68
RISULTATI
69 3.1 Protocollo di corticalizzazione
Quando messe in coltura, le cellule in via di differenziamento, producono in modo autocrino numerose molecole morfogeniche, di cui le maggiormente espresse risultano essere BMP and Wnt (Bertacchi, et al., dati non pubblicati). È noto in letteratura che l’inibizione della via di trasduzione del segnale di BMP, tramite l’uso di molecole endogene come Noggin, o di sintesi come la Dorsomorfina, favorisce il differenziamento delle cellule staminali embrionali verso il loro destino di default, ovvero quello di cellule neurali anteriori (Bertacchi, et al., 2013). Proseguendo i risultati di questo lavoro sono andato ad indagare quale fosse il ruolo dell’inibizione di un altro dei morfogeni autocrini prodotti dalle cellule, Wnt, cercando di avvalorare ulteriormente l’ipotesi che le cellule staminali embrionali di topo, in assenza di qualunque segnale istruttivo, differenziano in neuroectoderma ed in seguito in cellule neuronali antero-dorsali, cioè in corteccia cerebrale.
Il piano sperimentale è stato impostato andando a trattare in parallelo diverse colture, inibendo solamente la via di BMP (Bi), solamente la via di Wnt (Wi) o entrambe le vie (WiBi), durante lo step2 del protocollo di coltura. In questo passaggio è presente un’alta percentuale di precursori neurali (90%) e si possono osservare gli effetti maggiori delle molecole inibitorie. L’analisi delle cellule così prodotte è stata fatta in varie finestre
Figura 3.1 - Protocollo di corticalizzazione. Composto da 3 step fondamentali della durata complessiva di 10 giorni.
Per permettere la maturazione dei neuroni tardivi, lo step 3 è prolungabile fino al giorno 18 e oltre senza necessità di splitting. Per le analisi sul ciclo cellulare è stato aggiunta una tripsinizzazione al termine del giorno 10, al fine di mantenere la coltura a bassa densità, introducendo quindi uno step 4 al protocollo. I trattamenti vengono applicati dal
secondo giorno di step 2 fino al termine dello stesso.
70 temporali, inizialmente dal punto di vista trascrizionale, mediante RT-PCR, ed in seguito dal punto di vista dei prodotti proteici (quindi con esperimenti di immunocitochimica su cellule in adesione).
Durante il mio lavoro ho usato cellule staminali embrionali di topo della linea cellulare E14Tg2A passaggio 35-39. Una prima fase di differenziamento avviene in sospensione su piastre ricoperte di agarosio e contenenti mezzo minimo N2B27 (vedi Materiali e Metodi), così da impedire l’adesione sul fondo della piastra e permettere la formazione dei corpi embrioidi (step1). Vengono seminate 1,3/1,5 milioni di cellule staminali embrionali e mantenute in sospensione per un totale di due giorni, a formare corpi embrioidi. In seguito, i corpi embrioidi vengono raccolti, tripsinizzati e riseminati in piastre di plastica, dove le cellule sono selezionate con un rivestimento proteico selettivo di poliornitina e laminina presente sulle piastre dello step2.
Le cellule dei corpi embrioidi vengono seminate in piastre 24-well per un totale di 150k cellule per pozzetto. Questo secondo passaggio, step2, ha durata complessiva di quattro giorni, ovvero dal terzo al sesto giorno di protocollo, durante il quale le cellule stanno in adesione sul “coating” di poliornitina e laminina e crescono in mezzo minimo N2B27, addizionato con le opportune molecole inibitrici da analizzare.
L’applicazione delle molecole avviene dal quarto giorno di coltura (secondo giorno dello step2) per una durata totale di tre giorni (fino alla fine dello step2, giorno 6). La Dorsomofina 5µM (Sigma) è stata utilizzata per bloccare la segnalazione di BMP (BMP inhibition, Bi), mentre IWR-1-Endo 10µM (Calbiochem), un antagonista di Wnt, è la molecola inibitrice della via di Wnt (WNT inhibition, Wi). Lo stock di Dorsomorfina consiste in una sospensione 5 mM in DMSO, mentre lo stock di IWR-1-endo è una sospensione 10 mM, sempre in DMSO. Tuttavia le cellule in presenza di alte concentrazioni di IWR-1-Endo sembrano non sopravvivere o comunque risultano fortemente rallentate. Per ovviare a questo problema durante il quarto giorno di protocollo, per ciascun trattamento, ho dimezzato le concentrazioni di inibitori , ovvero 2,5µM di Bi (inibitore di BMP) e 5µM di Wi (inibitore di Wnt), tornando poi alla concentrazione normale dal giorno seguente.
71 Al termine dei quattro giorni di step2 le cellule vengono nuovamente tripsinizzate, contate e riseminate mettendone 1,8x105 per pozzetto. I pozzetti anche questa volta hanno un rivestimento di poliornitina/laminina. Per ridurre lo stress subito dalle cellule in questo passaggio il mezzo di coltura durante il primo giorno rimane l’N2B27 così come nello step precedente, senza addizionarlo con le molecole inibitorie. Dal giorno successivo, giorno 8 di coltura, vengono invece cresciute in mezzo minimo N2, così da poter favorire ulteriormente il differenziamento. Nei miei esperimenti questo passaggio può variare da un minimo di quattro giorni (fino al giorno 10) ad un massimo di dodici (giorno 18). Tuttavia quando la coltura supera il decimo giorno, al fine di promuovere la sopravvivenza cellulare nella coltura a lungo termine, il mezzo utilizzato è nuovamente l’N2B27, molto ricco in fattori anti-apoptotici.
