3.2. FLAVONOIDI NEL GENERE Pulsatilla

3.2. FLAVONOIDI NEL GENERE Pulsatilla

3.2.1 DISTRIBUZIONE DEI FLAVONOIDI NELLA FAMIGLIA DELLE RANUNCULACEAE

Nel 1986 Lebreton et al, effettuarono uno studio molto vasto sulla distribuzione dei flavonoidi nelle Ranunculaceae, analizzando 17 generi e 44 specie di piante erbacee appartenenti a questa famiglia e arrivando a riconoscere nei flavonoidi un marker affidabile per la chemiotassonomia delle Ranunculaceae. Dai risultati emerse inoltre che i flavonoidi più diffusi nelle specie analizzate risultavano essere quercetina e kaempferolo.

Tra le specie analizzate figurano anche 14 specie del genere Ranunculus L. Subgenus Batrachium tutte contenenti il flavonoide quercetina, risultato confermato da studi successivi ( Fiasson et al., 1997 ). Quest'ultimi infatti hanno analizzato con metodica HPLC l'accumulo di quercetina e di quercetina 3-C glicoside nel genere Ranunculus Subgenus Batrachium.

ć ć

Nel 1994 Bulatovi and Gorunovi hanno condotto uno studio su genere Anemone nemorosa L. identificando e isolando quercetina 3- - glucuronide.α

Nel 2008 Mariani et al. hanno condotto uno studio su Aconitum anthora L. identificando e isolando dall'estratto metanolico delle parti aeree due nuovi flavonoidi glicosilati, con agliconi quercetina e kaempferolo, oltre a due glicosidi noti, clovina e robinina.

3.2.2. FLAVONOIDI DA Pulsatilla GENUS

Altri composti bioattivi presenti in questo genere di pianta sono i flavonoidi rappresentati soprattutto da FLAVONOLI e ANTOCIANIDINE.

L'accumulo di flavonoidi liberi sulla superficie delle parti aeree delle piante è un fenomeno molto comune nelle Angiospermae.

Per essi non è stata stabilita ancora una funzione universale ma più comunemente è stato proposto questo:

1-protezione delle piante dai raggi UV, luce, insetti, funghi, virus e batteri 2-l’attrazione di impollinatori

3-antiossidanti

4-controllo di ormoni

5-stimolanti nella produzione di noduli dal battere Rhizobium

6-inibitori enzimatici

Sono di vitale importanza per l’uomo e generalmente considerati benefici nel trattamento dell’ipertensione, nei disordini circolatori e anche come cofattore con la Vitamina C.

Sono ampiamente distribuiti in questo genere di pianta, soprattutto presenti nei petali e nelle foglie. Si trovano sia allo stato libero, genine, sia sottoforma di glicosidi.

La parte agliconica è variabile ma sempre riconducibile all’unità base a 15 atomi di C del FLAVANO, formato da 2 anelli benzenici A e B, uniti da una catena a 3 atomi di C appartenente al sistema eterociclico del pirano, anello C

In base allo stato di ossidazione dei C in posizione 2,3 e 4 questi composti si classificano

Più abbondanti sono flavoni, flavonoli, antocianidine e rispettivi glicosidi.

3.2.3. IMPORTANZA DEI FLAVONOIDI

capacità di impartire colorazioni: i flavonoidi ed i calconi danno colorazioni

gialle, le antocianidine danno colorazioni rosso, blu e violetto. Anche le sostanze incolori come i flavoni, assorbendo fortemente la luce UV, sono percepibili dagli insetti e possono agire come segnali visivi per gli insetti impollinatori;

proprietà astringente: le catechine formano degli oligomeri (piccoli

polimeri) detti tannini condensati che contribuiscono al gusto astringente di alcuni cibi e bevande ( queste sostanze hanno anche importanza commerciale nella concia delle pelli), inoltre insieme ad altri flavonoidi rappresentano un sistema difensivo contro insetti nocivi;

funzione di catalizzatori nella fotosintesi e/o come regolatori dei canali del

ferro attraverso la fosforilazione di proteine;

