nustatyta, kad hidrofobines aminorūgščių liekanas turintys junginiai pasižymi didesniu priešmikrobiniu aktyvumu prieš S. aureus, tačiau nei vienas susintetintas junginys nepasižymi aktyvumu prieš E. coli (MSK > 64 µg/ml). 1 µg/ml minimalia slopinančiąja koncentracija stipriausiai veikiantys junginiai turi triptofano aminorūgšties liekaną, iš kurių aktyviausi yra du: vienas aktyvus prieš S. aureus ir MRSA bei chinolonui atsparias S. aureus (QRSA) padermes, o kitas – tik prieš atsparias S. aureus padermes.

Kitos serijos vienas junginys, turintis 3-oje padėtyje fenilalanino fragmentą, veikia tik šias atsparias padermes. Daugiau darinių, kurie pasižymėtų tokiomis mažomis MSK penkiose junginių serijose, nerasta. Remiantis tyrėjų duomenimis radikalų įtaka aktyvumui galima išdėstyti taip: V > III > IV > II

> I (6 pav.) [48]. Panašius struktūros-aktyvumo ryšio dėsningumus įžvelgė ir kiti tyrėjai [57].

O O

S N

O S

R¹ R

R¹: I: II: III:

IV: V:

-H -CH₂COOH

COOH

COOH

OH

COOH

NH

6 pav. Bendra rodanino darinių struktūra, turinčių skirtingas aminorūgščių liekanas 3-oje žiedo padėtyje. Amino rūgščių liekanos: II-glicino, III-fenilalanino, IV-tirozino, V-triptofano.

1.4 Nitrofuranai

Antibakteriniai nitrofurano dariniai buvo atrasti 1944 metais M. C. Dod ir W. B. Stilman

Jungtinėse Amerikos valstijose [65]. Didžiausias susidomėjimas naujų nitrofuranų kūrimu buvo 20

amžiaus viduryje. Šiandien ši junginių klasė vis dar plėtojama ir pastebimas susidomėjimas nitrofuranų

aktyvumu prieš tuberkuliozės sukėlėją [27, 49, 50, 51]. Tyrimais išsiaiškinta, kad 5-oje furano žiedo

padėtyje esanti nitro grupė yra būtina priešmikrobiniam aktyvumui [11, 27, 51, 65]. Furfurolo

semikarbazonas nepasižymi antibakteriniu aktyvumu, o tuo tarpu 2-(5-nitro)-furfurolo semikarbazonas

– yra aktyvus. Esant 5-oje furano žiedo padėtyje chlorui, aktyvumas sumažėja. Taip pat daroma

prielaida, kad, lyginant su 2-(5-nitro)-furfurolo junginiais, 2-(5-nitro)-furfurilakroleino dariniai pasižymi stipresnėmis antibakterinėmis savybėmis [65, 3].

Nitrofuranai yra aktyvūs prieš patogeninius organizmus: helmintus, bakterijas, pirmuonis, grybelius ir bakterijas [45]. Nitrofuranai dažnai vartojami kaip antro pasirinkimo vaistai gramneigiamų ir gramteigiamų bakterijų sukeltų odos infekcijų gydymui. Taip pat galimas vartojimas ir kombinuotoje terapijoje, daugeliui vaistų atsparaus S. aureus ir kitų mikroorganizmų sukeltų, infekcijų gydymui [13]. Susidomėta nitrofuranų panaudojimu H. pylori infekcijų gydymui [23].

Nitrofuranų veikimo mechanizmas iki galo nėra išaiškintas, tačiau yra pasiūlytas galimas veikimo būdas. Pastaruoju metu manoma, kad jų veikimas priklauso nuo bakterijų flavoproteino nitroreduktazės, kuriai veikiant nitro grupė redukuojama iki hidroksilamino darinių. Nitrofuraliui (nitrofurazonui) atspariose bakterijų padermėse nitroreduktazės aktyvumo nėra, todėl buvo padaryta išvada, kad būtent šis fermentas yra atsakingas sudarant ląsteles pažeidžiančius junginius. Reakcija vyksta dviejomis stadijomis dalyvaujant 4 elektronams, o susidarę reaktyvūs metabolitai gali reaguoti su baltymais ir DNR (7 pav.) [39]. Bakterijų fermentai azoreduktazės taip pat sugeba redukuoti nitro grupę, tačiau jų aktyvumas, lyginant su nitroreduktazėmis, yra žymiai silpnesnis [42].

O N⁺

O O^- N

NH O

NH₂

O N H ⁺

OH O^- N

NH O

NH₂

O N

OH OH N

NH O

NH₂

N H

FMNH^- FMN

N

O N

OH OH N

NH O

NH₂

O NH

OH N

NH O

NH₂ A.

