Materiali e metodi

2.1 Trasformazione di cellule di E.coli ed amplificazione

del DNA plasmidico.

2.1.1. Trasformazione

I plasmidi ottenuti tramite clonaggio, o provenienti da altri laboratori in forma di DNA assorbito su carta 3mm, sono stati amplificati, per averne una quantità sufficiente, tramite la tecnica della trasformazione di cellule batteriche competenti all’acquisizione del plasmide.

Le cellule di E. coli utilizzate, appartenenti al ceppo DH5

,

50mM, e conservate a -80°C fino al momento dell’uso.

Per la trasformazione è sufficiente aggiungere, ad una aliquota di 200µl di cellule competenti, da 5 a 20ng di plasmide superavvolto ed incubare in ghiaccio per circa 30 minuti. Successivamente si esegue un “heat shock” a 42°C per 45 secondi e a seguire una ulteriore incubazione in ghiaccio per 2 minuti. A questo punto si aggiunge 1ml di LB preriscaldato a 37°C, si incuba per 1 ora ed infine si piastrano le cellule su terreno solido selettivo (LB-agar contenente ampicillina 100µg/ml). Dopo incubazione a 37°C per tutta la notte, sulla piastra Petri compaiono le colonie: l’antibiotico fa si che crescano solo le cellule che hanno assunto il plasmide contenente il gene d’interesse e il gene che conferisce resistenza all’antibiotico.

Ogni volta che si effettua la trasformazione bisogna aver cura di verificare l’efficacia dell’antibiotico, piastrando parallelamente 200µl di cellule batteriche in assenza di DNA plasmidico

Soluzione:

Luria-Bertani Broth (LB)

NaCl 1℅

bacto tryptone 1℅ bacto yeast extract 1℅

2.1.2 Estrazione di DNA plasmidico su piccola scala mediante

lisi alcalina “(miniprep”)

Questo metodo permette di ottenere circa 2µg di DNA plasmidico. Da una piastra di cellule batteriche, recanti il plasmide d’interesse, o da uno “stock” di batteri in glicerolo, viene effettuato, in condizioni sterili, l’inoculo di una singola colonia in 3ml di brodo LB con ampicillina (100µg/ml), all’interno di un tubo batteriologico da 15 ml.

Il tubo viene incubato per circa 12-16 ore a 37°C in agitazione, affinché la coltura batterica raggiunga la fase di crescita stazionaria. La coltura viene quindi centrifugata a 12000rpm per 1-3 minuti, ottenendo così un “pellet” di cellule batteriche che viene poi risospeso in 400µl di soluzione di risospensione, o soluzione S1. Successivamente a questa si aggiungono 400µl di soluzione di lisi, o soluzione S2, e si inverte delicatamente.

La lisi non deve durare più di 5 minuti, trascorso questo tempo si aggiungono 400µl di soluzione neutralizzante, o soluzione S3, necessaria per far precipitare le membrane e le pareti delle cellule lisate, insieme al DNA cromosomico ed all’RNA ad alto peso molecolare ad esse associati.

Dopo una centrifugazione di 15 minuti a 12000rpm si recupera il sovranatante contenente il DNA plasmidico, l’RNA a basso peso molecolare e le proteine batteriche. Si aggiungono poi 0.7volumi (V) di isopropanolo, si inverte più volte per mescolare e si lascia riposare per 10 minuti a temperatura ambiente

In questo modo il DNA plasmidico e l’RNA a basso peso molecolare precipitano e vengono recuperati mediante centrifugazione (10 minuti a 12000rpm). Il pellet ottenuto viene lavato in etanolo (EtOH) al 70℅ e risospeso in 20µl di TE (O H2O

ultrapura), contenente RNAsiA ad una concentrazione di 100µg/ml, allo scopo di eliminare l’RNA a basso peso molecolare.

La concentrazione del DNA estratto e purificato viene stimata sottoponendo un’aliquota ad elettroforesi su gel di agarosio, con Bromuro di etidio (EtBr),

insieme ad aliquote di preparazioni a concentrazione nota utilizzate come “standard”.

Soluzioni: Soluzione 1 Tris-HCl 25mM pH 8 EDTA 10Mm Glucosio 50mM Lisozima 10mg/ml Soluzione 2 NaOH 0.2 M SDS 1℅ Soluzione 3 CHCOOH 5 M KCl 3 M TE Tris 10mM pH 8.0 EDTA 1 mM pH 8.0

2.1.3 Estrazione di DNA plasmidico su media scala (“midiprep”)

mediante colonne NUCLEOBOND

Questa tecnica prevede l’utilizzo di colonne cromatografiche NUCLEOBOND a scambio ionico disponibili in commercio insieme alle soluzioni necessarie per il loro impiego.

Con questa tecnica è possibile estrarre da 80 a 140µg di DNA altamente purificato.

Si parte da una coltura batterica di 50-100ml, ottenuta dopo incubazione a 37°C in agitazione O/N, se il brodo di crescita è torbido, si procede alla centrifugazione della stessa a 3000 rpm per 10 minuti. Si ottiene così un “pellet”

che viene risospeso in 4ml di soluzione S1; si aggiungono poi 4ml di soluzione S2, si capovolge delicatamente e si lascia a temperatura ambiente per 5 minuti. Si aggiungono quindi 4ml di soluzione S3 a 4°C, si capovolge delicatamente e si incuba in ghiaccio per 15 minuti; segue una centrifugazione a 4°C, per 30 minuti a 12000rpm. Il sovranatante viene recuperato e filtrato in modo da ottenere un lisato limpido.

