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INIBITORI OSSIDO NITRICO SINTASI
A causa del potenziale beneficio nel trattamento delle malattie neurodegenerative, molte aziende farmaceutiche alla fine degli anni ’80 e nei primi anni ’90 iniziarono dei programmi per identificare composti nNOS selettivi e visto che non c’erano strutture cristalline disponibili, un approccio comune era quello di usare il substrato, L-arginina come composto guida e fare un grande numero di analoghi con la speranza che l’appropriato cambiamento strutturale avrebbe prodotto un composto che legasse preferenzialmente l’nNOS oltre che l’eNOS e l’iNOS. Comunque, per molti anni c’è stato poco o nessun successo nel trovare inibitori selettivi e questa mancanza di selettività era dovuta al fatto che i siti attivi di tutti e tre gli isoenzimi erano abbastanza simili, perché il substrato e la reazione per tutti e tre erano identici; pertanto, ogni modificazione che era fatta sulla L-arginina aveva simili effetti nel legare i siti attivi di tutti e tre gli isoenzimi. Quello di cui c’era bisogno era di un composto che si sarebbe ancorato nel sito attivo e si sarebbe esteso a raggiungere la seconda sfera dei residui aminoacidici in cerca di una differenza lontano dal sito di legame del gruppo eme.
E’ stato segnalato da un gruppo presso i Laboratori Glaxo Wellcome nel 1993 [42] che la L-nitroarginina è un inibitore 250 volte selettivo per l’nNOS oltre che all’iNOS ma non selettivo per l’eNOS; a causa della mancanza di selettività per l’eNOS, questo produce un’ampia ipertensione negli animali [43]. Comunque, la L-nitroarginina ha mostrato essere un inibitore competitivo che si lega nel sito attivo a causa della sua somiglianza strutturale con il substrato. La selettività nNOS/iNOS era alta e grazie anche alla capacità di attraversare la barriera ematoencefalica (BEE) , la nitroarginina fu selezionata come molecola di riferimento a cui potevano essere aggiunti aminoacidi.
Una caratteristica comune della maggior parte degli analoghi è che un gruppo amminico nella catena laterale dell’ amminoacido lega la nitroarginina. L’analogo più potente, L-nitroargininil-L2,4-diamminobutiramide (1) ha una Ki di 130 nM nei confronti dell’nNOS con una selettività sull’eNOS di 1538 e sull’iNOS di 192. Altrettanto interessanti sono i derivati L-nitroarginina-L-lisinammide (2) e D-lisil-D-nitroargininammide (3) che hanno attività simile, anche se la selettività è
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variata (2: selettività nNOS/eNOS = 310 ; nNOS/iNOS = 230) (3: selettività nNOS/eNOS = 140 ; nNOS/iNOS = 2800)
Infine l’analogo D-2,4-diaminobutiril-D-nitroarginammide (4) è meno potente e selettivo rispetto a 1. (n-NOS)Ki= 120 nM n-NOS/e-NOS= 1538 n-NOS/i-NOS= 192 N H NHNO2 N H N H2 O OH
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Un irrigidimento di tali strutture non ha portato ad un sostanziale miglioramento per quanto riguarda l’attività, la selettività e la potenza, ad eccezione del composto 5. La sostituzione del gruppo diaminobutiramide con la pirrolidina (5), provoca una maggiore potenza e selettività rispetto al composto 1.
Una nuova classe di inibitori della NOS comprende piccole molecole non peptidiche, quali i composti 6, 7 e 8 caratterizzati da una elevata potenza (di ordine nM) e una buona selettività per n-NOS/e-NOS e n-NOS/i-NOS .
(n-NOS) Ki= 390 nM n-NOS/e-NOS= 1110 n-NOS/i-NOS= 150 (n-NOS) Ki=14nM n-NOS/e-NOS=2000 n-NOS/i-NOS=290
(n-NOS) Ki= 53 nM n-NOS/e-NOS= 491 n-NOS/i-NOS= 74 N H O NH2 N H2
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Il più potente inibitore conosciuto è la S-metilisotiourea (SMT) (9) [44] . SMT è un inibitore i-NOS preferenziale ma non è selettivo, riduce i livelli plasmatici del metabolita NO in studi su ratti ipertesi. SMT riduce significativamente l’espressione di molecole di adesione intracellulare nei ratti [45].