B.

H⁺

N H

FMNH^-

FMN N H⁺

7 pav. Pasiūlytas nitrofuralio veikimo mechanizmas

Nitrofuralis, furazolidonas ir nitrofurantoinas naudojami gydyti įvairioms bakterinėms

infekcijoms beveik 50 metų (8 pav.). Nitrofuralis vartojamas išoriškai, yra aktyvus prieš daugelį

gramteigiamų ir gramneigiamų bakterijų, tačiau nėra aktyvus prieš grybelius. Furazolidonas turi

baktericidinį poveikį žarnyno patogenams, todėl rekomenduojamas kaip geriamasis vaistas jautrių

bakterijų ar pirmuonių sukeltai diarėjai gydyti. Nitrofurantoinas vartojamas šlapimo takų infekcijoms

gydyti. Nifurtimoksas vartojamas gydyti tokias pirmuonių sukeltas ligas kaip tripanosomiazė ir leišmaniozė [11]. Nitrofurantoinas yra vienintelis šios klasės junginys registruotas Lietuvos Respublikos vaistinių preparatų registre [7].

O₂N O

N NH

NH₂

O

Nitrofurantoinas

O₂N O

N N NH O

O

O₂N O

N N O O

O₂N O

N N

S C

H₃

O O

Nitrofuralis

Furazolidonas Nifurtimoksas

8 pav. Kliniškai reikšmingi nitrofuranai

Pastaruoju metu susidomėta nitrofuranų aktyvumu prieš M. tuberculosis. Susintetinti įvairios struktūros 5-nitrofurano pakaitą turintys junginiai [49, 51, 50]. Tiriant atitinkamų darinių struktūros- aktyvumo ryšį pastebėta (9 pav. A) kad, lyginant su p-nitrobenzeną turinčiais analogais, junginių, turinčių 5-nitrofurfurolo fragmentą, inhibuojantis M. tuberculosis veikimas yra stipresnis. Remiantis tokiais rezultatais padaryta išvada, kad priešmikobakteriniam aktyvumui būtina 5-nitrofurfurolo liekana [27]. Vienu iš sėkmingiausių susintetintų priešmikobakterinių junginių galima laikyti N-(3,5- dibrompiridin-2-il)-2-((5-nitrofuran-2-il)metilen)hidrazinkarbotioamidą (9 pav. B), kuris pasižymi itin stipriu poveikiu prieš M. tuberculosis (MSK = 0,22 µM/ml), lyginant su izoniazidu (MSK = 0,66 µM/ml), rifampicinu (MSK = 0,23 µM/ml) ir ciprofloksacinu (MSK = 4,71 µM/ml) [49].

N N H

N H

N S

O

NO₂ Br

A. B. Br

N H O

N R

NO₂ I

II ^O

NO₂ R

R:

9 pav. Priešmikobakteriniu aktyvumu pasižyminčių junginių struktūros ypatumai

Yra žinoma ir rodanino darinių, 5-oje žiedo padėtyje turinčių nitrofurano žiedą. Tiriant šią struktūrą yra dirbę tiek Lietuvos – E. Tarasevičius [5], V. Petrikaitė [3], A. Ževžikovienė [6], tiek ir kitų šalių mokslininkai: Didžiosios Britanijos – K. R. Mariner [63], Rusijos – K. Ramkumar [41].

Junginiai turintys šią struktūrą, pasižymi antibakterinėmis, priešgrybelinėmis, priešvirusinėmis

savybėmis. Pats paprasčiausias šios klasės junginys yra 5-(5-nitrofurfuriliden)rodaninas. Šis junginys

pasižymi aktyvumu prieš S. aureus (MSK = 4 µg/ml), E. coli. (MSK = 2 µg/ml), B. subtilis (MSK 1 = µg/ml) [63].

Vienam iš E. Tarasevičiaus susintetintų junginių – nifumezinui, kurio struktūroje yra ne tik minėtas nitrofurano ir rodanino fragmentas, bet ir 2-oje tiazolo žiedo padėtyje esantis sulfadimidinas, atlikti ikiklinikiniai tyrimai (10 pav.). Šis junginys mažai toksiškas (LD

= 5000 mg/kg) ir gana aktyvus prieš S. aureus ir E. coli (MSK = 256 µg/ml). Stipriai išreikštas fungicidinis veikimas mieliagrybiams (MSK = 256 µg/ml – 2 µg/ml) [5].