A questo punto si procede alla estrazione del DNA plasmidico vera e propria. Per prima cosa si equilibra una colonna cromatografia AX-100, caricandola con 3ml di soluzione N2 e permettendone lo svuotamento per gravità; quindi questa stessa colonnina si carica con il lisato. In questo passaggio il DNA si lega alla resina.

Si eseguono poi due lavaggi consecutivi, ciascuno con 4ml di soluzione N3, per purificare il DNA dai sali e dall’ RNA residuo.

L’eluizione del DNA viene effettuata tramite un lavaggio con 2ml di soluzione N5. L’eluato viene precipitato con aggiunta di 0.7V di isopropanolo, mediante centrifugazione a 4°C per 30 minuti a 12000 rpm. Il “pellet” viene lavato con EtOH al 70℅ e risospeso in TE pH 8.0 (o in H2O mq).

Per stimare la quantità di DNA estratto si può ricorrere all’elettroforesi su gel di agarosio oppure se si desidera una misurazione più precisa, si può ricorrere a tecniche spettrofotometriche. Con lo spettrofotometro si può ottenere la stima della concentrazione (ricavata dall’assorbanza alla lunghezza d’onda di 260nm) di campioni diluiti della preparazione di DNA in esame, e della purezza del DNA estratto (ricavata dal rapporto OD260/OD280)

Soluzioni: S1

RNAsi A 100µg/ml

Tris-HCl 50 mM

S2 NaOH 200 mM SDS 1℅ S3 KCH3COOH 2.80 mM pH 5.1 N2 Tris 100mM EtOH 15℅ KCl+H3PO4 900mM pH 6.3 N3 Tris 100mM EtOH 15℅ KCl+ H3PO4 1150mM pH 6.3 N5 Tris 100mM EtOH 15% KCl+H3PO4 1000mM pH 8.5

2.2. Digestione di plasmidi con enzimi di restrizione

Per ottenere DNA stampo lineari, necessari per trascrivere, si utilizzano enzimi di restrizione che tagliano nel vettore, ma non nell’inserto, alla fine della regione che si vuole trascrivere.

Preferenzialmente si utilizzano enzimi che lasciano estremità 5’ protrudente oppure “blunt”; evitando così che l’RNA venga trascritto a partire dal filamento complementare a quello desiderato cosa che invece può accadere utilizzando come stampo un DNA con estremità 3’ sporgente.

In genere le restrizioni vengono effettuate in un volume finale di 20µl. La miscela di reazione è costituita dal DNA plasmidico, dall’enzima di restrizione, presente in concentrazione di 1-2 Unità Enzimatiche (UE) per µg di plasmide e dal tampone specifico per il tipo di enzima utilizzato.

Il volume di enzima aggiunto non deve superare 1/10 del volume della miscela di reazione, poiché una eccessiva concentrazione di glicerolo, in cui gli enzimi sono conservati, può interferire con la cinetica di reazione.

La reazione di digestione viene fatta procedere per almeno 2 ore, oppure “over-night” (O/N), in base alla quantità di DNA che deve essere digerito.

Al fine di verificare se la digestione è avvenuta in maniera completa, si sottopone su gel di agarosio all’1%, colorato con bromuro di etidio, 1/20 della miscela di reazione, accanto ad un’aliquota di plasmide non digerito.

Se la digestione è completa nella corsia del digerito avremo una banda unica (che in teoria dovrebbe migrare più lentamente rispetto al DNA non digerito) piuttosto che due o più bande corrispondenti a diverse forme di superavvolgimento del DNA circolare.

A questo punto si può procedere con la purificazione del DNA.

2.3 Purificazione del DNA

2.3.1 Estrazione fenolica

Per purificare il DNA dalle proteine, si porta la miscela di digestione ad un volume di 200µl con acqua e si aggiunge un uguale volume di fenolo-cloroformio-alcool isoamilico, soluzione 25:24:1 a pH 8

Dopo aver mescolato in maniera energetica con l’aiuto di un vortex, si centrifuga per 5 minuti a 12000 giri. Si ottiene così la separazione di due fasi, una organica contenente le proteine ed una acquosa contenente il DNA.

Con una micropipetta si preleva la fase acquosa e la si mette in una provetta nuova.

Questa tecnica si basa sul fatto che le proteine denaturate sono più solubili in fase alcolica che in fase acquosa: fenolo e cloroformio denaturano le proteine, il cloroformio facilita la separazione delle fasi, mentre l’alcool isoamilico riduce la formazione di schiuma durante l’estrazione.

Si procedi quindi con la precipitazione alcolica.

2.3.2 Precipitazione alcolica

Il DNA viene precipitato aggiungendo al prodotto dell’estrazione fenolica 0.1V di NaCH3COOH 3M pH 5.2 e 2.5V di EtOH assoluto. Dopo aver mescolato,

capovolgendo il tubo diverse volte, si mette la miscela a precipitare 60 minuti a -80°C,oppure “over night” a – 20°C.

Quindi si centrifuga per 20 minuti a 12000 rpm e si lava il “pellet” dai sali con EtOH al 70% freddo. Una volta che il “pellet” è asciugato, all’aria o con l’ausilio di una pompa a vuoto, si risospende il DNA in acqua sterile e si conserva a -20°C.