3.2 Analisi dei marcatori corticali in seguito alle inibizioni di Wnt e BMP
Una prima analisi preliminare che ho condotto è stata su un set di marcatori dell’asse antero-posteriore, i cui mRNA sono stati quantificati per RT-PCR. I marcatori scelti permettono di coprire l’intera regione anteriore del
sistema nervoso, in particolare sono stati analizzati marcatori delle regioni più rostrali (FoxG1 e Emx2), dell’intero prosencefalo (Six3), del prosencefalo/mesencefalo (Otx2) e del mesencefalo (En1 e Irx3). La finestra temporale scelta per questa prima analisi ricade al termine dello step2, fase del differenziamento ancora molto precoce.
L’obiettivo è di osservare come varia la loro espressione nel breve termine in risposta ai trattamenti e vedere se essi mostrano qualche omologia con i pattern di espressione genica ritrovati in un embrione.
Figura 3.2 - Marcatori del patterning A/P.
Fb: prosencefalo. Mb: mesencefalo. Hb:
romboencefalo. Sc: midollo spinale (Bertacchi, et al., 2013).
72 Le cellule sono state raccolte al sesto giorno del protocollo ed il loro mRNA è stato estratto e retrotrascritto. Oltre alle colture trattate ho portato avanti anche una coltura di controllo cresciuta in N2B27 addizionato con DMSO, il solvente in cui sono stati disciolti gli inibitori, come controllo. Durante tutti gli esperimenti la concentrazione di DMSO in un mezzo non è mai stata portata al di sopra dello 0,1%, in quanto è noto in letteratura che questa molecola ha effetti sull’induzione cardiaca (Li, et al., 2012). Confrontando l’espressione dei marcatori anteriori (FoxG1, Six3 e Emx2) e dei marcatori del cervello medio e posteriore (En1, Irx3 e Otx2) in campioni Bi e Wi con i livelli di espressione degli stessi marcatori del controllo, è possibile notare come entrambe le inibizioni spingano il differenziamento dei precursori neurali in senso anteriore.
Il grafico in Figura 3.3 mostra i valori di espressione dei geni normalizzati sul loro valore di espressione nel campione di controllo. Seguendo l’indice di colore delle colonne dell’istogramma si osserva un aumento notevole dei marcatori anteriori (colori freddi) rispetto ai marcatori dorsali più posteriori (colori caldi) per entrambi i trattamenti, tuttavia Wi ha un effetto molto più marcato. In questo campione infatti si ha un aumento di 5 volte rispetto al controllo di Emx2, di 8 volte per FoxG1 e di 19 volte per Six3.
Figura 3.3 - Analisi di RT-PCR di marcatori corticali a fine Step 2. CDMM: mezzo chimicamente definito di controllo. Bi: inibitore di BMP. Wi: inibitore di Wnt. Sull’asse delle ordinate è riportato il livello di espressione dei geni
rapportato al loro valore espresso nella coltura di controllo (CDMM). * = p<0,05 ; ** = p<0,01
**
* *
* *
**
**
Day 2 Day 6
Step 2 Step 3
Step 1
: Wi : Bi
Wi Bi
CDMM
En1 Irx3 Otx2 FoxG1 Six3 Emx2
73 Un secondo set di esperimenti è stato impostato col fine di indagare cosa avviene alle colture trattate ad una finestra temporale più tardiva, ovvero al decimo giorno di coltura, quando la maggior parte delle cellule sono neuralizzate. Le cellule sono state quindi coltivate fino al termine dello step3 e analizzate ancora una volta dal punto di vista della trascrizione di marcatori A/P.
Oltre ai campioni singoli inibiti ho introdotto nell’esperimento un campione a cui viene dato un mezzo contenente entrambe le molecole inibitrici, Dorsomorfina 5 µM e IWR-1- endo 10 µM. In questo tipo di trattamento doppio è particolarmente importante applicare una dose dimezzata di inibitori il primo giorno della loro applicazione (durante il giorno 4), al fine di evitare il blocco e la morte dell’intera coltura.
In Figura 3.5 è riportato un grafico in cui si vedono i livelli di espressione degli stessi marcatori analizzati a step2 con l’aggiunta di ulteriori marcatori di neuroni della corteccia cerebrale, CamKIIa, Tbr1 e Ctip2, così da avere una visione più ampia di cosa accade alla coltura. Un particolare interesse ricade sulla coppia di geni Tbr1/Ctip2 in quanto essi sono marcatori specifici rispettivamente degli strati interni della corteccia cerebrale e degli strati intermedi. Il grafico mostra il valore d’espressione di ogni gene rapportato al valore massimo che esso presenta fra tutti i trattamenti. Come si vede da questi risultati i geni posteriori hanno la massima espressione nel controllo coltivato in “Chemically Defined Minimal Medium” (CDMM), in cui è presente solamente DMSO.