Nemažai rodanino junginių, turinčių 5-nitrofurfurolo ir 5-nitrofurfurilakroleino pakaitus 5-oje tiazolo žiedo padėtyje, susintetino V. Petrikaitė. Šie dariniai pasižymi aktyvumu prieš S. aureus, E.

coli, B. subtilis, K. pneumoniae bakterijas ir Candida rūšies grybelius. Junginys VIL3-11 (9 pav.) pasižymėjo stipresnėmis minėtomis savybėmis negu sulfanilamidas sulfametizolis. Pastebėtas dėsningumas, kad 5-nitrofurfurilakroleino liekana suteikia stipresnes antibakterines, tačiau silpnesnes priešgrybelines savybes negu 5-nitrofurfurolo liekana [6]. Junginys VIL13-1 (10 pav.), 5-oje padėtyje turintis 5-nitrofurfurolo fragmentą, pasižymėjo didesniu priešmikrobiniu aktyvumu negu jo analogai turintys 5-nitrofurfurilakroleino ir p-nitrobenzeno fragmentus. Šiuo atveju 5-nitrofurfurilakroleino liekana nesuteikė didesnio priešmikrobinio ir priešgrybelinio aktyvumo lyginant su 5-nitrofurfurolo liekaną turinčiais junginiais [2]. Remiantis daugiau nei dešimties rodanino ir 5-nitrofurano struktūrą turinčių junginių priešmikrobiniais tyrimais buvo padaryta išvada, kad tiazolidinono ciklo padėtyje esant 5-nitrofurfurilakroleino liekanai, antibakterinis junginių aktyvumas didesnis lyginant su 5- nitrofurfurolo liekana. Junginiai su 5-nitrofurfurolo liekana pasižymi didesniu priešgrybeliniu aktyvumu už junginius, turinčius 5-nitrofurfurilakroleino liekaną [3].

S

N O

O₂N

N H

O

S N H

O O

N

N

CH₃

CH₃ nifumezinas

S

N O

O₂N

O

N H

N

N

H₂ O

CH₃ S

N O

O₂N

O

N H

S N H

O O

S

N N

CH₃

VIL13-1 VIL3-11

10 pav. Lietuvos mokslininkų susintetinti nitorfuranilrodanino dariniai

1.5 5-fenilfuranilrodanino dariniai

Susintetinta rodanino darinių, kurie 5-oje žiedo padėtyje turi ne 5-nitrofurano fragmentą, bet 5- fenilfurano fragmentą su įvairiais galimais pakaitais benzeno žiede (11 pav.). Šią struktūrą turintys junginiai pasižymi plačiu farmakologiniu veikimu. Žinomas šių junginių antibakterinis [10, 63, 26], priešmikobakterinis [12], antimaliarinis [34], priešvėžinis [17, 37], priešvirusinis [33, 61] bei priešuždegiminis [38] veikimas. In vitro tyrimais nustatyta, kad šią struktūrą turintys junginiai inhibuoja tau baltymų agregaciją ir potencialiai galėtų būti vartojami Alzheimerio ligos gydymui [15].

S N

O

S

R' O

R

11 pav. Bendra 5-fenilfuranilrodanino junginių struktūra

Šių, bendrą struktūrą turinčių, junginių veikimo mechanizmas yra skirtingas lyginant su nitrofurano dariniais. Nustatyti galimi mikroorganizmų veikimo taikiniai: bakterijų toksinai – juodligės letaliojo faktoriaus metalo proteazė ir A tipo botulino neurotoksinas [62, 32], bakterijų RNR polimerazė [26, 10], mikobakterijų dihidrolipoamido aciltransferazė (DlaT) [12], peniciliną prijungiantis baltymas (PBP) [68].

Dvi paskutinės peptidoglikano sintezės stadijos – ypač patrauklūs antibakterinių medžiagų taikiniai. Šis procesas vyksta išorinės citoplazminės membranos paviršiuje ir tokiu būdu antibakteriniai junginiai gali lengvai pasiekti taikinį. Be to, peptidoglikanas yra specifiškas prokariotinėms ląstelėms.

Susintetinti keli arilalkilidenrodanino dariniai, kurie PBP veikia inhibuojančiai. Aktyviausias junginys (12 pav.) S. aureus veikia stripriau (MSK = 0,3 µM/ml) lyginant su ampicilinu (MSK = 6µM/ml) ir cefotaksimu (MSK = 2 µM/ml), tačiau tai nėra dideli koncentracijų skirtumai. Nors MRSA padermės veikiamos silpniau (MSK = 1 µM/ml), tačiau tai yra žymiai geresni rezultatai lyginant su ampicilinu (MSK = 92 µM/ml) ir cefotaksimu (MSK > 200 µM/ml). Taip pat pastebėtas stiprus veikimas tiek jautrioms E. faecalis, tiek vankomicinui atsparioms E. faecium padermėms (MSK = 1 µM/ml).