Per stimare la concentrazione del DNA linearizzato, si prende un‘aliquota che si presume corrispondere a circa 200/300ng di DNA, supponendo un recupero medio dell’80% dell’estrazione fenolica, e la si carica su gel di agarosio per stimarne la quantità reale.

2.4 Elettroforesi su gel di agarosio

Al fine di verificare la purezza del DNA estratto, la purezza dei trascritti, il grado di completezza raggiunto dalla digestione del DNA, nonché di stimare la concentrazione del DNA nelle preparazioni e la lunghezza in paia di basi degli acidi nucleici, si ricorre all’elettroforesi su gel d’agarosio.

I gel vengono preparati sciogliendo l’agarosio (0.8-1.5% peso/volume) in TBE e portandolo ad ebollizione.

La soluzione viene fatta raffreddare e prima che polimerizzi, si aggiunge EtBr ad una concentrazione finale di 10µg/ml. A questo punto il gel viene colato in un vassoio da elettroforesi di un apparato orizzontale, in cui è stato precedentemente posizionato un apposito pettine per la formazione dei pozzetti. Una volta polimerizzato, il gel viene posto nella vaschetta dell’apparato ed immerso nel tampone di corsa, TBE a pH 8.

Nel frattempo, si preparano i campioni, diluendoli in acqua e “loading buffer”. La funzione del “loading buffer” è di appesantire il campione, facendolo andare sul fondo del pozzetto, e consentire, allo stesso tempo, di seguire la corsa elettroforetica grazie alla presenza di due coloranti a diverso peso molecolare, che corrono a velocità diverse.

Dopo aver caricato i campioni su gel, si applica una differenza di potenziale di 50/120 V per un tempo variabile dai 5 ai 60 minuti. Al termine della corsa elettroforetica, il gel viene posto sotto i raggi U.V. per visualizzare le bande corrispondenti al DNA; il bromuro di etidio, che si è intercalato alle basi, appare, in queste condizioni, luminescente. Le dimensioni dei frammenti sono stimate in presenza di marcatori con peso molecolare noto.

Soluzioni: TBE pH 8.0 Tris base 0.089 M Acido borico 0.089 M EDTA 0.002 M Loading buffer 6x Glicerolo 5% blu di bromofenolo 0.05% xilene cianolo 0.05%

Gel di agarosio

Agarosio 0.8-1.5% (peso/volume) Bromuro di etidio 10 µg/ml finale

TBE 1x

2.5 Ibridazione in situ “whole mount”

L’ibridazione attraverso la tecnica di “whole mount” permette di studiare il “pattern” d’espressione di un gene durante lo sviluppo embrionale di Xenopus laevis. Gli esperimenti svolti in questa tesi sono stati condotti seguendo il protocollo messo a punto nel laboratorio del Dott. Igor Dawid (NIH, Bathesod, U.S.A.).

Durante l’esperimento gli embrioni si trovano in provette (“vials”) “RNase free” (RF). La vetreria per essere RF viene tenuta in stufa a 180°C per almeno 4 ore. L’acqua e tutte le altre soluzioni utilizzate nell’ibridazione vengono sterilizzate in autoclave.

Tutti i passaggi, se non diversamente indicato sono eseguiti sistemando le “vials” in orizzontale su un agitatore, aggiungendo e rimuovendo ogni volta 5 ml di soluzione

2.5.1 Raccolta di embrioni di Xenopus laevis

Gli embrioni sono ottenuti mediante la fecondazione in vitro.

Si anestetizza il maschio immergendolo in una soluzione di metanosulfurato dell’estere etilico dell’ acido aminobenzoico (MS222) 0.1% e, dopo averlo

sciacquato con acqua di rubinetto, lo si opera per asportagli il testicolo che, per qualche giorno, potrà essere conservato in una soluzione contenente MMR 1X , siero di pecora (LS=”lamb serum”) e l’antibiotico Gentamicina.

La femmina di Xenopus deve essere stimolata, 4-6 giorni prima della deposizione, con 100UI di Folligon Intervet per uso veterinario e, 10-12 ore

prima della deposizione, con 800/1000UI di Profasi HP 2000 Serono (gonadotropina corionica). Entrambi gli ormoni sono iniettati nel sacco perilinfatico della femmina. La deposizione delle uova è ottenuta facendo, manualmente, pressione sull’addome della femmina.

Le uova vengono raccolte in una piastra Petri, e immediatamente fecondate, passando sopra di esse, per qualche minuto, un frammento di testicolo e, eventualmente, lasciandolo in mezzo alle uova per circa 5 minuti; poi nella Petri si versa MMR 0.1X. La raccolta delle uova può essere fatta ogni 1-2 ore.

Dopo almeno 30 minuti dalla fecondazione, gli embrioni sono trattati con l’apposita soluzione degellificante di DDT per rimuovere il loro rivestimento gelatinoso e successivamente vengono abbondantemente sciacquate in MMR 0.1X e quindi lasciate in questa soluzione fino allo stadio voluto: fino a stadio di 2, 4, 8 cellule nel caso debbano essere utilizzati per le microiniezioni, oppure fino a stadi più avanzati per esperimenti di ibridazione.