Figura 3.4 - Piano sperimentale per l’analisi degli effetti delle inibizioni d BMP e Wnt nel differenziamento neuronale. Le colture cellulari sono state coltivate per un totale di 10 giorni in presenza di un inibitore di Wnt (Wi), di
un inibitore di BMP (Bi) o in presenza di entrambi gli inibitori (WiBi).
: Bi : Wi : WiBi
Step3 Step2
Step1
Day 2 Day 6 Day 10
74 Tutti i trattamenti presentano un aumento dei marcatori più anteriori, ma è interessante notare come il valore massimo di questi marcatori si presenti nel campione doppio inibito (per 4 marcatori du 6: Tbr1, FoxG1, CamKIIa, Ctip2). I restanti 2 geni anteriori (Emx2 e Six3) hanno espressione massima laddove viene inibito solamente Wnt, ma il loro livello in Bi e Wi è comunque alto, Emx2 raggiunge il 76% del valore massimo e Six3 l’84%.
I marcatori posteriori En1, Irx3 e Otx2 invece mantengono la linea di espressione osservata anche a step2, in cui si ha una forte diminuzione nel campione Bi, una diminuzione ancora maggiore in Wi, ma sorprendentemente nel campione doppio inibito En1 e Otx2 sono rispettivamente il 5% e l’8% del valore di controllo. Questo può suggerire una possibile interazione tra le due vie di trasduzione del segnale, BMP e Wnt (vedi il capitolo Conclusioni).
Figura 3.5 - Analisi mediante RT-PCR a fine step3 di marcatori corticali. CDMM: mezzo minimo chimicamente definito. Bi: inibizione di BMP. Wi: inibizione di Wnt. WiBi: inibizione doppia di BMP e Wnt. Sull’asse delle ordinate
è riportato il valore di espressione di ogni gene rapportato al suo valore massimo osservato. * = p<0,05 ; ** = p<0,01 ; *** = p<0,001
* *
* * * * * *
*
*
* * * * *
* * * * * *
CDMM Bi Wi WiBi
En1 Irx3 Otx2 Emx2 Tbr1 Six3 FoxG1 CamKII Ctip2
75 3.2.1 Le colture hanno memoria dei trattamenti applicati durante lo step2
Il protocollo di neuralizzazione che ho utilizzato permette di ottenere una popolazione di cellule neuronali che, come ho descritto nei paragrafi precedenti, esprimono i marcatori degli strati della corteccia cerebrale a livello di mRNA ed inoltre, come descriverò nel paragrafo successivo, a livello di prodotti proteici. Lavorando in vitro, i risultati osservati potrebbero però essere dovuti ad una forzatura temporanea del sistema di controllo intracellulare, causato dalle inibizioni, senza corrispondere ad un commitment definitivo dei precursori. In altre parole, i messaggeri osservati potrebbero declinare una volta terminato il trattamento inibitorio di BMP e WNT.
Di seguito è presentato un grafico che mostra cosa succede ai geni del patterning osservandoli in due finestre temporali successive, a quattro giorni di distanza l’una dall’altra (Figura 3.6), in particolare al decimo (step3) ed al quattordicesimo (step3+4) giorno di coltura.
La figura mostra i risultati di amplificazione per RT-PCR di un set di marcatori dell’asse antero-posteriore della corteccia. Anche per questa analisi ogni marcatore è stato normalizzato sul valore di espressione più alto che esso presenta fra tutti i campioni.
Figura 3.6 - Analisi mediante RT-PCR di marcatori corticali per il controllo del mantenimento temporale.
CDMM: mezzo minimo chimicamente definito. WiBi: inibizione doppia di Wnt e BMP. In ordinata è riportato il valore di espressione di ogni marcatore, rapportato al suo valore massimo osservato fra tutti i campioni.
En1 Otx2 Irx3 FoxG1 Six3 Emx2 Tbr1 Wnt7b
CDMM Step3 WiBi Step3 CDMM Step3+4 WiBi Step3+4
76 Ancora una volta si può seguire il codice di colore per avere un’idea della regionalizzazione dei neuroni presenti in piastra. I marcatori posteriori, contrassegnati da colori caldi (rosso-giallo), sono espressi nel controllo (CDMM) a fine step3, e rimangono accesi anche al giorno 14. Nei campioni doppio inibiti (abbreviati WiBi) invece la loro espressione rimane piuttosto bassa in entrambe le finestre di osservazione, solamente un 20% rispetto al controllo. I marcatori anteriori identificati dai colori freddi (celeste-verde) vengono espressi maggiormente al giorno 14 del campione doppio inibito, ma la loro espressione è notevolmente più alta rispetto al controllo anche al giorno 10. È interessante notare come i marcatori anteriori della corteccia al giorno 14 siano aumentati rispetto al loro valore nel giorno 10. Il fatto che essi non diminuiscano indica che la coltura ha memoria delle informazioni fornite durante lo step2 e poiché il valore aumenta, le cellule continuano il loro differenziamento con l’invecchiamento della coltura.