Aktyvumą galima susieti ir su 3-oje rodanino žiedo padėtyje esančia hidrofobinėmis savybėmis

pasižyminčia aminorūgšties fenilalanino liekanos įtaka, nes minėtos aminorūgšties pakeitimas butano

rūgštimi tiek PBP inhibuojantį, tiek antibakterinį veikimą susilpnina [68].

S N O

S Cl O

COOH

12 pav. Aktyviausio PBP inhibuojančio ir didžiausią aktyvumą turinčio arilalkilidenrodanino darinio struktūra

Apibendrinimas

Apžvelgus literatūrą akivaizdu, kad priešmikrobinių junginių poreikis šiandieniniame pasaulyje yra didelis. Reikalingi nauji junginiai, kurie veiktų atsparias antibiotikams padermes. Prioritetu laikomi tie junginiai, kurie turi kitokią struktūrą arba veikia kitus ląstelės taikinius lyginant su dabartiniais antibiotikais.

Apžvelgus literatūrą tampa aišku, kad rodanino dariniai nepraranda aktualumo ir šiandien.

Susintezuota daugybė šios klasės junginių pasižyminčiu antibakteriniu poveikiu. Šios klasės perspektyvumą rodo tai, kad junginiai veikia mažomis koncentracijomis prieš tokias atsparias antibiotikams padermes kaip MRSA. Deja, nei vienas junginys neregistruotas kaip antibakterinis vaistas.

Mokslininkų darbuose pastebima, kad nitrofurano farmakoforo įvedimas į molekulę lemia

priešmikrobinio aktyvumo padidėjimą. Taip pat įdomūs tie junginiai, kurie turi 5-fenilfurano

fragmentą 5-oje rodanino žiedo padėtyje. Anksčiau minėtas pavyzdys (12 pav.) parodo, kad šie

junginiai gali būti aktyvūs ir veikti antibiotikams atsparias bakterijų padermes. Remiantis šiais

pastebėjimais šiame darbe palyginami rodanino-3-karboksirūgščių dariniai, kurie turi nitrofurano arba

5-fenilfurano fragmentą 5-oje tiazolo žiedo padėtyje. Manoma, kad šiame darbe susintezuoti junginiai,

kurie turi nitrofurano fragmentą, pasižymės aktyvumu prieš bakterijas ir grybelius.

2. TYRIMO METODIKA

Šiame darbe aprašomi trys tyrimų etapai:

1. Rodanino-3-karboksirūgščių sintezė ir šių junginių kondensacija su furano žiedą turinčiais aldehidais bei gautų junginių grynumo įvertinimas.

2. Susintezuotų junginių priešmikrobinio aktyvumo įvertinimas in silico.

3. Susintezuotų junginių priešmikrobinio aktyvumo įvertinimas in vitro.

2.1 Rodanino darinių sintezė

2.1.1 Rodanino-3-karboksirūgščių sintezė

0,1 mol (7,507 g) glicino arba 0,1 mol (8,91 g) β-alanino ir 0,2 mol (11,22 g) kalio hidroksido (KOH) ištirpinama 60 ml distiliuoto vandens. Į gautą tirpalą įpilama 0,1 mol (6,03 ml, 7,614 g, d = 1,261 g/cm

) CS

ir šis tirpalas maišomas kambario temperatūroje 4 val., kol nebelieka CS

lašelių.

Praėjus 4 val. į gautą rudą tirpalą pridedama 0,1 mol (9,495 g) monochloracto rūgšties, kuri prieš tai neutralizuojama kalio karbonatu (K

CO

). Mišinys maišomas dar 30 min. Tirpalo spalva pakinta iš oranžinės į geltoną. Po 30 min. į tirpalą įpilama 40 ml verdančios 6N druskos rūgšties (HCl) ir maišant šildoma 90 C temperatūroje 2 val. Po to tirpalas paliekamas ataušti per naktį. Susidaro balti kristaliniai milteliai, kurie nufiltruojami ir perplaunami 2N HCl. Gauta 12,84 g rodanino-3-acto rūgšties, kurios lydymosi temperatūra (lyd. t.) 148-149 C ir 14,77 g rodanino-3-propano rūgšties, kurios lyd. t. 158-160 C.

Tokiu būdu gauti šie junginiai: rodanino-3-acto rūgštis (N-karboksimetilrodaninas, 2- (4-okso-2-tioksotiazolidin-3-il)acto rūgštis), rodanino-3-propano rūgštis (N- karboksietilrodaninas, 3-(4-okso-2-tioksotiazolidin-3-il)propano rūgštis).