azione antiossidante nelle cellule vegetali attraverso sistemi di trasporto di

elettroni. E' stato dimostrato che i flavonoidi del vino rosso (quercetina,

kaempferolo o antocianidine) e del thè (catechine e suoi esteri con l'acido

gallico) si sono dimostrati molto efficaci antiossidanti contro i radicali liberi. Le proprietà farmacologiche, biologiche e medicinali dei flavonoidi includono:

i.effetti vasodilatatori che migliorano l'elasticità dei vasi sanguigni;

ii.effetti antibatterici e antivirali (contro HIV, Herpes simplex, virus

iii.una attività antiinfiammatoria e antiallergica attraverso l'inibizione della

lipossigenasi;

iv.una attività immunostimolante;

v.una attività anticarcinogenica e antitumorale prevenendo certi tipi di

tumore;

vi.inibitori di numerosi enzimi come la ciclossigenasi, la fosfolipasi A2 e la lipossigenasi.

3.2.4. ATTIVITÀ ANTIOSSIDANTE DEI COMPOSTI POLIFENOLICI

Ci sono numerosi studi (Rosati O., 2008) che stanno valutando l'attività

antiossidante di composti polifenolici come flavonoidi e derivati caffeoilchinici. I meccanismi che sono alla base dell'attività antiossidante includono:

soppressione delle specie reattive dell'ossigeno formate, attraverso

l'inibizione di enzimi o la chelazione di elementi coinvolti nella produzione di radicali liberi;

eliminazione delle specie reattive dell'ossigeno;

“up-regolation” o protezione delle difese antiossidanti del corpo umano.

In particolare, per quanto riguarda i meccanismi di soppressione ed eliminazione dei radicali liberi, si possono verificare i seguenti meccanismi

inibizione degli enzimi responsabili della produzione dell'anione superossido , come la xantina ossidasi e la proteina chinasi C.

influenza sull'attività di numerosi enzimi coinvolti nella generazione di specie reattive dell'ossigeno come la ciclossigenasi, la lipossigenasi, la

monossigenasi microsomiale, la glutatione S-trasferasi, l'NADH ossidasi. Ci sono numerosi studi che stanno valutando l'attività antiossidante di composti polifenolici come flavonoidi e derivati caffeoilchinici. E' ormai consolidato che i flavonoidi possiedono eccellenti attività di “radical scavenger”, ma la discussione è ancora aperta su come si esplica e quali siano le parti della struttura chimica del composto su cui si basa l'attività. ( Pietta P.G., 2000).

3.2.5. BIOSINTESI DEI FLAVONOIDI

la formazione delle principali sottoclassi dei flavonoidi, coinvolge sia derivati dell’acido cinnamico (C6- C3), formato a partire dalla fenilalanina mediante la via

dell’acido shikimico (anello B e atomi 2,3 e 4 anello eterociclico), sia 3 molecole

Fig. 3.1: via biogenetica dell'acetato per la formazione dell'anello A dei flavonoidi.

3.2.6. VIA DELLO SHIKIMATO

La via dello shikimato comincia con l’accoppiamento del fosfoenolpiruvato (PEP), proveniente dalla glicolisi, con il D-eritrosio 4-fosfato per dare l’intermedio a sette atomi di carbonio, acido 3-desossi-D-arabino-eptulosonico 7-fosfato (DANP) .

E’ noto che questa reazione, mostrata in Fig. 3.2, come semplice reazione aldolica, procede con un meccanismo più complesso nella versione catalizzata da enzimi.

In seguito si ha eliminazione di acido fosforico dal DAHP e una reazione aldolica intramolecolare che genera il primo intermedio carbociclico acido 3-deidrochinico. Anche questa tuttavia è solo una semplificazione.

In realtà l’eliminazione dell’acido fosforico segue una ossidazione dipendente dal NAD+ _{dell’ossidrile centrale, che poi è riformato in una reazione di riduzione} dipendente dal NADH del composto carbonilico intermedio immediatamente prima della reazione aldolica.

Tutte queste trasformazioni avvengono in presenza di un singolo enzima.