3.2.2 Immunocitorivelazione di marcatori corticali in colture WiBi
Per verificare la presenza di neuroni completamente differenziati, non è sufficiente un’analisi a livello di RNA messaggeri. Infatti le cellule potrebbero non tradurre mai queste sequenze in proteine. Per identificare neuroni differenziati terminalmente, ho eseguito delle analisi di immunocitochimica su monostrato, utilizzando dei marcatori corticali specifici di strati della corteccia diversi, così come descritti in letteratura (Gaspard N., et al., 2008). I marcatori scelti per la mia analisi sono Tbr1 e Ctip2, i quali vengono espressi in vivo rispettivamente negli strati profondi e intermedi. Per controllare la corretta neuralizzazione dei campioni, ed evitare falsi positivi, insieme ai suddetti marcatori ho eseguito una seconda marcatura con un anticorpo diretto contro l’N-tubulina acetilata, antigene pan-neurale, ottenendo così dei preparati di doppia immunocitochimica Ntub/Tbr1 e Ntub/Ctip2. Le cellule positive sono state poi contate ed i valori percentuali sono riportati in Figura (Figura 3.7).
77 Dal grafico si può osservare la comparsa di Tbr1 e Ctip2 al termine dello step3 (giorno 10).
Tbr1 è espresso da un maggior numero di cellule rispetto a Ctip2 in ognuno dei campioni.
Inoltre l’efficienza di induzione di neuroni corticali è maggiore in seguito all’inibizione della segnalazione di Wnt rispetto alla segnalazione di BMP. Ma il maggior numero di cellule marcate è osservabile nel campione con doppia inibizione, per entrambi i marcatori.
In questa coltura il numero di cellule Tbr1 positive raggiunge il 28%, contro solamente il 3% della coltura di controllo, mentre le cellule Ctip2 positive raggiunge il 15 % contro l’1% della coltura di controllo. La doppia inibizione sembra quindi la scelta migliore per un protocollo di differenziamento di cellule staminali embrionali di topo in neuroni della corteccia cerebrale. Gli esperimenti successivi sono stati fatti applicando solamente il protocollo con doppia inibizione WiBi affiancati da colture cellulari di controllo in mezzo minimo.
Tuttavia, l’espressione del marcatore Ctip2 in vivo è successiva all’espressione del marcatore Tbr1. Infatti Tbr1 viene espresso negli strati più profondi generati precocemente durante la corticogenesi. Gli strati intermedi si formano in un secondo momento, a cui si accompagna l’espressione di Ctip2. Gli strati più superficiali sono generati per ultimi, ed un marcatore che li identifica è Satb2.
Figura 3.7 - Analisi mediante immunocitochimica di marcatori corticali al termine dello step 3. CDMM: mezzo minimo chimicamente definito. Bi: inibizione di BMP. Wi: inibizione di Wnt. WiBi:
inibizione doppia di BMP e Wnt. Sull’asse delle ordinate è riportata il valore percentuale delle cellule marcate rispetto al totale dei nuclei presenti.
** **
*** ***
***
CDMM Bi Wi WiBi
CDMM Bi Wi WiBi
Ctip2 Tbr1
78 Quindi i bassi libelli di Ctip2 osservati al decimo giorno di protocollo potrebbero essere dovuti ad un osservazione delle colture in una finestra temporale che precede il picco di espressione di Ctip2, ma successivo al picco di espressione di Tbr1. Ho quindi ripetuto le marcature doppie Ntub/Tbr1 e Ntub/Ctip2 in una serie di finestre temporali distanti due giorni l’una dall’altra, cercando di identificare il profilo di espressione di questi marcatori nel tempo. Ho aggiunto inoltre alcuni pozzetti in cui la marcatura è stata fatta in doppio per Tbr1 e Satb2, così da rilevare anche la comparsa di neuroni tardivi. I risultati delle conte cellulari sono mostrati in Figura 3.8.
Questa serie di esperimenti è stata fatta utilizzando soltanto il trattamento con doppia inibizione WiBi, affiancato dal relativo controllo CDMM. Il numero di cellule Tbr1 positive si diluisce nei campioni più invecchiati, passando da un 28% al giorno 10 ad un 8% al giorno 18. Parallelamente l’espressione di Ctip2 passa da un 10% al giorno 10 fino ad un picco di 23% nei giorni 16 e 18 aumentando gradualmente. Infine il marcatore dei neuroni tardivi Satb2 non è presente nelle finestre temporali precoci ma compare in numero ridotto al giorno 14, per poi aumentare nel tempo ai giorni 16 e 18, raggiungendo un 9% di cellule positive.
Questi risultati dimostrano come l’eliminazione delle segnalazioni autocrine e paracrine di Wnt e BMP nelle fasi precoci del differenziamento, momento nel quale si ritrova il maggior numero di precursori neurali organizzati in rosette, permette di intraprendere la via del differenziamento neuronale in senso corticale anteriore, favorendo la comparsa dei marcatori corticali sia precoci che tardivi. Inoltre i marcatori degli strati della corteccia Tbr1, Ctip2 e Satb2 compaiono in finestre temporali diverse ed con una sequenza comparabile con la loro comparsa durante la corticogenesi degli embrioni di topo.