2.1.2 5-pakeistų rodanino-3-karboksirūgščių darinių sintezė

5-pakeistiems junginiams gauti imama 2 mmol rodanino-3-acto rūgšties arba rodanino-3-

propano rūgšties ir 2 mmol atitinkamo aldehido bei pridedama 0,4 g bevandenio natrio acetato. Įpilama

4 ml (PV-1 – PV-8) arba 15 ml (PV-9, PV-10) ledinės acto rūgšties. Maišoma 100

0,5 val. (PV-1 – PV-8) arba 8 val. (PV-9, PV-10). Mišinys paliekamas per naktį atvėsti. Susidariusios

nuosėdos filtruojamos, perplaunamos ledine acto rūgštimi, etanoliu, eteriu ir džiovinamos kambario temperatūroje. Gautas produktas perkristalinamas iš ledinės acto rūgšties.

Junginių reakcijos produktų susidarymas ir priemaišos vertintos plonasluoksnės chromatografijos metodu. Naudota eksperimentiniu būdu nustatyta tirpiklių sistema:

toluenas:izopropanolis:amoniakas (3:6:1). Medžiagos vertintos UV spinduliuote.

Reakcijų išeigos, lydymosi temperatūros ir grynumo duomenys pateikti 1 ir 2 lentelėse.

Tokiu būdu gauti šie junginiai:

2-(5-((5-nitrofuran-2-il)metilen)-4-okso-2-tioksotiazolidin-3-il)acto rūgštis (PV-1), 3-(5-((5-nitrofuran-2-il)metilen)-4-okso-2-tioksotiazolidin-3-il)propano rūgštis (PV-2), 2-(5-(3-(5-nitrofuran-2-il)aliliden)-4-okso-2-tioksotiazolidin-3-il)acto rūgštis (PV-3), 3-(5-(-3-(5-nitrofuran-2-il)aliliden)-4-okso-2-tioksotiazolidin-3-il)propano rūgštis (PV-4), 2-(5-((5-(4-bromfenil)furan-2-il)metilen)-4-okso-2-tioksotiazolidin-3-il)acto rūgštis (PV-5), 3-(5-((5-(4-bromfenil)furan-2-il)metilen)-4-okso-2-tioksotiazolidin-3-il)propano rūgštis (PV-6), 2- (5-((5-(4-nitrofenil)furan-2-il)metilen)-4-okso-2-tioksotiazolidin-3-il)acto rūgštis (PV-7),

3-(5-((5-(4-nitrofenil)furan-2-il)metilen)-4-okso-2-tioksotiazolidin-3-il)propano rūgštis (PV-8), 4-(5-((3-(karboksimetil)-4-okso-2-tioksotiazolidin-5-iliden)metil)furan-2-il)benzoinė rūgštis (PV- 9),

4-(5-((3-(2-karboksietil)-4-okso-2-tioksotiazolidin-5-iliden)metil)furan-2-il)benzoinė rūgštis (PV- 10).

1 lentelė. 5-pakeistų rodanino-3-acto rūgšties junginių charakteristikos

S N

S

O COOH

R

Junginio

Nr. R

Išeiga (%) / reakcijos

laikas (min.)

Lyd. t.

(C)

Mol. formulė (M

)

Grynumas pagal ESC

(%)

S % Apskai

čiuota /rasta

PV-1

O

O₂N

74/30 230-233 C

H

N

O

S

314,29 84,6

19,98

PV-3

O₂N

67/30 235-238 C

H

N

O

S

340,33 99,8

18,85

PV-5

O

Br

49/30 291-294 C

H

BrNO

S

424,29 84,2

14,79

PV-7

O

O₂N

88/30 302-307 C

H

N

O

S

390,39 73,5

15,91

PV-9

O

HOOC

60/480 320 > C

H

NO

S

389,40 73.6

16,01

2 lentelė. 5-pakeistų rodanino-3-propano rūgšties junginių charakteristikos

S N

S

O

COOH R

Junginio

Nr. R

Išeiga (%) / reakcijos

laikas (min.)

Lyd. t.

(C)

Mol. formulė (M

)

Grynumas pagal ESC

(%)

S % Apskai

čiuota /rasta

PV-2

O

O₂N

79/30 218-221 C

H

N

O

S

328,32 85,8

19,32

PV-4

O₂N

65/30 231-233 C

H

N

O

S

354,36 99,3

18,11

PV-6

O

Br

58/30 271-273 C

H

BrNO

S

438,32 95,9

14,47

PV-8

O

O₂N

81/30 271-275 C

H

N

O

S

404,42 83,7

15,57

PV-10

O

HOOC

60/480 320 > C

H

NO

S

403,42 94,5

15,68

2.1.3 Lydymosi temperatūros nustatymas

Gautų junginių lydymosi temperatūros nustatytos naudojant Koflerio lydymosi temperatūros nustatymo aparatą, kuris sudarytas iš mikroskopo, kaitinimo elemento ir termometro, ir yra nekoreguotos.