La riduzione dell’acido 3-deidrochinico porta all’acido chinico, una sostanza naturale molto comune ritrovata in forma libera, come estere, o in combinazione con alcaloidi come la chinina.

L’acido shikimico si forma dall’acido deidrochinico attraverso l’acido 3-deidroshikimico con stadi di deidratazione e riduzione.

Un composto collaterale molto importante nella via dello shikimato è l’acido corismico che incorpora una ulteriore molecola di PEP come catena laterale di tipo etere enolico. Fig. 3.2: via dello shikimato

Il PEP si combina con l’acido shikimico 3-fosfato prodotto da una semplice reazione di fosforilazione dipendente dall’ATP. Questo reagisce con il PEP attraverso una reazione di addizione-eliminazione che dà l’acido 5-enolpiruvilshikimico 3-fosfato (EPSP). Questa reazione è catalizzata dall’enzima ESPS sintetasi. La trasformazione dell’ESPS in acido corismico prevede una eliminazione 1,4 di acido fosforico, sebbene probabilmente questa eliminazione non sia concertata (Fig. 3.3).

L’acido corismico è successivamente trasformato in acido prefenico, dal quale, con passaggi ulteriori, si formeranno gli amminoacidi aromatici tra cui la L-fenilalanina (Fig. 3.4):

Fig. 3.3

La trasformazione dell’acido corismico ad acido prefenico avviene con una singolare trasposizione. Questa reazione, detta trasposizione di Claisen,(Fig. 3.5), trasferisce la catena laterale derivante dal PEP in modo che essa diventi direttamente legata al carbociclo, e così genera lo scheletro carbonioso di base della fenilalanina e tirosina. In natura questa reazione è catalizzata da una enzima detto corismato mutasi, e sebbene possa anche avvenire termicamente, la sua velocità aumenta di 10 volte in presenza dell’enzima. L’enzima ottiene questo risultato legando il conformero pseudo assiale dell’acido corismico, in modo da rendere possibile uno stato di transizione con geometria a sedia.

Il percorso che porta dall’acido prefenico agli amminoacidi aromatici L-fenilalanina e L-tirosina può variare a seconda dell’organismo e anche secondo le attività enzimatiche disponibili .

Essenzialmente sono necessarie solo tre reazioni, aromatizzazione, decarbossilazione, transamminazione e, nel caso della tirosina, ossidazione, ma quello che differenzia le varie strade è l’ordine in cui avvengono queste reazioni. Per la biosintesi delle fenilalanina, in particolare, che è l’amminoacido che ci interessa maggiormente in questo caso, è necessaria la aromatizzazione decarbossilativa dell’acido prefenico, che porta all’acido fenilpiruvico, e una transamminazione dipendente dal PLP. Ciò porta alla L-fenilalanina. In presenza di una deidrogenasi dipendente dal NAD+ la aromatizzazione decarbossilativa avviene con conservazione della funzione ossidrilica, anche se al momento non ci sono evidenze della partecipazione come intermedio di un qualche analogo carbonilico dell’acido prefenico. La transamminazione del risultante acido 4-idrossifenilpiruvico porta alla L-tirosina (Fig. 3.4).

Quando la transamminazione dell’acido prefenico avviene prima della aromatizzazione decarbossilativa e il risultato è l’acido L-arogenico, che può essere trasformato sia in L-fenilalanina che in L-tirosina a seconda della presenza o dell’assenza di una adatta deidrogenasi (Fig. 3.4)

Fig. 3.5

La L-fenilalanina e la L-tirosina, come mattoni biosintetici C6-C3, sono i precursori di una vasta gamma di sostanze naturali. Nelle piante, un primo stadio osservato spesso è la eliminazione dell’ammoniaca dalla catena laterale per generare il rispettivo acido trans (E) cinnamico.

Nel caso della fenilalanina questa dà l’acido cinnamico vero e proprio, mentre la tirosina dà l’acido 4-cumarico (o p-cumarico).