Figura 3.8 - Analisi mediante immunocitochimica di marcatori corticali tardivi. Le colture sono state fatte differenziare in presenza della doppia inibizione di Wnt e BMP durante lo step2, e analizzate a varie finestre temporali.
Sull’asse delle ordinate è riportato il valore percentuale delle cellule marcate sul totale dei nuclei marcati con il DAPI.
Step 3 Step 3+2 Step 3+4 Step 3+6 Step 3+8
Tbr1 Ctip2 Satb2
79 3.3 Modulazione del ciclo cellulare
Un’ulteriore serie di esperimenti che ho svolto, riguarda la modulazione della lunghezza del ciclo cellulare tramite l’uso di molecole chimiche che vanno ad interferire con la via di segnalazione di Sonic Hedgehog (Shh). Con questi trattamenti ho cercato di aumentare e diminuire la lunghezza del ciclo cellulare, così da andare ad interferire col normale
“timing” di sviluppo dei vari strati della corteccia in vitro. È noto infatti che Shh possiede funzioni mitogene anche in vivo, esso infatti stimola la proliferazione di diversi precursori neurali nella neocorteccia in via di sviluppo (Komada et al., 2008).
Le molecole utilizzate nel mio protocollo sono Smoothened Agonist (SAG, Santa Cruz Biotechnology) e Ciclopamina (Cyc, Sigma). Queste due molecole chimiche agiscono a livello di una proteina transmembrana lungo la via di trasduzione del segnale di Shh, chiamata Smoothened (Smo). Esse influenzano l’attività di Smo, in particolare la ciclopamina stabilizza la forma inattiva della proteina, mentre il SAG funziona da agonista attivandola (vedi Figura 3.9).
Sonic Hedgehog tuttavia ha moltissimi altri ruoli, oltre quello di modulatore del ciclo cellulare. Infatti esso è uno dei morfogeni più studiati ed ha un ruolo rilevante durante lo sviluppo della neocorteccia (Komada et al., 2008).
Figura 3.9 - Azione dei principali inibitori/attivatori della via di Shh. Il principale punto di azione degli inibitori di Shh, come la Ciclopamina, o degli attivatori, come il SAG, è la proteina transmemebrana Smothened (Smo) che si trova a valle del recettore di Shh, Patched (Ptch).
80 Il suo effetto ventralizzante infatti potrebbe andare ad interferire con l’efficienza di produzione di neuroni corticali dorsali, prodotti dal trattamento con gli inibitori di Wnt e BMP. Questo ha reso necessario l’apporto di alcuni accorgimenti e di controlli sperimentali, così da riuscire a modulare il ciclo cellulare, senza però andare ad influire sui sistemi morfogenetici attivati dal Shh.
Lo scopo ultimo di questa serie di esperimenti è dimostrare come sia possibile andare a interferire con la produzione di neuroni di strati diversi della corteccia cerebrale in vitro, modificando semplicemente la durata del loro ultimo ciclo cellulare prima del differenziamento, come è riportato in letteratura per i neuroni della retina di Xenopus (Decembrini S. , et al., 2009).
3.3.1 Effetto del SAG e Ciclopamina sul ciclo cellulare
Per prima cosa sono andato a cercare nel mio protocollo quale fosse la finestra temporale di azione efficace sul ciclo cellulare delle due molecole Sag e Cyc. Sag e Cyc, applicati durante lo step2, hanno rispettivamente un'azione ventralizzante e dorsalizzante; in particolare, SAG interferisce con il corretto differenziamento dei precursori in cellule della corteccia cerebrale (Bertacchi, et al., 2013). Per identificare una finestra temporale di trattamento che non interferisce con il patterning dorsoventrale ho coltivato in parallelo più campioni di cellule in via di differenziamento, e sono andato successivamente a trattare ognuno di essi per brevi lassi di tempo sfalsati. Le tre finestre temporali scelte (denominate rispettivamente checkpoint1-2-3) si collocano nei giorni 7-8 di protocollo (checkpoint1), nei giorni 9-10 (checkpoint2) e nei giorni 11-12 (checkpoint3). Ogni singolo trattamento è stato mantenuto per una durata complessiva di 2 giorni fatta eccezione per il checkpoint1, che ha ricevuto il trattamento con 6 ore di ritardo, per evitare la morte delle cellule in seguito al forte stress che subiscono con la tripsinizzazione. Questo ha permesso alle cellule di sopravvivere e aderire al substrato prima di essere sottoposte alla forte azione di queste molecole chimiche. In particolare, la Ciclopamina ha un effetto drastico sulla velocità di proliferazione e se applicata troppo precocemente non permette una sufficiente ripresa della coltura in seguito allo splitting.
81 Di seguito è riportata una raffigurazione schematica di come sono stati effettuati i diversi campioni (Figura 3.10).
Le colture cellulari sono state cresciute in mezzo minimo N2 addizionato della molecola in esame. Ho utilizzato il Sag ad una concentrazione di 100nM (stock 500 µM in soluzione di acqua 50% e DMSO 50%) e la Ciclopamina ad una concentrazione di 5µM (stock 5mM in DMSO). La coltura di controllo è stata cresciuta in mezzo minimo N2 addizionata con l’opportuna concentrazione di DMSO.
