II NNDDIICCEE

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RIASSUNTO………..………... 1 ABSTRACT……….. 3 INTRODUZIONE………... 5 1. Gli omeogeni………. 6

1.1. Omeogeni di classe I: i geni HOX……….………. 7

1.2. Omeogeni di classe II: l’esempio della famiglia Paired ………... 9

2. I geni Otx……….. 10

3. Le cellule staminali……….. 15

3.1. Le cellule staminali embrionali...……….………. 15

3.2. Le cellule staminali adulte.……… 17

3.2.1. Fattori di regolazione delle cellule staminali adulte....………. 19

3.2.2. Plasticità delle cellule staminali adulte………. 20

3.3. La nicchia delle cellule staminali...………. 22

3.4. Le cellule staminali mesenchimali………. 26

4. Il sistema scheletrico……… 29

4.1. L’osteogenesi………. 31

4.2. Modelli in vitro per lo studio dell’osteogenesi……….. 34

5. Scopo della tesi……….……… 36

MATERIALI E METODI……… 38

1. Colture cellulari di cellule murine MC3T3-E1………. 39

2. Congelamento e scongelamento cellule………. 39

3. Raccolta delle cellule per l’estrazione dell’RNA……….………. 40

4. Esperimento di differenziazione spontanea delle MC3T3-E1………. 40

5. Esperimento di differenziazione indotta delle hMSC………….………. 40

6. Colorazione istochimica mediante Alizarin Red S……… 41

7. Estrazione dell’ RNA totale da MC3T3-E1 e hMSC……… 42

8. Trattamento dell’RNA totale con Dnasi……… 43

9. Retrotrascrizione dell’RNA: sintesi del DNA complementare (cDNA)……. 43

10. RT- PCR semiquantitativa……… 44

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II

RISULTATI……… 47

1. Espressione di Otx1 e Otx2………. 48

2. Differenziazione della linea cellulare murina MC3T3-E1…...……….. 49

3. Analisi istochimica con Alizarin Red S……….. 49

4. Analisi di espressione mediante Real Time qPCR……… 51

4.1. Espressione di marcatori funzionali osteogenici…………...…………... 52

4.2. Espressione di fattori di trascrizione osteogenici…………...…………... 53

4.3. Espressione di Otx1……….…………... 54

4.4. Espressione di candidati gene targets e regolatori nel pathway di Otx1…… 54

5. Studio di cellule staminali mesenchimali umane (hMSC)……..………. 57

5.1. Analisi di espressione mediante Real Time qPCR di marcatori dell’osteogenesi umana……….. 58

5.2. Espressione di OTX1 in cellule mesenchimali umane………... 59

DISCUSSIONE……… 60