SCOPO

I reflui urbani contengono una grande varietà di microrganismi patogeni, escreti con le feci di persone infette. Tuttavia, i trattamenti a cui sono sottoposti non risultano particolarmente efficaci nell’abbattere la carica virale (Carducci et al., 2008). Di conseguenza risulta fondamentale il controllo della qualità igienica dei reflui, con lo scopo di prevenire la diffusione dei patogeni presenti nell’ambiente. Si rende inoltre necessario monitorare il rischio di trasmissione di malattie infettive sia per chi opera direttamente nel settore, sia per tutti quelli che, direttamente o indirettamente, vengono a contatto con tali matrici. Tuttavia i costi, la complessità del monitoraggio e la mancanza di metodiche di ricerca innovative e standardizzate ne hanno limitato l’applicazione.

I parametri di qualità per le acque trattate prevedono il controllo dei parametri chimico-fisici e la ricerca di organismi indicatori, noti per la loro inaffidabilità, mediante tecniche colturali, che richiedono risorse considerevoli in termini di tempo e di lavoro. In numerosi studi è evidenziata, per la valutazione della presenza di patogeni in acque reflue, l’elevata efficienza della Real Time PCR, in quanto più sensibile e rapida rispetto alle metodiche tradizionali. Una metodica alternativa e innovativa per la ricerca dei patogeni nei reflui è la piattaforma DNA microarray, in quanto altamente specifica e capace di determinare la presenza contemporanea di più target. Tuttavia questa metodica è caratterizzata da una bassa sensibilità. Questa sensibilità è ulteriormente influenzata dalla presenza nel campione, a causa della sua natura, d’inibitori che causano sottostima o falsi negativi. Tuttavia nei liquami, considerata l’alta concentrazione dei patogeni enterici, è possibile ipotizzarne l’uso. L’applicazione di metodi quali Real Time PCR e microarray su campioni artificialmente contaminati ha indicato la necessità di aumentare la purificazione del campione per migliorare la resa della PCR e, contemporaneamente, di aumentare la concentrazione del campione per ottimizzare la risposta del microarray. Viste tali premesse si può ritenere che lo sviluppo e la validazione di tecniche innovative, che tengano conto della natura del campione, rappresentino una necessità per il monitoraggio della qualità dei reflui. Su queste basi si fonda lo scopo della mia tesi, che si prefigge di validare dei protocolli Real Time PCR e ottimizzare la risposta di una piattaforma microarray, adatti ad analisi microbiologiche multi specie di campioni di liquami urbani provenienti da depuratori di acque reflue. In questo lavoro di tesi è stato, in una prima fase, definito un protocollo per concentrare e aumentare la purificazione di campioni artificialmente contaminati mediante ultracentrifuga. Successivamente, i protocolli messi a punto sono stati applicati a campioni di liquami, prelevati con cadenza mensile per un anno all’ingresso di un depuratore. Questa seconda fase ha previsto una concentrazione del campione mediante ultrafiltrazione a flusso tangenziale, seguita da ultracentrifugazione ed estrazione degli acidi nucleici. Gli acidi nucleici così ottenuti sono stati analizzati tramite qPCR e piattaforma Microarray. Successivamente si è valutata la positività/negatività della suddetta piattaforma con i dati ottenuti tramite qPCR. Poiché i metodi molecolari non permettono di discriminare tra particelle infettive e non, si è deciso di valutare il livello d’infettività su coltura cellulare di un target che è risultato positivo in tutti i campioni analizzati (Human Adenovirus), in prospettiva di una futura applicazione di questo microarray per la valutazione del rischio biologico.