Mažas medžiagos kiekis uždedamas ant švaraus objektyvinio stiklelio, ant kurio uždedamas kitas

švarus objektyvinis stiklelis. Stikleliai suspaudžiami ir medžiaga sutrinama. Šie stikleliai dedami ant

objektyvinio stalelio, kuris yra šildomas kaitinimo elementu. Į objektyvinį stalelį įstatomas elektroninis termometras. Junginio agregatinės būsenos kitimai stebimi pro okuliarą.

Lydymosi pradžia fiksuojama tada, kai pasirodo pirmas lašas, o pabaiga – kai išsilydo visi kristaliukai ir nebematoma kietų dalelių. Lydymosi temperatūros pateikiamos 1 ir 2 lentelėse.

2.1.4 Junginių grynumo nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodu

Junginių grynumui įvertinti panaudota efektyviosios skysčių chromatografijos pokolonėlinis metodas. Prieš analizę paruošiami tirpalai: atsveriama 1 mg medžiagos, kuri ištirpinama acetonitrile.

Tam, kad junginiai geriau ir greičiau ištirptų, panaudota vonelė su ultragarsu. Tirpalai praskiedžiami acetonitrilu iki 10 ml. Tų medžiagų tirpalai, kuriuose medžiaga iki galo neištirpusi, filtruoti papildomai. Analizė atlikta Waters 2695 chromatografu. Junginių atskyrimui naudota C 18 4,6×250 mm, 5 µm ACE kolonėlė, kuri analizės metu laikyta išoriniame termostate, palaikant 25 ºC temperatūrą. Analizės metu injekuota 10 µl tiriamo tirpalo. Mobilios fazės greitis 1 ml min

. Naudota tokia gradiento sistema: tirpalas A – 0,05 % trifluoracto rūgštis vandenyje, tirpalas B – acetonitrilas; 0 min. – 30 % A ir 70 % B, 15 min. – 20 % A ir 80 % B, 20 min. – 10 % A ir 90 % B, 21 min. – 30 % A ir 70 % B. Atskirti junginiai tirti su fotodiodų matricos detektoriumi Waters 996 PDA esant tokiam bangos ilgiui, prie kurio jų absorbcija – didžiausia. Gauti grynumo įvertinimo rezultatai pateikti 1 ir 2 lentelėse, chromatogramos pateiktos 1 priede.

3 lentelė. Rodanino-3-karboksirūgščių darinių UV-Vis spektrų duomenys

Junginys UV-Vis pikai

PV-1 235; 309; 413

PV-2 237; 311; 415

PV-3 243; 341; 434

PV-4 218; 255; 342; 437

PV-5 237; 308; 450

PV-6 237; 308; 450

PV-7 236; 327; 445

PV-8 235; 328; 448

PV-9 239; 313; 449

PV-10 241; 313; 450

Rodanino-3-acto rūgštis 256; 295

Rodanino-3-propano rūgštis 259; 295

Prieš atliekant ESC, tiriamų junginių UV-Vis spektrai ir pikai nustatyti UV spektrofotometru („Thermo Spectronic Genesys 2 UV-visible spectrophotometer model no. 336002“). Naudojantis šia ESC metodika, buvo nustatytos tikslios susintezuotų junginių UV-Vis spektrų pikų reikšmės. Šios reikšmės pateiktos 3 lentelėje. Susintezuotų junginių (PV-1 – PV-10) spektrai pateikti 1 priede.

2.1.5 Sieros procento nustatymas Šionigerio metodu

Bario chlorato tirpalo gamyba:

Analitinėmis svarstyklėmis atsveriama 0,9868 g bario karbonato, išdžiovinto 105 ºC. Supilama į 1 l matavimo kolbą. Į šią kolbą įlašinama 1,3 ml 57 % perchlorato rūgšties (ρ = 1,500 g/cm

) ir įpilama 20 ml distiliuoto vandens. Kolba maišoma, kol ištirpsta bario karbonatas. Įlašinami dar 5 lašai perchlorato rūgšties, įpilama 80 ml distiliuoto vandens ir tirpalas praskiedžiamas etanoliu iki 1 l žymės. Tirpalo pH ~ 3.

