CAPITOLO 3
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3. MATERIALI E METODI
La parte di questo studio effettuata in vitro è stata condotta presso i laboratori del centro NEST (National Enterprise for nanoScience and nanoTechnology) della Scuola Normale Superiore dell’Università di Pisa. In questa struttura sono stati anche fabbricate le superfici anisotrope testate durante le fasi in vitro ed in vivo.
Per quanto riguarda invece i modelli sperimentali usati essi sono stati messi a disposizione dal Dipartimento di Scienze Cliniche e Biologiche dell’Università di Torino dove gli animali sono stati stabulati prima e dopo le procedure sperimentali e dove è avvenuta la valutazione dei rigenerati nervosi.
3.1 Studio in vitro della motilità delle cellule di Schwann di ratto in risposta a superfici anisotrope nanostrutturate
3.1.1 Fabbricazione delle membrane mediante Electron Beam Lithography (EBL)
Le membrane polimeriche sono stata fabbricate presso i laboratori del centro NEST della Scuola Normale Superiore di Pisa.
Le superfici topograficamente strutturate sono state fabbricate con un processo in due tempi, ottenendo una replica di uno stampo pilota micro-strutturato creato con l’utilizzo della litografia a fascio elettronico (EBL). Le superfici finali adoperate sono state di fatto il modello negativo dello stampo pilota costruito usando due diversi modelli di superficie anisotropa ovvero una serie di creste di 2 e 10 µm separate da un solco delle stesse dimensioni (periodo complessivo 4 e 20 µm rispettivamente) con uno spessore di 2,5 µm disposte su una sola superficie della membrana.
- 65 - Successivamente due membrane sono state unite attraverso il lato liscio per ottenere un singolo substrato microstrutturo su entrambi i lati.
I substrati sono fabbricati in PolyDiMethilSiloxane (PDMS). Il prepolimero è stato miscelato con del catalizzatore in un rapporto di 10:1.
Il processo successivo di spin coating può essere schematizzato in quattro fasi principali:
1 Deposizione della soluzione sul substrato
Alcune gocce di soluzione sono state depositate sulla superficie del substrato microstrutturato. Il substrato è stato poi solidarizzato al disco rotante dello spin-coater applicando una pressione negativa all’interfaccia delle due superfici.
2 Accelerazione del substrato fino al raggiungimento della velocità scelta
In questa iniziale fase si è avuto l'espulsione del liquido in eccesso con formazione di vortici a spirale ed increspature della superficie del polimero. 3 Rotazione del substrato a velocità costante
La forza centrifuga assottiglia il polimero fino a quando tale energia non viene bilanciata dalle forze viscose del polimero stesso.
4 Rotazione del substrato a velocità costante ed evaporazione
Le forze viscose aumentano rapidamente a causa della progressiva evaporazione del solvente; si giunge ad un bilanciamento fra forza centrifuga e l’assottigliamento del film termina.
Il prepolimero è stato lasciato sullo spin-coated per 4 minuti ad una velocità di 300 rpm per ottenere una membrana di 180 μm di spessore. Al fine di ridurre le discontinuità della superficie, la membrana è lasciata riposare per 10 minuti quindi cotta in forno per ulteriori 10 minuti a 80°C.
A seguito dell’avvenuta polimerizzazione termica, la membrana presentava sulla superficie a contatto con lo stampo iniziale una replica in negativo
- 66 - della topografia disegnata su di esso. A questo punto la membrana può essere sollevata dallo stampo usando il bisturi e le pinzette; il primo strato del nostro scaffold è stato prodotto.
La seconda superficie del substrato è stata fabbricata in modo analogo, variando però il tempo di spin-coating del prepolimero (sempre PDMS) e la velocità di rotazione, 2 minuti a 1000 rpm, ottenendo un film di 40 µm di spessore. Analogamente alla preparazione della prima membrana anche questo substrato è stato lasciato riposare per 10 minuti e poi polimerizzato per 10 minuti ad una temperatura di 80°C.
Il passaggio successivo è stato quello di unire covalentemente le due membrane e solo a questo momento procedere al distacco del prodotto finito dallo stampo pilota. Il legame che si crea fra le due membrane di PDMS è ottenuto con un’attivazione al plasma di ossigeno: entrambi i substrati sono stati esposti per 25 secondi ad un plasma di ossigeno (10W, 1.4e-1 mbar), allineata la topografia delle due superfici strutturate e poi messi in contatto.
Il prodotto finale ottenuto è stato un doppio strato di PDMS con spessore uniforme di 220 μm, microstrutturato su entrambe le superfici che a sua volta è stato cotto ad 80°C per 1 ora così da migliorare l'efficienza del legame fra le due superfici.