Gli stadi sono classificati secondo i criteri di Nieuwkoop e Faber (1967) [45]. Dato che gli embrioni devono essere utilizzati in esperimenti di ibridazione “whole mount”, vengono privati della membrana vitellina tramite pinzette Dumont n°5 e poi fissati in MEMFA in “vials” di vetro da 5ml, lasciandole in oscillazione per 1 ora a temperatura ambiente. Il MEMFA sarà poi sostituito con metanolo o etanolo assoluto che consente di conservare gli embrioni per mesi, alla temperatura di -20 °C.

Soluzioni:

Soluzione per il testicolo (per 10ml)

MMR 1X fino a volume LS 2ml……. Gentamicina 50 µg/ml 10µl MMR NaCl 0.1 M KCl 2 mM MgSO4 1 mM CaCl2 2mM

HEPES 5mM pH 7.8 EDTA 0.1 M Soluzione degellificante DDT 3.2 mM Tris-HCl 0.2 M pH 8.8 MEMFA MOPS 0.1 M pH 7.4 EGTA 2mM MgSO4 1mM Formaldeide 3.7%

In genere si conservano “stocks” 10X sterili di una soluzione di Sali che si diluiscono e si addizionano di formaldeide al momento dell’uso.

2.5.2 Procedura di ibridazione

Gli embrioni, che sono conservati in metanolo assoluto (100%), vengono gradatamente reidratati, effettuando lavaggi di 5 min ciascuno, in una serie graduale di alcoli a concentrazione decrescente:

metanolo 75%, PBTw 25% metanolo 50%, PBTw 50% metanolo 25%, PBTw 75%

Vengono poi effettuati 2 lavaggi da 5 minuti in PBTw 100%. Dopo l’ultimo lavaggio in PBTw gli embrioni vengono incubati per 5 minuti a T ambiente con una soluzione di 10µg/ml di proteinasi K in PBTw. Durante questi 5 minuti le “vials” sono tenute in verticale, immobili.

Questo passaggio è molto delicato e la sua durata deve essere controllata con precisione in quanto una permanenza troppo lunga in questa soluzione potrebbe danneggiare gli embrioni. Si lava 2 volte per 1 minuto con PBTw, sull’agitatore in posizione verticale, sempre a T ambiente.

In agitazione verticale, gli embrioni vengono fissati in 4% paraformaldeide (4ml di PBS +1ml di 20% paraformaldeide) a T ambiente per circa 20 minuti.

Da notare che nel caso in cui si effettui una ibridazione in situ “whole-mount” su cervelli di Xenopus è necessario eliminare il trattamento con la proteinasi K, e quindi il successivo passaggio con la paraformaldeide al 4%, in quanto il tessuto dei cervelli è già sufficientemente permeabile ed estremamente delicato.

Gli embrioni vengono poi lavati brevemente 2 volte con PBTw, seguono 4 lavaggi di 5 minuti ciascuno (le “vials” sono nuovamente collocate sull’agitatore in posizione orizzontale). Si rimuovono quindi il PBTw da ogni provetta e lo si sostituisce con una soluzione costituita al 50% da miscela di ibridazione e al 50% da PBS, disponendo le “vials” sull’agitatore verticalmente per 3 minuti: questo passaggio è necessario per equilibrare gli embrioni alla nuova densità della miscela di ibridazione. Si ripete il passaggio utilizzando una soluzione composta al 100% da miscela di ibridazione, trascorsi i 3 minuti, si sostituisce con della nuova miscela di ibridazione, e si trattano gli embrioni per 2-3 ore a 60°C (questo passaggio prende il nome di pre-ibridazione).

Segue la fase di ibridazione in cui il tampone di preibridazione viene sostituito con 0.6ml di nuova miscela di ibridazione a cui si è aggiunta la sonda marcata con digossigenina o fluoresceina; utilizzando una quantità variabile di RNA “probe” (50-350ng), si porta, eventualmente a 10µl con H2OmQ e si denatura

per 2 minuti a 95°C.

Si aggiunge infine 0.6ml di miscela di ibridazione. L’ibridazione dura 12-16 ore a 60°C. Una volta rimosso, il tampone di ibridazione contenente la sonda può essere conservato e riutilizzato fino a due/tre volte.

A questo punto è necessario lavare l’eccesso di sonda non ibridata o ibridata in maniera aspecifica; a tale scopo si effettuano lavaggi a forza ionica decrescente, per aumentarne la stringenza, tenendo però presente che è importante aggiungere le soluzioni preriscaldate alla temperatura del lavaggio corrispondente.

Si sostituisce la miscela di ibridazione contenente la sonda con 1ml di soluzione composta al 50% da miscela di ibridazione e per l’altro 50% da 2XSSC/0.1X CHAPS preriscaldato a 37°C, per 10 minuti a temperatura ambiente in

agitazione verticale; seguono due lavaggi da 30 minuti a 37°C con 2X SSC/0,1X CHAPS.

Dopodichè vengono effettuati altri due lavaggi sempre da 30 minuti ciascuno a 60°C con 0.2X SSC/0.1X CHAPS, preriscaldato. Prima di iniziare la procedura di incubazione con anticorpo, si lava 5 minuti a T ambiente, in agitazione verticale, con TBSX.

Segue una preincubazione di 2 ore a 4°C in agitazione orizzontale, in “blocking buffer”. Si incuba poi per 4 ore a T ambiente o a 4°C O/N con anticorpo anti-dig diluito in “blocking buffer” preincubato, precedentemente, anch’esso 2 ore a 4 °C. Il “blocking buffer” è una soluzione di TBSX + reagente bloccante 2% + siero di pecora 15%+ estratto di uova 5%; (l’utilizzo dell’ estratto di uova riduce il segnale aspecifico).