L’analisi del ciclo cellulare è stata fatta con il citofluorimetro al termine del trattamento, onde evitare che le cellule riprendessero la loro normale velocità di divisione cellulare in seguito alla rimozione delle molecole chimiche. Per ogni campione sono stati rilevati 104 eventi e sono poi state calcolate le percentuali di cellule in fase G0- G1 o in fase S-G2. Come previsto queste sostanze alterano significativamente la proporzione delle cellule che si trovano in fase G0-G1 del ciclo cellulare, in rapporto alle cellule che si trovano in fase G2 o in fase S.
Figura 3.11 - Effetti sul ciclo cellulare di SAG e Cyc al termine del Checkpoint1.
CDMM: controllo. Sag: trattamento con Smoothened Agonist. Cyc: trattamento con Ciclopamina. G0+G1: cellule in fase G0 o in fase
G1. S+G2: cellule in fase S o in fase G2.
Sull’asse delle orginate è riportata la percentuale di cellule sul totale degli eventi analizzati.
Figura 3.10 – Piano sperimentale per il controllo degli effetti di Sag e Cyc sul ciclo cellulare. WiBi: inibizione di Wnt e BMP. Sag: Smoothened Agonist,attivatore di Shh. Cyc:ciclopamina, inibitore di Shh. I trattamenti con Sag o Cyc
sono stati mantenuti in coltura durante tre diverse finestre temporali, della durata di due giorni ciascuna, al termine del quale le cellule sono state raccolte per l’analisi al citofluorimetro.
Checkpoint 1
Checkpoint 2
Checkpoint 3 Step 3
Step 3 Step 3
Step 2 Step 2
Step 2 Step 1
Step 1
Step 1
Day 8
Day 10
Day 12
: WiBi : Sag o Cyc
CDMM Sag Cyc
G0+G1 S+G2
82 In Figura 3.11 sono mostrate le proporzioni al termine del Checkpoint1. Rispetto al controllo, la coltura con Sag mostra una riduzione del 10% della percentuale di cellule in fase G0-G1 (da 65% a 55%) in favore delle cellule in fase G2 o S. Al contrario, la coltura trattata con Cyc presenta il 73% di cellule in fase G0-G1, contro il 64% delle cellule di controllo. Lo stesso trattamento in fasi più tardive del protocollo tuttavia perde di efficacia.
Infatti la coltura comincia ad affollarsi e probabilmente l’effetto dell’inibizione da contatto va a ridurre gli effetti del Sag e della Cyc (Figura 3.12).
Per ridurre questo bias ho provato a introdurre una tripsinizzazione aggiuntiva tra il quarto e il quinto giorno di step3, ma i risultati sono stati di difficile interpretazione, in quanto le cellule trovandosi a densità minore probabilmente (ipotesi non approfondita) escono dalla fase G0, indotta dalla confluenza, e rientrano in G1. Questo sembra generare un effetto paradossale soprattutto nelle colture che ricevono la Ciclopamina, che dopo la tripsinizzazione hanno un rapporto G0-G1/(S+G2) maggiore rispetto alla stessa coltura pre-tripsinizzazione (risultati non riportati).
Figura 3.12 - Effetti del SAG e Cyc sul ciclo cellulare in tutte e le finestre temporali analizzate.
Ct1-2-3: controllo del checkpoint 1, 2 e 3. Sag1-2-3: trattamento con Smoothened Agonist durante i checkpoint 1,2 e 3. Cyc1-2-3: trattamento con Ciclopamina durante i checkpoint 1,2 e 3. Sull’asse delle ordinate è riportata la
percentuale delle cellule sul totale dei nuclei analizzati.
G0+G1 S+G2
Ct1 Sag1 Cyc1 Ct2 Sag2 Cyc2 Ct3 Sag3 Cyc3
83 3.3.2 Controllo degli effetti del SAG e Ciclopamina sul differenziamento
Per controllare una corretta dorsalizzazione della coltura anche in presenza di molecole che agiscono sulla via di Sonic Hedgehog, ho ripetuto l’esperimento precedente analizzando per PCR i principali marcatori dell’asse dorso-ventrale del telencefalo, quali Nkx2.1 (ventrale) e Pax6 (dorsale). Questa volta le cellule sono state mantenute in coltura fino alla fine del protocollo, ed analizzate tutte alla stessa età. Sono stati analizzati i trattamenti in tre diverse finestre temporali, di 48 ore ciascuna, e inoltre è stato aggiunto un controllo positivo nel quale la Ciclopamina o il Sag sono stati somministrati durante la finestra temporale d’azione ventralizzante, ovvero durante lo step2 del nostro protocollo (Figura 3.13).
Si ricorda che per l’applicazione di trattamenti durante lo step2, i mezzi trattati vengono somministrati a partire dal giorno 4 di protocollo (secondo di step2), così come descritto nel capitolo Materiali e Metodi.