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L’ SMT gioca un ruolo neuroprotettivo nel danno acuto da ischemia/riperfusione, come evidente dalla riduzione significativa nel volume cerebrale dell’infarto, dall’edema e dai deficit neurologici [46].
L’ SMT inibisce l’espressione di iNOS e del conseguente rilascio dell’ NO e aumenta così la sopravvivenza neuronale in co-colture neuroni/glia [47].
In uno studio più recente però l’SMT ha fallito nel proteggere il danno neuronale in modelli di ratto di ischemia globale cerebrale [48].
Le discrepanze nei risultati potrebbero essere dovute alle differenze nei modelli di ischemia e alle dosi più basse di SMT usate in questi studi. La neuroprotezione massimale dell’SMT è stata osservata alla dose di 100 mg/kg; è’ stato riportato che durante l’ ischemia cerebrale, i livelli di NO nel cervello aumentano da 10 nM a 1 µM entro 3-24 min [49].
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NOS INIBITORI DI NUOVA GENERAZIONE
A causa degli effetti dannosi derivanti dell’eccesso di NO, una riduzione selettiva della biosintesi dell’NO, attraverso un’inibizione controllata delle isoforme NOS, in particolare della iNOS [50], potrebbe fornire un’importante opportunità terapeutica. Molti sforzi sono stati focalizzati sulla progettazione di farmaci ad alta selettività, per di più basati su strategie volte a modificare il substrato dell’enzima. L’azione inibitoria di un farmaco putativo sulle attività iNOS e nNOS potrebbe essere benefica in varie forme di shock e infiammazione e potrebbe proteggere dalla ingiuria neurologica [51]. Ma dal momento che l’NO gioca un ruolo fisiologico centrale, un’inibizione completa della sua produzione sarebbe nociva. Per evitare quindi effetti collaterali è necessario progettare farmaci che abbiano come target uno specifico isoenzima NOS. Questi farmaci dovrebbero ripristinare un’appropriata omeostasi del metabolismo dell’NO nel tessuto dove la produzione di NO è eccessiva. L’uso di NOS inibitori non-specifici, come la L-nitroarginina metil estere (L-NAME), indebolisce il consolidarsi della memoria a lungo termine [52]. E’ anche degno di nota il ruolo della eNOS nel mantenimento del tono vascolare e nella funzione della memoria spaziale [53].
Perciò, una possibile via per ritardare la progressione del MA deve includere un progetto razionale di inibitori degli enzimi, che prendano come target le isoforme NOS implicate nel danno alle cellule cerebrali [54].
Da un punto di vista chimico, gli inibitori NOS vengono suddivisi in due gruppi principali: gli inibitori aminoacidici e gli inibitori non-aminoacidici.
Questi composti, sebbene non siano in uso per il trattamento del MA, potrebbero rappresentare dei mezzi utili per indagare le funzioni biologiche dell’NO nel MA.
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1. Inibitori Aminoacidici
Questo tipo di derivati è stato raggruppato, sulla base della struttura chimica, in due categorie di composti [54; 55]: analoghi della L-arginina, e dipeptidi.
1.1 Analoghi della L-Arginina
I primi NOS inibitori derivati dalla L-arginina sono stati analoghi guanidinici mono- o di-sostituiti, tra i più noti la L-NG monometil arginina (L-NMMA) (10) e la L-NG nitroarginina (L-NOARG) (11) e il suo metil estere (L-NAME). Questi prodotti hanno mostrato una potente azione inibitoria ma una scarsa selettività tra le varie isoforme NOS.
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Gli analoghi dell’arginina comprendono l’L-NAME (12) [56] e i suoi derivati; la N-metil-L-arginina (L-NMA), la Nδ-(1-imminoetil)-L-ornitina (L-NIO) (13), la N-nitro-L-arginina NNA) (14) [56], la N-(1-immino-3-butenil)-L-ornitina (L-VNIO) (15), la L-tiocitrullina (16) [57]; e la N-(1-imminoetil)-L-lisina (L-NIL) (17) [58].