Tutte le piante sembrano avere la capacità di deamminare la fenilalanina attraverso l’enzima fenilalanina ammonia liasi (PAL), ma la corrispondente trasformazione della tirosina è meno comune, essendo limitata solo alle Graminaceae. Alcuni dei più comuni acidi cinnamici naturali sono 4-cumarici, proprio come l’acido caffeico. Questi possono essere ritrovati nelle piante in forma libera o esterificata , per esempio con l’acido chinico nell’acido clorogenico (acido 5-O-caffeoilchinico) o con il glucosio:

3.2.7. BIOSINTESI DELL' ACIDO CAFFEICO

L’enzima fenilalanina ammonia liasi (PAL), è in grado di eliminare ammoniaca dalla fenilalanina, attraverso una eliminazione di tipo E2, con formazione dell’acido cinnamico.

Questo è successivamente ossidrilato con una reazione NADPH-dipendente ad acido p-cumarico, con introduzione di un gruppo ossidrile in posizione para. Una seconda ossidrilazione, con le stesse condizioni di reazione porta all’attacco di un secondo gruppo alcolico in posizione meta.

In questo modo la pianta biosintetizza l’acido caffeico.

3.2.8. BIOSINTESI DEI DERIVATI DELL’ACIDO CAFFEICO

I derivati dell’acido caffeico, sono derivati glucosilati mono-, di- e tri-sostituiti. Essenzialmente la reazione biosintetica di attacco della parte zuccherina, in questo caso, è una O-glucosilazione. (Bell E.A., 1980)

L’agente preposto per la reazione è una uridina difosfo-zucchero, ad esempio UDP-glucosio. E’ sintetizzato da glucosio 1-fosfato ed UTP.

Il processo di glicosilazione è una semplice reazione di sostituzione nucleofila

α

SN2. poichè l’UDP-glucosio ha il gruppo uscente in configurazione il prodotto ha configurazione β. Il prodotto è l’O- β-D-glucoside.

La reazione tra questo e una molecola di acido caffeico produce i vari derivati. Ad esempio i seguenti: acido clorogenico (7), acido 3,5-dicaffeoilchinico (8), acido 4,5-dicaffeoilchinico (9), acido 1,4,5-tri-O-caffeoilchinico (1):

Questi infatti garantiscono un ruolo prominente nel determinare colore e sapore di questo genere.

Infatti tali composti rappresentano una delle principali classi di precursori nella formazione di metaboliti secondari; essi infatti comprendono un ampio spettro di sostanze molto eterogenee ma tutte caratterizzate dalla presenza di un anello aromatico con 1 o più sostituenti OH.

La formazione via acido shikimico dell'anello aromatico dà luogo ai: 1)DERIVATI DEL 1-FENILPROPANO

2)derivati dovuti all' allungamento della catena del 1-fenilpropano

Es. acidi cinnamici ed i loro numerosi derivati, che comprendono gli acidi benzoici, le cumarine, i lignani, gli acetofenoni e le lignine.

La formazione dell'anello aromatico, via acetato, avviene tramite la formazione di un poli-ß-chetoestere (polichetide) che per successiva ciclizzazione dà origine ai prodotti fenolici (spesso policiclici)

Es. le cumarine, i cromoni, gli orcinoli, i depsidi (esteri), i depsidoni, i chinoni e gli xantoni.

Le piante in cui sono maggiormente presenti tali acidi sono:

−Arctostaphilos uva-ursi −Cynara scolimus

−Ortosiphon stamineus (o O. aristatus o O. spicatus) −Salix sp.

−Filipendula ulmaria −Solidago virgaurea

−Myroxylon balsamum var. pereirore (Balsamo del Perù) −Myroxylon toluiferum (Balsamo Tolu)

−Styrax tonkinensis (Benzoino del Siam)

−Styrax paralleloneurus (Benzoino di Sumatra) −Eugenia caryophyllata −Sassafras officinale −Pimpinella anisum −Illicium verum −Cinnamomum cassia −Cinnamomum zeylanicum −Foeniculum vulgare −Miristica fragrans

La classe dei fenilpropanoidi C6-C3, rappresenta un gruppo di sostanze ampiamente diffuse nelle piante e caratterizzate dalla presenza di un anello aromatico con una catena alifatica laterale con tre atomi di carbonio.