Figura 3.13 - Piano sperimentale per l’analisi degli effetti del SAG e della Cyc sull’asse D/V. WiBi: inibizione doppia di Wnt e BMP. Sag: trattamento con Smoothened Agonist. Cyc: trattamento con Ciclopamina. La durata dei trattamenti con Cyc e Sag è stata fatta in tre finestre temporali diverse, della durata di due gioni. L’analisi per RT-PCR è stata fatta al termine del giorno 12 per tutti i campioni. Un campione di controllo è stato portato avanti
in parallelo, e trattato durante lo step 2, finestra temporale di azione efficace del Sag e Cyc sul pattern D/V.
: WiBi : Sag o Cyc : WiBi + Sag o Cyc
Day 12
Day 12
Day 12
Day 12
Step 1
Step 1
Step 1
Step 1
Step 2
Step 2
Step 2
Step 2
Step 3
Step 3
Step 3
Step 3
84 L’analisi dei marcatori di patterning dorsoventrale Pax6 e Nkx2.1, mi ha permesso di individuare quale fosse la finestra temporale migliore per l’applicazione della Ciclopamina e del Sag. Come si vede dall’analisi seguente ( Figura 3.14) durante i primi due giorni dello step3, ovvero durante il giorno 7 e 8, queste molecole vanno a modificare leggermente il livello di espressione di Nkx2.1.
Per gli altri due checkpoints, Pax6 e Nkx2.1 non sono influenzati. Infatti Nkx2.1 è espresso a livelli molto bassi, mentre Pax6 ha un profilo di espressione tipico dei geni precoci di neuralizzazione, con picco al decimo giorno di protocollo.
Questo controllo ha fornito quindi informazioni utili in sede di progettazione dell’esperimento successivo. Infatti trattare troppo precocemente la coltura avrebbe potuto ventralizzare le cellule influendo negativamente sul processo di corticalizzazione. Quindi, per ridurre la finestra temporale di sovrapposizione tra effetti ventralizzanti e effetti sulla velocità di divisione cellulare, negli esperimenti di immunocitochimica che seguono l’applicazione delle molecole è stata fatta dal giorno 9.
Figura 3.14 - Analisi mediante RT-PCR degli effetti del SAG e della Cyc sull'asse D/V. Ct-: controllo negativo, coltura cresciuta in mezzo minimo. Ct+: controllo positivo, coltura cresciuta in presenza di Sag o Cyc durante lo step2. Checkpoint1:
trattamento durante i giorni 7-8.
Checkpoint2: trattamento durante i giorni 9- 10. Checkpoint3: trattamento durante i giorni 11-12. Sull’asse delle ordinate sono riportati i livelli di espressione dei geni rapportati al loro valore massimo osservato
fra tutti i campioni
* = p<0,05 ; *** = p<0,001.
*** *
* ***
*
Ct – Ct + Checkpoint1 Checkpoint2 Checkpoint3 Pax6 Nkx2.1
85
Figura 3.15 - Piano sperimentale per l’analisi mediante immunocitochimica di marcatori corticali in seguito a trattamento con SAG o Cyc. I trattamenti con SAG o Cyc vengono applicati a partire dal giorno 9 fino alla fine del protocollo. Le finestre di osservazione sono rappresentate dai riquadri rosa nello schema. In basso a destra sono riportati i risultati di immunocitochimica eseguito durante lo studio di corticalizzazione, (vedi capitolo 3.2.2), e le linee
di tendenza di questa analisi sono riportati sottoforma di linee di tendenza al di sopra dello schema.
3.3.3 Ciclo cellulare e generazione di neuroni corticali
I marcatori corticali Tbr1, Ctip2 e Satb2 vengono espressi dai neuroni differenziati in fasi tardive del protocollo di coltura. La loro traduzione ha il picco di espressione rispettivamente al giorno 12, 14 e 18 (Figura 3.8). Per osservare gli effetti di un’alterazione nella normale velocità di divisone cellulare, Ciclopamina e Sag sono stati mantenuti il maggior tempo possibile all’interno dei mezzi di coltura, ovvero dal giorno 9 fino alla fine del differenziamento. Ho scelto poi tre finestre temporali per l’analisi dei marcatori, i giorni 14, 16 e 18 (riquadri rosa in Figura 3.15), così da poter avere una visione estesa dei profili di espressione delle proteine Ctip2 e Satb2, rilevate per immunocitochimica. Dal momento che Ctip2 è maggiormente espresso in vivo in strati della corteccia più profondi e di sviluppo precoce, mentre Satb2 in vivo viene espresso soprattutto negli strati più superficiali e di formazione tardiva, ho analizzato il rapporto tra le cellule positive per Satb2 e Ctip2 come indicatore di stratificazione corticale in vitro.
L'ipotesi di lavoro è che la durata del ciclo cellulare sia connessa all'identità del neurone in cui le cellule differenziano, così come avviene nella retina di Xenopus (Decembrini, et al., 2009). La ciclopamina, bloccando la via di segnalazione di Shh (allungando la fase G1 del ciclo cellulare), anticiperebbe l’espressione dei marcatori più tardivi, come Satb2, quasi a simulare un “invecchiamento” del pool di precursori neuronali. Se questo si verificasse, il
Step 3 Step 2
Step 1
: Sag o Cyc : WiBi
Day 14 Day 16 Day 18
Tbr1 Ctip2 Satb2
Step 3+2 Step 3+4 Step 3+6 Step 3+8
86 numero di cellule positive per Ctip2 dovrebbe diminuire, mentre quelle positive per Satb2 dovrebbe aumentare.