Le membrane con superficie liscia sono state prodotte con gli stessi procedimenti sopra esposti utilizzando però uno stampo pilota liscio (Fig
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Figura 19: esempio di Litografia a Fascio Elettronico (EBL) per la produzione
di scaffold micro/nanostrutturati in PDMS.
3.1.2 Scelta delle cellule e condizioni di coltura
Sono state allestite delle colture primarie di cellule di Schwann partendo da nervi sciatici di ratti adulti (Sprague Dawley). Ai nervi è stato rimosso l’epinervio e successivamente sono stati tagliati e poi lasciati per 2 settimane in piastre Petri insieme ad un mezzo di cultura DMEM per eliminare dal preparato i fibroblasti presenti.
I nervi sono stati quindi fatti digerire da una soluzione enzimatica composta da collagenasi (0,625 mg/ml) e dispasi (0,5 mg/ml) ed infine dissociati utilizzando una pipetta Pasteur di vetro.
La soluzione di cellule di Schwann così ottenuta è stata disposta su di una piastra e mantenuta in cultura in condizioni standard (5% CO2 e 95%
umidità) in mezzo DMEM contenente 1 g/l di glucosio, 10% siero FBS, glutammina 4 mM, 1% penstrep e supplementato con forskolina 10 µM e Glial growth factor (GGF) 63 ng/ml (mezzo Schwann cells growth medium: SCGM). Successivamente le cellule di Scwhann sono state applicate su piastre pre-trattate con Poli-D-Lisina (100 µg/ml, in H2O) per 30 minuti e poi
lavate 2 volte con H2OmQ sterile. Le cellule sono state mantenute in cultura
- 68 - Ogni 15 giorni circa, per ridurre il numero dei fibroblasti ed arricchire il numero relativo delle cellule di Schwann presenti nella coltura, le cellule sono state sottoposte ad un trattamento di Immunodepletion. Questo procedimento è stato eseguito sul materiale biologico ottenuto a seguito della tripsinizzazione di una piastra a confluenza ed è stato incubato a 37° con 500 µl di anticorpo di mouse anti-rat Thy1.1 (Serotec, MCA04G) in proporzione di 1:500 con del DMEM per 10 minuti a cui è sono stati poi addizionati 250 µl di Rabbit Complement (AbD Serotec cod.C12CC), incubando il tutto per ulteriori 30 minuti a 37°.
Questo passaggio ha permesso di eliminare selettivamente le cellule positive al Thy1.1 ovvero i soli fibroblasti, cellule aggressive che avrebbero finito per inficiare i risultati dello studio. La soluzione ottenuta è stata poi centrifugata a circa 180 rpm e il materiale ottenuto (adesso ricco di cellule di Schwann) è stato nuovamente risospeso su terreno di coltura.
3.1.3 Studio della migrazione delle cellule di Schwann su scaffold anisotropi nanostrutturati
Prima di seminare le cellule di Schwann precedentemente preparate sono state approntate le superfici in PDMS sia con superficie liscia sia con nano strutturazione, quest’ultima, con periodi diversi (T4 e T20).
Per migliorare l’adesione e la vitalità cellulare queste superfici sono state trattate con una soluzione coating di Poli-L Lisina (PLL) 0.01% in acqua sterile per 30 minuti a temperatura ambiente e successivamente in laminina (50 µg/ml) a 37° per ulteriori 30 minuti.
Una volta preparati gli scaffold su di essi sono state seminate le cellule di Schwann (circa 80000 cellule/cm2 in mezzo SCGM completo).
Dopo 12 ore dalla semina, quando le cellule avevano ormai aderito al substrato, i campioni sono stati osservati e fotografati in time-lapse al Microscopio ottico invertito Nikon-ti PSF Widw-fiel (Nikon, Japan). I campioni sono stati spostati poi in un incubatore (Okolab, Italy) all’interno del quale sono state acquisite delle immagini in continuo per 24 ore associate a delle immagini in campo chiaro ogni 15 minuti (Dt) per 17 ore
- 69 - complessive utilizzando un obiettivo 20x (PlanFlour, Nixon). Ogni esperimento è stato ripetuto almeno tre volte (n=3) nelle medesime condizioni sperimentali.
Tutte le immagini ottenute sono state poi utilizzate per ricostruire i movimento di ogni singola cellula di Schwann durante la migrazione sui diversi substrati lisci e strutturati.