Tra gli acidi idrossicinnamici quelli più frequentemente ritrovati sono gli acidi caffeico, universalmente diffuso nelle piante superiori, p-cumarico, ferulico e sinapico.

Gli acidi idrossicinnamici ed i loro derivati possono esistere sia in forma cis (Z) che in forma trans (E), interconvertibile l'una nell'altra specialmente per effetto della luce UV: la forma prevalente in natura è quella trans, che è la forma più stabile.

Come mostrato schematicamente nella figura 1, la provenienza dei flavonoidi è da attribuirsi ad un duplice meccanismo biosintetico, che coinvolge la via dei polichetidi, per la sintesi degli anelli A e C, e via dell'acido schikimico per quanto riguarda la sintesi dell'anello B e che abbiamo già precedentemente esaminato. Una volta ottenuto la fenilalanina, essa va incontro ad una reazione di deamminazione ad opera della fenilalanina ammonia liasi (PAL) e varie reazioni di ossidrilazione dipendenti dal citocromo P-450.

Tutti i vari intermedi come acido ferulico, acido 4-cumarico, acido caffeico acido 4-idrossi-fenilpiruvico, acido trans-cinnamico, ecc possono rimanere come tali o essere derivatizzati ad esempio come esteri o glucosidi, tra queste gli acidi cinnamici ed i loro derivati, possono essere esterificati con il coenzima A, possono fungere anche come unità iniziale per l'allungamento della catena per aggiunta di tre unità C2 con formazione di specie polichetidiche (Fig. 2 )

Fig. 2

Anche se in apparenza la sintesi dei polichetidi sembrerebbe dovuta all'aggiunta di tre unità acetil coenzima A, fatto effettivamente riscontrabile nella molecola del polichetide ( Fig. 2 ), in realtà la biosintesi di queste strutture avviene per aggiunta di tre unità malonil coenzima A ( C3 ) ( Fig. 3)

Fig. 3: meccanismo di allungamento della catena nella biosintesi dei polichetidica

La conversione dell'acetil-CoA in malonil-CoA comporta un aumento dell'acidità degli α-idrogeni , in quanto adiacenti a due carbonili, rendendo così disponibile un miglior nucleofilo per la reazione di Claisen. Il motivo per cui non si osserva la formazione di derivati acilati del malonil-CoA è dovuto al fatto che la reazione di Claisen avviene contemporaneamente alla perdita (per decarbossilazione) del gruppo carbossilico precedentemente introdotto. L'introduzione di un gruppo carbossilico sull'acetil-CoA ha quindi il suo ruolo di aumentare la reattività del nucleofilo per facilitare la reazione di Claisen, venendo infatti rimosso una volta svolto il suo compito.A questo punto a seconda della natura del sistema enzimatico che interviene, la catena polichetidica può ripiegarsi in diversi modi per dare reazioni di condensazione aldolica o di Claisen e formazione quindi di anelli aromatici. In questo caso tale ciclizzazione, avviene ad opera dell'enzima calcone sintasi e porta alla formazione dell'anello aromatico “A” dei flavonoidi (Fig. 4):

Fig. 4

L'ultimo passaggio è la formazione dell'anello “C” del flavonoide che avviene per

α β

attacco nucleofilo tipo Michael, dell'OH fenolico sul chetone , -insaturo. Questo passaggio è reversibile e dipende dalle condizioni, che nel caso siano acide, favoriscono la formazione del flavanone, nel caso siano basiche favoriscono la formazione del calcone; in natura tuttavia la reazione è catalizzata da un enzima che opera in maniera stereospecifica, generando un solo enantiomero del flavanone. Nella figura 4 tale ciclizzazione portava alla formazione della naringenina, un flavanone, che risulta essere a sua volta un nucleo di partenza per altri flavonoidi come riportato nello schema generale seguente

La naringenina, come anche altri flavonoidi, può subire diverse trasformazioni quali l'ossidrilazione, la glicosilazione e la dimetilallilazione portando ad un aumento consistente del numero dei composti possibili pur mantenendo nuclei di base comuni.