Sieros kiekio nustatymas:

Analitinėmis svarstyklėmis pasveriamas tikslus kiekis analizuojamos medžiagos (apie 0,003–

0,005 g.) ant specialios formos bepelenio filtro. Filtras su tiriama medžiaga sulankstomas. Sulankstytas bepelenis filtras įdedamas į platininės vielos krepšelį, kuris yra pritvirtintas prie kamščio. Į kolbą su šlifu įpilama 4 ml distiliuoto vandens ir įlašinama 4 lašai perhidrolio. Kolbos pripildomos deguonimi, padegamas filtro kraštas ir kolba staigiai užkemšama kamščiu. Sudegus tiriamajai medžiagai, kolbos purtomos 30 min., kol išsisklaido kolboje esantis rūkas. Po 30 min. atkemšamas kamštis, kolbos sienelės ir platinos vielos tinklelis praplaunami 16 ml acetono. Į tirpalą įlašinami 3 lašai 0,2 % vandeninio torino tirpalo ir 2 lašai 0,0125 % vandeninio metileno mėlio tirpalo. Tirpalas titruojamas 0,005 M bario chlorato tirpalu. Titruojama kol tirpalo spalva iš žalsvos pasikeičia į rožinę.

Sieros kiekis procentais tiriamajame junginyje nustatomas pagal formulę:

Kur: n – sieros atomų skaičius junginio molekulėje, M – bario chlorato molinė koncentracija, V – titravimui sunaudotas bario chlorato tirpalo kiekis ml, F – faktorius (nustatomas bario chloratu titruojant 1 ml 0,02 N sieros rūgšties sumaišytą su 1 ml vandens ir 8 ml acetono, pridėjus 3 lašus 0,2 % vandeninio torino tirpalo ir 2 lašus 0,0125 % vandeninio metileno mėlio tirpalo), a – atsvertas tiriamojo junginio kiekis mg.

Nustatyti sieros kiekiai procentais pateikiami 1 ir 2 lentelėse. Nurodytas 3 bandymų vidurkis.

2.2 Priešmikrobinio aktyvumo prognozė in silico

Junginių priešmikrobinio aktyvumo prognozė atlikta panaudojant PASS programą (Prediction of Activity Spectra for Substances). PASS prognozuoja daugiau nei 4000 biologinio aktyvumo rūšių, įskaitant farmakologinius, veikimo mechanizmų, toksinius ir nepageidaujamus poveikius, sąveikas su metabolizmo fermentais ir pernešėjais, įtaką genų raiškai ir kitus galimus biologinius poveikius.

Prognozė grindžiama daugiau nei 250000 biologiškai aktyvių medžiagų, įskaitant vaistus, vaistus kandidatus ir toksiškus junginius, struktūros-aktyvumo ryšio analize. PASS vienu metu pateikia daugelio biologinio aktyvumo rūšių remiantis organinių junginių struktūra [66].

PASS panaudota įvertinti galimą antibakterinį ir priešgrybelinį veikimą. Prognozuojant pateikiamas galimas susintezuoto junginio biologinio aktyvumo sąrašas su tikimybės reikšmėmis, kurios gali būti įvardijamos taip:

Tikimybė „turi būti aktyvus“ (Pa) – įvertinama tikimybė, kad junginys priklauso aktyvių junginių poklasei.

Tikimybė „turi būti neaktyvus“ (Pi) – įvertinama tikimybė, kad junginys priklauso neaktyvių junginių poklasei.

Pa reikšmės gali būti interpretuojamos taip [3, 6]:

1. Pa > 0,7. Junginio aktyvumą patvirtinti eksperimentiškai yra didelė tikimybė, tačiau daugeliu atvejų junginio struktūra yra labai panaši į žinomų farmacinių preparatų struktūrą.

2. 0,5 < Pa < 0,7. Tikimybė, kad junginys pasižymi sistemos nurodytu biologiniu aktyvumu yra mažesnė, tačiau tiriamo junginio struktūra nėra labai panaši į žinomų farmacinių preparatų struktūrą.

3. Pa < 0,5. Šiuo atveju tikimybė eksperimentiškai nustatyti programos spėjamą junginio farmakologinį aktyvumą yra dar mažesnė, junginys tik nežymiai panašus į junginius iš sistemoje sukauptos duomenų bazės.

Atlikta visų šiame darbe aprašytų rodanino darinių priešmikrobinio aktyvumo prognozė (4 lentelė).

4 lentelė. Antibakterinio ir priešgrybelinio aktyvumo prognozė

Junginys Antibakterinis Priešgrybelinis

Pa Pi Pa Pi

PV-1 0,487 0,018 0,661 0,012

PV-2 0,454 0,021 0,652 0,013

PV-3 0,490 0,017 0,644 0,014

PV-4 0,457 0,021 0,634 0,015

PV-5 0,266 0,074 0,554 0,023

PV-6 0,216 0,104 0,537 0,025

PV-7 0,321 0,053 0,548 0,024

PV-8 0,268 0,074 0,531 0,026

PV-9 0,346 0,044 0,530 0,026

PV-10 0,297 0,061 0,514 0,028

2.3 Priešmikrobinio aktyvumo tyrimas in vitro

Susintetintų junginių mikrobiologinis tyrimas atliktas su šiomis bakterijų ir grybelio kultūroms:

