01 Nigro

(1)

distrofia muscolare di Duchenne:

dalla genetica alle nuove terapie vincenzonigro

Prof ordinario di Genetica Medica

Università degli Studi della Campania “Luigi Vanvitelli”, Naples, Italy

Telethon Institute of Genetics and Medicine (TIGEM), Pozzuoli, Italy

(2)

google 0

200000 400000 600000 800000 1000000

LGMD "LIMB GIRDLE MUSCULAR DYSTROPHY"

"DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY"

"BECKER MUSCULAR DYSTROPHY"

155000 188000

977000

221000

google

LGMD "limb girdle muscular dystrophy"

"Duchenne muscular dystrophy"

"Becker muscular dystrophy"

519 1475

9389

1306

PubMed

(3)

interazioni

clinica genetica

famiglia

(4)

Bushby K, et al. Lancet Neurol. 2010;9:77–93

3 anni

(5)

7 anni

(6)

(7)

11 anni

(8)

Ritardi nello sviluppo Difficolta’ nei movimenti

3-6 anni

Perdita della deambulazione

10-13 anni

Uso limitato degli arti superiori Scoliosi >13 anni

Complicazioni cardiache e respiratorie. Necessita’

di ventilazione forzata

Decesso dovuto a problemi cardiaci e/o respiratori

25-35 anni

(9)

(10)

Figlio sano Figlia Figlia sana portatrice

XX XX

XY

Figlio DMD

XY

X con mutazione Madre portatrice

Padre sano

XY XX

Adapted from Neuromuscular Network 2011

(11)

1986

(12)

Il gene della distrofina: 2.092.292 caratteri = 185 fogli

(13)

The Lancet Neurology 2003 2, 731-740DOI: (10.1016/S1474-4422(03)00585-4)

(14)

stop 16 ore

(15)

Il gene della distrofina: delezioni casuali

(16)

duplicazioni casuali

(17)

delezione

(18)

(19)

(20)

99 99 40

95

50 99 10

70 2 2

90

99 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

multiplex PCR MLPA DNA-Seq RNA-Seq

Sensibilità delle tecniche in rapporto alle classi di varianti

puntiformi/complesse duplicazioni delezioni

(21)

Una parte di bambini con la distrofia muscolare di Duchenne/Becker potrebbe non ricevere

ulteriori test dopo l’esclusione di delezioni e duplicazioni

Una parte di bambini con altre forme di distrofia muscolare potrebbe non ricevere ulteriori test dopo l’esclusione delle mutazioni della

distrofina

Senza un test non c’è trial

(22)

Frederick Sanger

Nobel price 1958 and 1980 born August 13 1918, died November 19 2013

Una piccola frazione di dNTP è composta da ddNTPs (ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP).

Questi bloccano la

polimerizzazione del DNA

Storia:

sequenziamento

Sanger

(23)

Sanger sequencing

esone-per-esone, gene-per-gene

(24)

….to next generation sequencing testing

FASTQ

@SEQ_ID

GATTTGGGGTTAATA +

!''*((((***+))%

(25)

Genome Analyzer II

4.000.000.000 bp/7 giorni

= 42 ore per miliardo di basi 350$/miliardo di basi

2008

NovaSeq6000

6.000.000.000.000 bp /40 ore

= 40 secondi per miliardo di basi 7$/miliardo di basi

2017 2002

96-capillary 3730xl DNA Analyzer 2.100.000 bp/ giorno

= 476 giorni per miliardo di basi

2.000.000$/miliardo basi

(26)

Pazienti italiani con distrofia dei cingoli e miopatie (WES e MotorPlex)

MOTORPLEX

• 270 muscular dystrophy genes

• >60K target regions corresponding to 1,500kbp

• 99.5% coverage inside target regions at >40x

• 1,850 samples already investigated

(27)

Locus Gene Name patients

1q42.13 ACTA1 2

1p21 AGL 2

21q22.3 COL6A2 4

2q37 COL6A3 2

11q22.3-q23.1 CRYAB 1

Xp21.2 DMD 7

19p13.2 DNM2 5

Xq28 EMD 1

7q32 FLNC 4

17q25.2-q25.3 GLA 1

3p12 GNE 3

3p22.1 GTDC2 1

3q24 GYG1 1

12q13.2 ITGA7 2

6q22-q23 LAMA2 8

Xq28 MTM1 5

17p13.1 MYH2 1

14q12 MYH7 8

5q31 MYOT 1

2q23.3 NEB 8

11q12-q13.2 PYGM 3

20p13 RYR1 25

1p36.13 SEPN1 2

18p11.32 SMCHD1 1

6q25 SYNE1 1

14q23.2 SYNE2 2

9p13 TPM2 1

1q21.2 TPM3 2

4q35.1 TRAPPC 2

Disease Locus Gene Name patients

LGMD1B 1q22 LMNA 4

LGMD1C 3p25.3 CAV3 2

LGMD2A 15q15 CAPN3 21

LGMD2B 2p13.2 DYSF 15

LGMD2C 13q12 SGCG 4

LGMD2D 17q21 SGCA 10

LGMD2E 4q12 SGCB 6

LGMD2G 17q12 TCAP 1

LGMD2H 9q33.1 TRIM32 1 LGMD2I 19q13.3 FKRP 6

LGMD2J 2q24.3 TTN 5

LGMD2K 9q34.1 POMT1 1

LGMD2L 11p13 ANO5 14

LGMD2M 9q31 FKTN 2

LGMD2N 14q24 POMT2 6

LGMD2R 2q35 DES 1

LGMD2T 3p21 GMPPB 2

LGMD2V 17q25 GAA 11

(28)