Per rimuovere l’eccesso di anticorpo si procede con 5 lavaggi a temperatura ambiente di 1 ora ciascuno, di cui uno da effettuarsi a 4°C O/N con TBSX.

Seguono quindi 2 lavaggi di 5 minuti a temperatura ambiente con il tampone per la fosfatasi alcalina (“AP buffer”) a cui si aggiunge levamisol (inibitore delle fosfatasi endogene).

A questo punto si aggiunge la soluzione di rivelazione più opportuna, in questo lavoro di tesi il substrato della fosfatasi alcalina utilizzato è il “BM-purple” che si trova in forma liquida pronta per l’utilizzo e porta ad una colorazione blu intenso. La fosfatasi alcalina coniugata con l’anticorpo scinde il substrato cromogenico (“BM purple”) generando il prodotto colorato che rende possibile evidenziare la zone in cui la sonda si è ibridata e dove il gene in esame si è espresso. Si usano 0.5-1ml per “vial” a T ambiente fino a quando la colorazione non è soddisfacente (da 1 ora a 7 giorni). La reazione deve avvenire al buio così i tubi devono essere coperti da un foglio di alluminio.

Una volta che la reazione cromogenica è terminata si rimuove il tampone per la fosfatasi alcalina e si fissano gli embrioni per almeno 1 ora con MEMFA (oppure o/n a 4°C) per stabilizzare la colorazione. Gli embrioni così fissati possono essere conservati in metanolo a -20°C

Soluzioni: PBS (per 1 litro) NaCl 80g KCl 2g Na2HPO4 15.56g KH2PO4 2 g TBS (per 1 litro) NaCl 80 g KCl 2 g Tris base 30 g PBTw PBS 1X Tween-20 0.1% TBSX TBS 1X Triton X-100 0.1% Soluzione di paraformaldeide

Si può preparare uno “stock” di paraformaldeide al 20% da conservare in frigorifero a 4°C per diversi mesi. Si scioglie la paraformaldeide in acqua RF ad una temperatura di 60°C e si chiarifica aggiungendo 10µl di NaOH 10N in 100ml di paraformaldeide. Quando la soluzione è diventata limpida si lascia raffreddare, si porta a volume con acqua distillata e si filtra con carta 3 MM. Al momento dell’uso si diluisce la paraformaldeide così preparata con PBS 1X.

Tampone di ibridazione:

Formammide 50%

RNA di Torula 1mg/ml Eparina 100µg/ml Denhart’s 1X Tween-20 0.1% CHAPS 0.1%EDTA10mM AP buffer Tris 100 mM ph 9.5 MgCl2 50 mM NaCl 100 mM Tween 20 0.1% Levamisol 2mM

2.5.3 Preparazione della sonda per gli esperimenti di “whole

mount”

Le sonde utilizzate nell’ibridazione in situ ”whole mount” sono marcate con digossigenina (DIG). Per la sintesi della sonda si linearizza il plasmide tagliandolo con enzimi di restrizione in corrispondenza dell’ estremità 5’.

Dopo purificazione, il DNA linearizzato viene utilizzato come stampo in una reazione di trascrizione in vitro con la RNA polimerasi che riconosce il promotore posto al 3’ del frammento in modo da ottenere un probe antisenso. Gli enzimi necessari per preparare la sonda possono essere: SP6, T7, T3 RNA. La marcatura con digossigenina deriva dal fatto che la miscela di nucleotidi contiene un UTP ribonucleotide in posizione 11 con digossigenina. Alternativamente l’UTP- ribonucleotide può essere sostituito, in posizione 12, con una molecola di fluoresceina.

Anche se il segnale dato dalla marcatura con fluoresceina è assai più debole rispetto a quello dato dalla stessa sonda marcata con digossigenina.

4 µl Tampone di reazione 5X

2 µl DTT 100mM

1 µl DNA linearizzato 1µg/µl 1 µl Rnase Inhibitor (20 UE/µl) 2 µl RNA polimerasi

2 µl miscela di nucleotidi contenente DIG-UTP 2.5 mM (o fluoresceina-UTP 2.5 mM)

x µl H2O RF per un volume finale di 20 µl

La miscela viene incubata per 2 ore a 37°C; per eliminare il DNA si aggiungono poi 2µl di DNasi I (1 mg/ml),si incuba poi per almeno 15 minuti sempre a 37°C. L’intera reazione viene bloccata aggiungendo EDTA 0.5 M pH 8.0 RF. Si effettua quindi una precipitazione alcolica aggiungendo 1/10 del volume di NH4Acetato 5M sterile e 1 volume di Isopropanolo sterile, mescolando bene e

mettendo il tubo a -20°C per 40 minuti.

Successivamente si centrifuga per 15 minuti a 12000 rpm a 4°C, si lava con etanolo al 70% sterile e si centrifuga di nuovo sempre a 12000 rpm e a 4°C. Quando l’EtOH è evaporato il pellet viene risospeso in 22µl di H2O RF o in TE

pH 7.5 RF e conservato a -20°C. La stima della quantità del DNA ottenuto viene effettuata su gel di agarosio, utilizzando come confronto tRNA a concentrazione nota, come marcatori di quantità. I trascritti possono essere conservati in “stocks” 10X nella miscela di ibridazione.