 Staphylococcus aureus ATCC 25923

 Enterococcus faecalis ATCC 29212

 Escherichia coli ATCC 25922

 Pseudomonas aeruginosa ATCC 12453

 Klebsiella pneumoniae ATCC 13883

 Proteus mirabilis ATCC 12459

 Bacillus subtilis ATCC 6633

 Bacillus cereus NCIMB 50014

 Candida albicans ATCC 60193

Tyrimams buvo naudotos šviežios (24 val. senumo) bakterijų ir grybelio kultūros, užaugintos ant nuožulnaus agaro 10 ml mėgintuvėliuose. Bakterijoms auginti naudotas Miulerio-Hintono agaras, o grybeliui C. albicans – sabūro agaras.

Minimalios slopinančios junginių koncentracijos nustatytos serijinio skiedimo standžioje terpėje (Mueller-Hinton agar, Oxoid Ltd., Basingstoke, Hampshire, England) metodu.

Etaloninių mikroorganizmų kultūrų paruošimas

Etaloninės mikroorganizmų kultūros buvo auginamos 20-24 val. 35-37 ºC temperatūroje ant nuožulnaus agaro 10 ml talpos mėgintuvėliuose. Bakterijoms auginti naudotas Miulerio-Hintono agaras, o grybeliui C. albicans – sabūro agaras. Mikroorganizmų suspensija gaunama iš užaugintų bakterijų jas suspenduojant fiziologiniame natrio chlorido tirpale (0,9 %). Suspensija standartizuota panaudojant McFarland standartinį indikatorių, kuris matuoja mėgintuvėlyje esančios bakterijų suspensijos drumstumą. Esant indikatoriaus reikšmei 0,5, suspensija laikoma standartizuota. Tai reiškia, kad 1 ml suspensijos yra 1,5 x 10

mikroorganizmų ląstelių.

Tiriamųjų junginių tirpalų paruošimas

Susintetinti junginiai netirpsta vandenyje ir nevienodai tirpsta organiniuose tirpikliuose.

Kadangi junginių tirpumas yra prastas, kaip tirpiklis pasirinktas dimetilsulfoksidas (DMSO). Paruošta

pagrindinių tirpalų koncentracija lygi 8000 μg/ml. Kadangi junginiai nėra 100 % grynumo, medžiagos perskaičiuotos ir atsvertos taip, kad tirpale būtų norima pagrindinio junginio koncentracija;

pasinaudota šia formule:

ū ž

Pvz., reikalingas atsverti junginio PV-1 svoris randamas taip:

Atsvertų medžiagų kiekiai pateikiami 5 lentelėje.

Skiedžiant pagrindinį tirpalą (8000 μg/ml) pagaminti mažesnių koncentracijų tirpalai (1000 μg/ml, 125 μg/ml). DMSO turi priešmikrobinį veikimą, todėl lygiagrečiai buvo atliekamas kontrolinis bandymas siekiant nustatyti, kokioje koncentracijoje jo priešmikrobinis veikimas nepasireiškia.

5 lentelė. Atsverti medžiagų kiekiai

Junginys Koncentracija mg/ml

Reikalingas kiekis mg pagaminti 5 ml tirpalo

Junginių grynumas %

Atsvertas kiekis mg 5 ml tirpalo gauti

PV-1 8 40 84,6 47,28

PV-2 8 40 85,8 46,62

PV-3 8 40 99,8 40,08

PV-4 8 40 99,3 40,28

PV-5 8 40 84,2 47,51

PV-6 8 40 95,9 41,71

PV-7 8 40 73,5 54,42

PV-8 8 40 83,7 47,79

PV-9 8 40 73,6 54,35

PV-10 8 40 94,5 42,33

Nitrofurantoinas 8 40 98 40,82

Petri lėkštelių paruošimas ir mikroorganizmų sėjimas

Reikiamas kiekis tiriamojo junginio tirpalo aseptinėmis sąlygomis perkeliamas sterilia pipete į sterilų matavimo cilindrą, pripilama išlydyto ir ataušinto iki nemažesnės kaip 55

Miulerio–Hintono agaro, sumaišoma, lydinys supilamas į Petri lėkštelę, vienodai paskleidžiamas ir paliekamas sustingti. Kontrolinė Petri lėkštelė, pagal kurią vertinamas mikroorganizmų augimas, paruošiama tokiu pat būdu, tačiau nededant tiriamųjų junginių tirpalo.

Standartizuotos mikrobų kultūrų suspensijos sėjamos po 0,1 ml kilpele ant sustingusios

standžios terpės. Išdžiūvus pasėtai mikrobų kultūrų suspensijai, Petri lėkštelės dedamos į termokamerą

ir paliekamos vienai parai.