Sospetta distrofia muscolare

DNA da sangue NGS (270 geni o

mendelioma) biopsia/analisi RNA

il paziente è DMD/BMD e riceve la diagnosi

Validazione della mutazione puntiforme

DMD/BMD o LGMD

Il paziente riceve consulenza e diagnosi

analisi di delezioni/duplicazioni

da evitare

(29)

Sospetta distrofia muscolare

DNA da sangue NGS (270 geni o

mendelioma)

percorsodiagnosticonetwork

biopsia/analisi RNA il paziente è DMD/BMD

e riceve la diagnosi

Validazione della mutazione puntiforme

DMD/BMD o LGMD

Il paziente riceve consulenza e diagnosi

analisi di

delezioni/duplicazioni

(30)

criteri di inclusione

pazienti di sesso maschile di età compresa tra 0-12 più determinazioni dei valori di CK> 3.000 U.I

ritardo nella acquisizione delle abilità motorie

criterio di esclusione

avere già identificato una variante nel gene distrofina o in un altro

gene che spieghi il quadro clinico

(31)

come si accede ?

pediatra

vede un bambino con CK stabilmente alto e ritardo

motorio

laboratorio esegue un test MLPA/PCR negativo

su sospetta DMD consenso

informato

(32)

quali risposte potrebbe ricevere?

non si tratta di distrofia muscolare, non si procede ai test

genetici

nessuna mutazione:

si richiede biopsia e/o il DNA dei familiari per cercare varian< elusive

il paziente ha una mutazione puntiforme

e una diagnosi

(33)

Whole exome con CRE Agilent (sequenze almeno 20x) in 84 soggetti, di cui 1/3 fatti con doppio coverage (20Gb)

COL6A1 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

100 100 100 99.7 100 100 100 100 100 100 100 100

100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

COL6A2 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

100 100 99.6 99.6 100 100 100 99.9 100 100 100 100

100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 99.6 100

COL6A3 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

(34)

Stop

(35)

Fase 2a (004)

38 pazienti

Fase 2b (007)

174 pazienti

Prima pubblicazione sulla storia naturale

della malattia

Scoperta di

Ataluren

Fase 1

62 volontari sani

Linee guida preliminari FDA

Fase 3 (020)

228 pazienti

EMA Approval

Linee guida preliminari EMA

• Ataluren è un farmaco specifico per la causa della malattia poiche’ consente il

readthrough dei codoni nonsenso nel mRNA, rendendo possibile la sintesi della proteina della distrofina completa.

• Ataluren rappresenta la prima terapia farmacologica approvata specificamente nella Distrofia Muscolare di Duchenne con mutazione nonsenso

• Oltre 900 soggetti sono stati esposti/trattati con TRANSLARNA ed il farmaco è risultato in generale ben tollerato.

1998–

2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016

(36)

Uno studio clinico di fase 2a ha mostrato che Ataluren riesce a promuovere la produzione di distrofina nei pazienti con nmDMD

Pretrattamento Fine del trattamento (giorno 28)

Il 61% dei pazienti ha evidenziato un aumento della colorazione della distrofina in 28 giorni di terapia con

ataluren

(37)

I pazienti che hanno assunto Ataluren, 40mg/kg/die, hanno mostrato un minor decadimento della capacità di camminare rispetto a quelli che assumevano

placebo, nel corso di 48 settimane

-12.9m

-44.1m

6MWD, 6-minute walk distance

Adjusted p value from analysis of all data across three treatment arms with 80 mg/kg/day not different from placebo; p = 0.0367 post hoc, adjusted for multiplicity, mixed-model repeated measures with estimated mean ∆31.7 m; nominal p value for two-arm study ataluren 40 mg/kg/day versus placebo; p = 0.0197

70% of placebo- and ataluren-treated patients respectively were receiving corticosteroids throughout the study, as part of best standard of care.

1. Haas M et al. Neuromuscul Disord 2015;25:5–13. Graph reproduced with permission from Bushby K et al., Ataluren treatment of patients with nonsense mutation dystrophinopathy.

(38)

Effetti di Ataluren sui Test di Funzionalità Temporale (TFT) rispetto al placebo a 48 settimane

• Una differenza clinicamente significativa di 1,5 secondi

¹

è stata ottenuta in tre test TFT su quattro

^{2, 3}

• Nessuna differenza è stata osservata nel test in piedi da supino, a causa dei dati demografici basali

^{2, 3}

7.4 6.7 6.1 5.5 6.9 6.0

Valori basali(s):

(39)

For every complex

problem there is a

simple solution that is

wrong

G. B. Shaw

(40)

(41)