2.5.4 Preparazione dell’ “Egg extract”

Durante la procedura di ibridazione “whole mount” per ridurre il segnale aspecifico è consigliato pre-trattare sia l’anticorpo, che è policlonale, che gli embrioni, con una soluzione contenente un estratto di uova.

Si raccolgono uova in “eppendorfs” e, dopo aver eliminato quanto più liquido possibile, le congeliamo conservandole a – 20°C.

Per preparare l’“egg extract” si omogeneizzano le uova in un volume minimo di PBS e si centrifugano a 13000 rpm per 10 minuti recuperando la fase

intermedia. La stessa operazione viene ripetuta 5 volte. Il liquido così ottenuto viene posto per 15 minuti a 56°C per inattivare le proteine in esso contenute e quindi conservato a -20°C.

Si potrebbe anche utilizzare una soluzione contenente un omogenato di embrioni anziché l’estratto di uova: gli embrioni vengono raccolti a vari stadi di sviluppo, omogenati e centrifugati più volte recuperando sempre la fase trasparente. Il liquido viene inattivato sempre 15 minuti ma a 65°C e conservato a -20°C

2.5.5 Depigmentazione (“bleaching”)

La depigmentazione è una tecnica che si utilizza per distinguere meglio la marcatura, e che consiste nel depigmentare gli embrioni con perdita minima di segnale.

A questo scopo è necessario lavare gli embrioni per minuti con MtOH 100% segue un lavaggio di 5 minuti con MtOH 70% e infine si lava con una soluzione composta al 50% da MtOH 100% e 50% con SSC 1X.

Si passano quindi gli embrioni nella soluzione depigmentante, contenente SSC 0.5X, H2O21%, Formammide 5%, lasciando i tubi sull’agitatore e sotto una

lampada fluorescente per circa 1-2 ore. Dopo questo tempo gli embrioni dovrebbero essere sufficientemente depigmentati. A questo punto gli embrioni vengono lavati per 5 minuti con MtOH 70% e poi trasferiti in MtOH assoluto a -20°C.

2.5.6 Inclusione degli embrioni in paraffina

Per arrivare ad una migliore comprensione del “pattern” d’espressione di un gene, negli embrioni ibridati per “whole mount”, si può effettuare l’inclusione in paraffina di tali embrioni e successivamente sezionarli al microtomo.

Si mettono 4-5 embrioni in “vials” grandi (8ml) contenenti metanolo assoluto, si aggiunge un ugual volume di xilolo 100% in modo tale da ottenere una soluzione composta al 50% da metanolo e al 50% da xilolo, si lascia sulla bascula per 10 minuti a RT.

Si sostituisce poi questa soluzione con una contenente 25% metanolo e 75% xilolo, di nuovo 10 minuti sulla bascula a RT. Si passano poi gli embrioni due volte in xilolo 100% e infine con lo xilolo vengono versati in un “becker” e messi a 60°C per 15-20 minuti.

Dopo che è trascorso questo tempo si aggiunge un ugual volume di paraffina liquida, filtrata con carta 3MM, e si tiene nuovamente il “becker” a 60°C per 45 minuti. Si sostituisce quest’ultima soluzione con 20 ml di altra paraffina in cui gli embrioni restano a 60°C per 20 minuti.

Sostituiamo i 20 ml di paraffina con altri 20 ml di paraffina, lasciando sempre a 60°C per 4-5 ore oppure O/N. Poi si passano gli embrioni in 30ml di paraffina pulita per 20 minuti; quindi con un movimento rapido, si versano embrioni e paraffina in una piastra Petri riscaldata a 60°C, distanziandoli il più possibile con un ago passato sulla fiamma.

Si lascia poi raffreddare la paraffina nella piastra a temperatura ambiente. Spesso è opportuno avere uno strato di paraffina raffreddato nella Petri precedentemente e su questo versare gli embrioni e la paraffina. La Petri viene poi lasciata a 4°C per almeno 4 ore.

2.5.7 Sezioni di embrioni

Per ottenere sezioni dagli embrioni inclusi si taglia, con una lama passata alla fiamma, un blocchetto di paraffina contenente un solo embrione.

Si monta il blocchetto di paraffina su un supporto di legno che viene così fissato al microtomo Reichert-Jung. Con il microtomo vengono tagliate sezioni spesse 12-20µm, in questo lavoro le sezioni fatte avevano uno spessore di 15µm; queste vengono stese su qualche goccia di EtOH al 10% poste su vetrini SUPERFROST/PLUS, appoggiati su una piastra scaldante a 40°C. Una volta

che la maggior parte del liquido sui vetrini è evaporato, essi vengono messi in stufa a 37°C oppure lasciati sulla piastra O/N.

Le soluzioni verranno poi deparaffinate con due passaggi in xilolo di 5 minuti e montate con vetrini coprioggetto tramite il montante EUKITT.

2.5.8 Fotografie

Le fotografie degli embrioni interi sono state realizzate mediante una fotocamera digitale Roper Coolsnap CF montata in asse focale ad uno stereoscopio Nikon SNZ 1500 con l’ausilio di una coppia di fibre ottiche Glli/136P.

Il trattamento delle immagini è stato realizzato con l’ausilio del Software Adobe Photoshop CS. Inoltre le fotografie delle sezioni istologiche sono state acquisite mediante una telecamera digitale (Coolsnap Photometrics) attraverso un sistema microscopio integrato Nikon Eclipse 600. Successivamente le immagini sono state trattate mediante il programma di elaborazione fotografica Adobe Photoshop CS.