Nella figura 5 vengono riportate le possibili trasformazioni che può subire ad esempio la naringenina:

Le varie classi dei flavonoidi differisco nei livelli di ossidazione e nel pattern di sostituzione dell'anello C, mentre in ogni classe i vari composti differiscono nel numero e nel riarrangiamento di gruppi ossidrilici (OH) sugli anelli A e B, così come nella natura e nell'estensione della alchilazione e/o glicosidazione di questi gruppi ossidrilici.

Il glucosio è il residuo zuccherino più comune, ma è possibile trovare anche il galattosio, il ramnosio e lo xilosio. Tra le diverse classi di flavonoidi, quelle di maggior interesse sono i flavoni, i flavanoni, gli isoflavoni, i flavonoli, i flavanonoli, i flavan-3-oli e le antocianidine.

Come già anticipato, le strutture dei vari flavonoidi sono molto simili e riconducibili sempre al nucleo flavanico, come evidenziato nei seguenti schemi dove vengono suddivisi per classi:

A questi composti si devono in gran parte i colori delle piante, dei fiori e dei frutti, in particolare le sfumature brillanti di blu, rosso scarlatto e arancione.

Oltre ai vari tipi di verdure e frutti ( in particolare negli agrumi, nelle mele e nell'uva ), i flavonoidi si trovano anche nei semi, nelle noci, nei cereali, nelle spezie, nelle erbe aromatiche (rosmarino, timo e prezzemolo), nei legumi, nelle cipolle ed in varie piante medicinali; inoltre diverse bevande come il vino, il thè nero e verde, contengono quantità apprezzabili di flavonoidi.

Il genere Pulsatilla presenta studi limitati sul contenuto in flavonoidi, Nicolava et al., (2006) hanno condotto un lavoro su flavonoidi di superficie in specie poco studiate appartenenti alle famiglie delle Lamiaceae, Scrophulariaceae e Ranunculaceae.

Nei pochissimi studi sul genere Pulsatilla (Nicolava et al., 2006) i più importanti e comuni flavonoli sono kaempferolo e quercetina; essi si agganciano agli zuccheri (O-glicosidi) oppure sono presenti allo stato libero sulla superficie di foglie e petali.

Nel genere Pulsatilla le più importanti e comuni antocianidine sono la pelargonidina e la cyanidina che sono di particolare importanza in questo genere di piante perché provvedono a dare colore ai loro petali dei fiori e alle loro foglie: in special modo il colore rosso dei petali è attribuito alla presenza della pelargonidina. (Zhao S. X., 1995).

Nella Pulsatilla chinensis sono rivelate un elevato presenza di glicosidi flavonoidi aventi kaempferolo o quercetina come aglicone:

1. R1 =β-D-Gluc, R2 =R3 =R4 =H 2. R1 = β-D-Gluc, R2 =OH, R3 =caff, R4 =H 3. R1 =β-D-Gluc, R2 = R3 =H, R4 =caff 4. R1 = R2 = R3 =H, R4 =caff 5. R1 =β-D-Gluc, R2 =OH, R3 =H, R4 =caff 6. R1 = R3 =H,R2 =OH,R4 =caff O OH OH O H caff=(E)-caffeoil= 1. 3-O-[ α-L-arabinopyranosyl-(1→2)-β-D-galactopyranosyl]-7-O-β-D-glucopyranosylkaempferolo 2. 3-O-( α-L-arabinopyranosyl-(1→2)-{4-O-[(E)caffeoyl]-β-D-galactopyranosyl})-7-O-β-D-glucopyranosylquercetina 3. 3-O-{2-O-[(E)-caffeoyl]- α-L-arabinopyranosyl-(1→2)-β-D-galactopyranosyl}-7-O-β-D-glucopyranosylkampferolo 4. 3-O-{2-O-[(E)-caffeoyl]-α-L-arabinopyranosyl-(1→2)-β-D-galactopyranosyl}kaempferolo 5. 3-O-{2-[(E)-caffeoyl]- α-L-arabinopyranosyl-(1→2)-β-D-galactopyranosyl}-7-O-β-D-glucopyranosylquercetina