Le informazioni ottenute comparando il numero di cellule positive per Ctip2 e Satb2 tra i vari trattamenti (Sag 100 nM o Cyc 5µM) per ognuna delle tre finestre temporali di osservazione sono piuttosto promettenti. Come mostra la Figura 3.16, la ciclopamina al giorno 16 e al giorno 18 riduce la proporzione Ctip2/Satb2, mentre il Sag ha effetto opposto, privilegiando la comparsa di Ctip2 e quindi aumentandone la sua percentuale (barra verde) sul totale delle cellule marcate da questi due anticorpi. L’effetto di queste molecole non è apprezzabile invece al giorno 14. Interessante anche l’andamento degli effetti, ovvero l’efficacia aumenta parallelamente alla durata del trattamento, con un effetto maggiore sulle colture di 18 giorni rispetto a quelle di 16 giorni.
Tuttavia, come già anticipato, Sonic Hedgehog ha anche un ruolo come morfogeno sui precursori neuronali, e la sua via di trasduzione è coinvolta in molteplici altri meccanismi cellulari. Quindi ho voluto confermare la relazione tra ciclo cellulare e regionalizzazione corticale alterando il ciclo cellulare con molecole che colpiscono direttamente il macchinario del ciclo cellulare.
Figura 3.16 - Analisi mediante immunocitochimica degli effetti del SAG e Cyc su marcatori corticali. Il grafico mostra i risultati ottenuti applicando il piano
sperimentale illustrato in Figura 3.15. * = p<0,05 ; *** = p<0,001
***
***
*
*
87 Una molecola candidata è certamente la Mimosina (Hughes & Cook, 1996). Questa molecola di origine vegetale è nota per le sue capacità di bloccare la transizione G1-S in cellule HeLa e staminali umane, sincronizzando le colture in fase G1 se utilizzata a concentrazione 500 µM per 24 ore (Krude T. , 1999), e di rallentare il procedere della fase S a concentrazioni inferiori. Uno studio svolto sugli effetti della mimosina in cellule di criceto (Mosca, Dijkwel, & Hamlin, 1992) dimostra come una concentrazione di 400 µM riesca ad arrestare le cellule di roditore.
Sfruttando queste informazioni, ho deciso di testare la mimosina impostando come concentrazione maggiore la metà della concentrazione necessaria per la sincronizzazione, in quanto nei miei esperimenti l’applicazione della molecola viene fatta per numerosi giorni, e non solo 24 ore. Ho provato quindi ad applicare la mimosina a varie concentrazioni, 200, 50 e 5 µM a partire dal giorno 9 di protocollo, e coltivato le cellule fino al giorno 15, cercando di individuare quale fosse la concentrazione giusta in grado di rallentare le cellule senza avere effetti tossici. Una coltura di controllo è stata portata avanti in parallelo con mezzo privo di mimosina.
La mimosina 200µM è risultata essere tossica dopo 48 ore, mandando in apoptosi le cellule rapidamente. La concentrazione 50 µM invece è compatibile con la vita ma le cellule si sono divise molto poco e hanno assunto una morfologia eccessivamente alterata per operare un confronto logico con gli altri esperimenti. Infine la mimosina 5 µM si è rivelata la concentrazione migliore di quelle testate. La coltura ha raggiunto il quindicesimo giorno senza un eccessiva morte cellulare e i pozzetti sono stati utilizzati per un’immunocitochimica per i marcatori corticali Ctip2/Satb2. Dalla Figura 3.17 si può vedere come sono le colture all’osservazione al microscopio a fluorescenza, in cui Satb2 è marcato in verde e Ctip2 è marcato in rosso. Nella coltura trattata con mimosina sono presenti grossi gruppi cellulari Satb2 positivi, mentre nella coltura di controllo i gruppi sono minori sia in numero che dimensione. A lato delle figure è mostrata invece un’analisi di “Pixel Intensity”, che permette di valutare indirettamente il rapporto tra le due proteine Ctip2 e Satb2 misurando il rapporto dell'intensità dei due anticorpi secondari fluorescenti utilizzati per la loro immunorivelazione.
88 Come si può osservare, oltre alla ciclopamina, anche altre molecole sono in grado di rallentare il ciclo cellulare alterando la proporzione di neuroni appartenenti a strati diversi della corteccia. Le colture con fase G1 allungata favoriscono la comparsa di marcatori di strati a generazione tardiva superficiali rispetto al controllo, indicando che il tempo che le cellule impiegano a completare il ciclo può essere un parametro decisivo durante l’istogenesi della corteccia cerebrale di topo.
Figura 3.17 - Analisi mediante immunocitochimica di marcatori corticali in colture trattate con mimosina.
Immunocitochimica eseguita al termine del giorno 15 del protocollo in colture trattate con mimosina 5 nm. Rosso:
Ctip2. Verde: Satb2. La significatività è stata valutata con un test t ad una coda per campioni appaiati. * = p<0,05
*
CDMM Mimosina
CDMM Mimosina