2.6 Microiniezione di embrioni di Xenopus laevis

Per gli esperimenti di microiniezione sono stati utilizzati embrioni pigmentati, in cui è possibile distinguere, allo stadio di 4-8 cellule, il polo animale da quello vegetativo e i blastomeri dorsali da quelli ventrali. Al momento della microiniezione, gli embrioni degellificati, vengono trasferiti in una piccola piastra Petri, sul fondo della quale è fissata una reticella di plastica, con maglie di circa 1mm, al fine di limitarne gli spostamenti durante la microiniezione.

Gli embrioni sono immersi in una soluzione di Ficoll al 4% (peso/volume ) sciolto in 0.1X MMR. Il Ficoll è piuttosto viscoso e permette agli embrioni di mantenere la forma sferica durante la fase di iniezione, limitando, inoltre, la perdita di citoplasma dal sito dell’ iniezione.

Gli embrioni microiniettati sono lasciati sviluppare in 0.1X MMR-4% Ficoll nelle prime ore dopo l’iniezione e poi trasferiti in 0.1X MMR.

Quando gli embrioni di controllo raggiungono lo stadio desiderato, si fissano controlli ed iniettati e si conservano in MtOH oppure in EtOH assoluto a – 20°C. Le microiniezioni sono state eseguite con un microiniettore “Drummond Nanoject”, che consente l’iniezione di volumi tra 4.6nl e 73.6nl ad incrementi discreti. L’iniettore è dotato di un micromanipolatore che ne permette lo spostamento macrometrico nelle tre dimensioni e di un movimento micrometrico controllato idraulicamente lungo una direzione predefinita.

Gli aghi tirati sono preparati per tiratura da capillari forniti da “Drummond”. Prima di essere montato sul microiniettore, l’ago deve essere riempito di olio minerale. Il caricamento dell’RNA da microiniettare è eseguito dal microiniettore stesso. In generale, vengono caricati nell’ ago 2.0-3µl di soluzioni

2.6.1 Sintesi in vitro dei trascritti da microiniettare (Melton et

al., 1985)

I trascritti da microiniettare devono contenere sequenze che ne aumentano la stabilità, sia l’efficienza di traduzione all’interno della cellula.

Per questo si inserisce il cDNA dei geni da iniettare all’interno dei plasmidi che contengono elementi stabilizzanti l’RNA. Inoltre per aumentare l’efficienza di traduzione, si aggiunge alla miscela di trascrizione una “terminal cap structure“ (“cap”) all’estremità 5’.

In questo modo si possono ottenere trascritti stabili, in grado di sopravvivere all’interno della cellula. Il “cap”, tipico di molti RNA cellulari, consiste di una 7-metil-guanosina 5’ trifosfato, che si lega mediante un ponte fosfodiesterico 5’-5’ all’RNA trascritto in vitro, rallentandone la degradazione in ambiente cellulare. Per ottenere trascritti forniti di “cap” è sufficiente far avvenire la reazione di trascrizione in presenza di una concentrazione di GTP pari a 1/10 di quella del “cap”, la cui concentrazione eguaglia quella di ATP, UTP e CTP.

I templati vengono di norma preparati digerendo 5-10µg di DNA plasmidico, usando un sito di restrizione a valle del sito di poliadenilazione virale. La reazione di trascrizione viene generalmente condotta in 50µl.

Esempio:

DNA linearizzato 1-2 µg Tampone per trascrizione 5 X 10µl

DTT 0.1 M 5µl ATP 10mM 2.5µl CTP 10mM 2.5µl UTP 10mM 2.5µl GTP10 mM 2.5µl “cap” 10mM 2.5µl RNA-polimerasi 2µl (50-100UE) Rnase-Inhibitor 1µl (20UE) H2O RF fino a 5

La reazione procede a 37°C per 2 ore, trascorse le quali, si idrolizza il DNA stampo aggiungendo 1-2µl di DNAsi I RF e, incubando, sempre a 37°C, per 15 minuti.

Il trascritto viene estratto con fenolo-cloroformio a pH7.5 e precipitato in 2.5V di etanolo assoluto più 0.1V di CH3COONa 2.5 -3M a pH5.2.

La concentrazione viene stimata su gel, confrontando un’aliquota con tRNA a concentrazione nota

2.7 Reazione cromogenica per la β-galattosidasi

Nella maggior parte degli esperimenti di microiniezione, insieme al trascritto di interesse abbiamo iniettato il messaggero per la β-galattosidasi.

Questo metodo ci permette di individuare facilmente il lato iniettato da quello di controllo attraverso la reazione catalizzata dall’enzima, il cui prodotto è colorato. Esistono diversi substrati per la β-galattosidasi, ad esempio il Salmon-gal che

viene convertito in un prodotto di colorato rosato e l’X-gal, che viene convertito invece in un prodotto di colore celeste.

Quando gli embrioni iniettati hanno raggiunto lo stadio desiderato, vengono fissati in MEMFA per circa 30 minuti. Dopo due lavaggi da 5 minuti ciascuno in PBS1X, vengono incubati nella soluzione contenente Salmon–gal a 37°C fino a quando non sono sufficientemente colorati.

E’ importante controllare spesso la reazione di colorazione poiché la durata di questa fase è variabile (da 15 minuti a 1 ora).