Le immagini acquisite sono state successivamente analizzate con il programma Image J (NHI, USA) ed il suo plugin M-Track. Questo programma ha permesso di analizzare i seguenti elementi:
• DS(t), vettore spostamento
• R(t) distanza raggiunta dalla cellula dal punto di partenza
• S(t) distanza cumulativa nel tempo, ovvero somma dei moduli DS
Gli spostamenti DS(t) sono stati suddivisi in allineati (con angolo ≤ 15° rispetto alla direzione del grating) e perpendicolari (con angolo > 75° e < 90° rispetto alla direzione del grating).
I dati così ottenuti sono stati analizzati tramite il programma GraphPad (Prism) ed i risultati ritenuti statisticamente significativi con P<0.05. I dati sono stati riportati come la media +/- SEM (errore standard della media).
3.2 Valutazione in vivo degli stadi precoci della rigenerazione nervosa del nervo mediano di ratto utilizzando scaffold con superfici a topografia anisotropa e nanostrutturata
3.2.1 Animai e Chirurgia
Per questo studio sono stati utilizzati 10 Ratti Sprague Dawley, femmine adulte del peso di circa 200 g l’una. Gli animali sono stati suddivisi in tre gruppi sperimentali. Tutti gli animali sono stati operati bilateralmente poi stabulati in una stanza con temperatura e umidità controllate, con cicli
- 70 - luce/buio di 12-12h e nutriti ed idratati ad libitum. Gli animali sono stati operati sotto anestesia generale, ottenuta mediante iniezione di Tiletamina + Zolazepam (Zoletil) 3mg/Kg.
Le procedure chirurgiche sono state eseguite con l’aiuto di un microscopio operatorio (Zeiss OPMI 7) con ingrandimento 40x. L’intervento chirurgico è stato eseguito bilateralmente sullo stesso ratto in modo da avere sul medesimo animale l’arto sinistro usato come modello sperimentale ed il destro come controllo.
Il ratto è stato posizionato supino, adagiato su di un apposito supporto con gli arti superiori abdotti ed extraruotati a 90° (Fig 19). E’ stata eseguita per prima un’incisione sull’arto superiore destro estesa dalla regione ascellare fino al gomito in modo da accedere al nervo mediano per tutto il suo decorso dall’ascella fino alla piega del gomito. Il nervo mediano è stato poi isolato, con l’utilizzo di strumentario microchirurgico, dalle adiacenti strutture nervose e vascolari per una lunghezza di circa 2 cm (Fig 20). Successivamente il nervo è stato resecato con forbici microchirurgiche rette e ne è stata asportata una porzione di circa 10 mm.
La fase successiva è stata quella di impiantare uno scaffold fabbricato in PolyDiMethilSiloxane (PDMS) con superficie liscia delle dimensioni di 10 mm x 2 mm x 220 µm. Per permettere un miglior adattamento del moncone nervoso allo scaffold su tutte e due i lati corti del parallelepipedo sono state praticate delle incisure a “V” all’interno delle quali sono stati alloggiati i due monconi nervosi.
Successivamente le due estremità del nervo sono state solidarizzate a livello equatoriale allo scaffold mediante quattro punti di sutura (due per ciascun moncone) utilizzando un filo di nylon 9-0 (Sharpoint Black monofilament). Dopo l’impianto è stato verificato che non ci fossero sanguinamenti e poi la cute è stata chiusa con una sutura in Vycril 4-0 a punti staccati.
Terminata la procedura chirurgica a destra, la stessa è stata ripetuta sull’arto superiore sinistro. I Passaggi chirurgici sono stati identici, tuttavia su questo lato è stato impiantato uno scaffold con superfici anisotrope
- 71 - nanostrutturate T 20, con creste di 10 µm di larghezza, 2,5 µm di altezza e solchi di 10 µm, delle dimensioni di 10 mm x 2 mm x 220 µm.
L’asse maggiore delle creste e dei solchi è stato posizionato parallelo all’asse di rigenerazione delle fibre nervose.
Gli animali sono stati poi monitorati giornalmente a seguito dell’intervento chirurgico allo scopo di per prevenire eventuali fenomeni di ulcerazione della pelle, diastasi della ferita chirurgica ed auto-mutilazioni.
Questo progetto è stato approvato dal Comitato Etico in accordo con la direttiva Europea del 24 Novembre 1986 (86/609/EEC) e con le attuali norme vigenti sul benessere degli animali da sperimentazione.
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A
B
C
Figure 19: A) Set di strumenti microchirurgici, B) posizione de ratto sul
supporto operatorio, C) incisione chirurgica con esposizione del nervo mediano.