Per interrompere la reazione cromogenica, si effettuano due lavaggi da 5 minuti ciascuno in PBS 1X e infine, si fissano nuovamente in MEMFA per 30 minuti e si disidratano con brevi passaggi in soluzioni a concentrazione crescente di etanolo (EtOH), o metanolo (MetOH)

Gli embrioni in EtOH (o MetOH) 100% possono essere conservati a -20°C oppure utilizzati per l’ibridazione in situ “whole mount”.

Soluzioni: β-gal solution (10 ml) C6FeK3N6 32.93gr C6FeK4N63H20 32.93gr Salmon-gal 100µl PBS 1X fino a volume

2.8 Crescita degli embrioni di Xenopus laevis in

condizioni cicliche di luce

L’utilizzo di questa tecnica si è resa necessaria per lo studio dei ritmi circadiani.

Embrioni di Xenopus laevis allo stadio di blastula sono stati fatti crescere, all’interno di piastre Petri, in una soluzione contenente MMR 0.1X, in una

condizione artificiale di illuminazione. La luce è stata fornita da una lampada a fluorescenza bianca 18 W, posta ad una distanza di 35 cm dagli embrioni, la cui accensione era sotto il controllo di un “timer”, programmato in maniera tale da garantire cicli esatti di illuminazione di 12 ore luce/12 ore buio.

Al fine di rendere minima la variabilità dovuta all’utilizzo di “batches” differenti di uova, per ogni esperimento sono stati utilizzati embrioni provenienti da un’unica fecondazione. Quando gli embrioni raggiungevano lo stadio desiderato, venivano fissati in MEMFA 1X per circa 30 minuti. Trascorso questo tempo si sostituiva questa soluzione con una costituita da PBS 1X.

A questo punto si è proceduto con il prelievo dei cervelli la cui dissezione è stata effettuata con l’utilizzo di pinzette “Dumond” n°5.

I cervelli sono stati successivamente sottoposti ad una ulteriore fissazione in

MEMFA 1X per 30 minuti, dopodichè sono stati disidratati in MetOH 100%. In questa soluzione possono essere conservati a -20°C fino al loro utilizzo per

l’ibridazione in situ “whole mount”.

2.9 Cloni

• pCS2+-Xbsx

Questo plasmide è stato utilizzato per sovraesprimere Xbsx in saggi di sovraespressione. Il clone contiene la regione codificante del gene (693 nt). Per la trascrizione del senso è necessario linearizzare con XhoI e trascrivere con SP6.

• pBluescript (+/-)-Xbsx

Xbsx inserito all’interno di questo plasmide è stato utilizzato per la sintesi di sonde utilizzate per ibridazioni in situ.

Per la trascrizione è necessario linearizzare con l’enzima HindIII e successivamente trascrivere con la polimerasi T3.

• pBluescript (-/+)-Xotx5b

Plasmide contenente un frammento di1600bp del gene Xotx5b clonato nei siti Not1/EcoRІ.

Per la trascrizione dell’RNA antisenso è necessario prima linearizzare con Not І e poi trascrivere con T7.

• pCS2+

-Xotx5b

La regione codificante di Xotx5b, di dimensioni pari a 930bp è stata clonata nel sito di Stu1 di pCS2+.

Per trascrivere l’RNA si linearizza con Not І e si trascrive con SP6. • pCS2+-Xrx1

Xrx1 è stato clonato in questo plasmide attraverso l’utilizzo di EcoR І/Xho І. L’RNA che si ottiene trascrivendo con SP6 è un RNA senso utilizzato per esperimenti di sovraespressione genica.

• pGEM3 3.2/4

Il clone 3.2/4 è stato ottenuto clonando l’intero cDNA (1485bp) di Xrx1 nel sito EcorІ di pGEM3. Si linearizza con BamHІ e si trascrive con T7 per RNA “antisenso”.

In questo lavoro è stato utilizzato per esperimenti di “whole-mount”.

• pSP353T-Xnot2

Xnot2, inserito all’interno di questo plasmide, è stato utilizzato per la sintesi di mRNA da microiniettare.

Per la trascrizione è necessario prima linearizzare con EcoRІ e poi trascrivere con SP6.

• pBluescript (-/+)-Xnot2

Xnot2 è stato inserito all’interno di questo plasmide per la sintesi di RNA antisenso, da utilizzare negli esperimenti di ibridazione.

Per la trascrizione si linearizza con l’enzima EcorІ e si trascrive con la polimerasi la polimerasi T7.

• pBluescript SK (-/+)-chordin

Il cDNA parziale di Xenopus chordin è stato clonato in questo plasmide tramite l’utilizzo di EcoRІ e XhoІ.

Per ottenere l’RNA antisenso da utilizzare in protocolli di ibridazione in situ, utilizzare l’enzima di restrizione EcoRІ e trascrivere con la Polimerasi T7.

• pCMV-SPORT6ccdb-Aanat

Il cDNA di Aanat, della lunghezza di 904bp è stato inserito in questo plasmide utilizzando i siti di restrizione EcoRІ/NotІ.

Per trascrivere, ed ottenere l’RNA antisenso, si linearizza con EcorV e si trascrive con T7

• pCMV-SPORT6ccdb-Irbp

Il cDNA di Irbp è stato clonato all’interno di questo plasmide attraverso l’utilizzo degli enzimi di restrizione EcoRV eNotІ. Per ottenere l’RNA antisenso si linearizza il DNA con EcoRV e si trascrive con la Polimerasi T7.