A
B
C
D
E
Figura 20: A) Preparazione del
nervo mediano, B)Scaffold con superficie anisotropa nanostrutturata sul quale sono state praticate le due incisioni a”V”, C) posizionamento dello scaffold a colmare il gap nervoso, D-E) aspetto finale dell’impianto liscio e nanostrutturato.
3.2.2 Analisi della rigenerazione delle fibre nervose
I tre gruppi di animali sono stati sacrificati in tempi diversi.
Il gruppo I è stato analizzato il giorno dopo l’impianto degli scaffolds, il gruppo II a tre giorni, mentre il gruppo III dopo sette giorni dall’intervento. Immediatamente dopo il sacrificio, in ogni animale è stato esposto il nervo mediano da entrambi i lati. Successivamente si è provveduto a praticare la sezione perpendicolare del nervo stesso alcuni millimetri prossimale e distale alle suture.
Il tessuto rigenerato è stato valutato con l’utilizzo del esame macroscopico, della microscopia ottica, dell’esame immunoistochimico, della microscopia laser confocale e del microscopio elettronico a scansione (SEM).
Microscopia ottica
E’ stato utilizzato il microscopio ottico presente nel Dipartimento di Scienze Cliniche e Biologiche dell’Università di Torino tale strumento era tipo DM4000B al quale è stato collegato un apparecchio fotografico digitale. Le immagini sono state acquisite con un ingrandimento 20x.
Immunoistochimica e microscopia laser confocale
L’immunoistochimica è stata utilizzata in questo ambito come tecnica in grado d’individuare specifiche molecole del compartimento extra-cellulare. La metodica si basa sul principio di coniugazione fra antigene ed anticorpo associata a metodiche di rivelazione fluorescenti che ne consentono la visualizzazione al microscopio. La metodica usata è stata quella indiretta che utilizza due anticorpi: il primo diretto contro la molecola da ricercare, il secondo, coniugato con il colorante che poi si legherà al primo anticorpo. La molecola da ricercare nel campione viene riconosciuta da un anticorpo prodotto da un animale immunizzato contro quella molecola. E’ poi necessario che il secondo anticorpo utilizzato provenga da una specie diversa da quella che ha prodotto il primo anticorpo che viene riconosciuto come antigene.
- 75 - Nello specifico, da ogni animale il campione di nervo rigenerato è stato fissato in paraformaldeide al 4% per un periodo di 2-4 ore e quindi lavato in una soluzione di phosphate-buffered saline (PBS).
Sul campione in toto è stata successivamente effettuata l’incubazione overnight in una miscela costituita da due anticorpi primari: anti-neurofilamento (topo, diluito 1:200) per marcare gli assoni e anti S100 (coniglio, diluito 1:600) per marcare le cellule gliali. Questi anticorpi sono stati diluiti in una soluzione di PBS 0,01M pH7,4 e Triton-X100 0,1% e siero proveniente della specie nella quale è stato preparato l’anticorpo secondario.
In seguito sono stati eseguiti tre lavaggi, di 5 minuti l’uno, in PBS e l’incubazione a temperatura ambiente, per un’ora circa al buio, con gli anticorpi secondari coniugati con il fluoro cromo (anti-topo ALEXA 488-verde e anti-coniglio CY3-rosso). Tutte le incubazioni sono state effettuate in camerette umide.
I preparati, dopo tre lavaggi da 5 minuti l’uno in PBS, sono stati montati mediante il Fluorescent Mounting Medium (Dako) ed analizzati con un microscopio laser confocale (LSM-510, Zeiss, Jena, Germania).
Microscopio Elettronico a Scansione (SEM)
Il SEM non sfrutta la luce come sorgente di radiazioni bensì un fascio di elettroni che colpisce il campione da analizzare. Dal contatto fra elettroni e materiale vengono emesse delle particelle fra le quali degli elettroni secondari. Questi sono rilevati da un rivelatore e poi convertiti in impulsi elettrici. Il fascio di elettroni tuttavia non è fisso ma viene fatto passare sul campione con una morfologia di scansione rettangolare, riga per riga ed in sequenza. Il segnale degli elettroni secondari viene inviato ad un monitor sul quale viene visualizzata un'immagine in bianco e nero simile ad un’immagine fotografica.
Per questo tipo di analisi Il nervo precedentemente analizzato è stato fissato in glutaraldeide al 2,5% per un periodo di 2 ore e quindi lavato in una soluzione di phosphate-buffered saline (PBS). In seguito a
- 76 - disidratazione in etanolo (dal 50% al 100%) i campioni sono stati metallizzati con oro e osservati al SEM (Microscopio elettronico a scansione Quanta Inspect 200LV, Fei Company, The Netherlands).