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Lo sviluppo di derivati Nω-2-nitroarilaminoacidici e analoghi eterociclici della L-citrullina [59] sono stati ottenuti per mezzo di modificazioni della frazione guanidinica della L-arginina. I derivati Nω-2-nitroarilaminoacidici hanno mostrato una buona potenza inibitoria nei confronti della nNOS, e un’attività ridotta verso la eNOS e la iNOS, mantenendo lo stesso ordine di potenza e di selettività dei prototipi NOS inibitori come la L-NNA [60].
1.2. Dipeptidi
Sono stati progettati dipeptidi contenenti L-NNA (ArgNO2), fenilalanina (PHE) e esteri dipeptidici per migliorare la selettività nNOS/iNOS della L-NNA [61]. E’ stata sintetizzata una libreria di 152 ammidi dipeptidi contenenti nitroarginina e amminoacidi diversi dalla PHE e sono stati selezionati per la loro attività [62]. Una eccellente potenza inibitoria e selettività per la nNOS sulla eNOS e la iNOS è stata raggiunta con ammidi dipeptidi contenenti un’ammina basica nella catena laterale. Tra questi composti, il più potente inibitore nNOS è la L-ArgNO2 -L-Dbu-NH2, che mostra anche la più alta selettività sulla eNOS (> 1500 volte) con una
selettività di 192 volte sulla iNOS. Questi composti non mostrano una inibizione tempo-dipendente. Questo composto può essere considerato il maggiore inibitore nNOS-selettivo conosciuto. Studi di Relazione Struttura Attività (SAR) hanno dimostrato l’importanza dell’α-ammino gruppo e della frazione NH del legame peptidico per il legame al sito attivo.
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Diversi analoghi della L-arginina sono conosciuti come potenti inibitori della NOS. La S-metil-L-isotiocitrullinil-L-fenilalanina ha mostrato una selettività 66 volte maggiore per la iNOS sulla nNOS, mentre la S-metil-L-isotiocitrullinil-L-leucina e la NG-nitro-L-arginil-L-fenilalanina hanno mostrato, rispettivamente, una selettività di 20 e 14 volte.
2. Inibitori Non-Aminoacidici
Per migliorare la selettività e il profilo terapeutico dei derivati della L-arginina, sono stati studiati gli inibitori non-aminoacidici della NOS; questi includono una lista continuamente in crescita di composti che, da un punto di vista chimico, potrebbero essere divisi in due gruppi principali: composti amidinici e eterociclici.
2.1 Composti amidinici
2.1.1. Guanidine
Nonostante le semplici guanidine siano solo deboli inibitori [63], la frazione guanidinica può mimare la L-Arg per il riconoscimento al sito di legame, e per questo può essere considerata un potenziale farmacoforo per la inibizione NOS. L’amminoguanidina (18) è un inibitore selettivo della NOS inducibile di topo e numerosi studi in vivo hanno dimostrato che questa inibizione potrebbe essere utile nel trattamento di quelle malattie caratterizzate dalla iperproduzione patologica di NO da parte della iNOS [64].
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42 2.1.2. Isotiouree
L’inibizione da isotiouree non aminoacidiche ha fornito composti che sono inibitori potenti e selettivi iNOS/eNOS [65]. L’effetto inibitorio di questi composti è causato non solo dalla loro competizione con il substrato per il legame della L-arginina e/o dall’ossidazione del centro dell’enzima (eme), ma anche dall’interazione con i motivi peptidici dell’enzima che influenzano la sua dimerizzazione, l’affinità per i cofattori, e l’interazione con le proteine associate. L’uso clinico di questi composti è limitato dalla loro scarsa penetrabilità cellulare e dalla alta tossicità.
2.1.3. Amidine
Esistono un gran numero di derivati delle amidine, ma i composti più attivi sono: la 2-imminopiperidina (19), la 2-imminoomopiperidina e l’(1S,5S,6R,7R)-7-Cloro-3-immino-5-metil-2-azabiciclo [4.1.0] eptano idrocloride (ONO-1714) (20). Questi sono potenti inibitori della iNOS umana.
L’ONO-1714 costituisce un nuovo analogo amidino ciclico che inibisce la iNOS umana con una Ki di 1.88 nM e la iNOS dei roditori con una potenza similare in vitro. L’ONO-1714 è 10 volte selettivo per la iNOS umana sulla eNOS umana. Quando l’attività inibitoria dell’ONO-1714 è stata confrontata per la iNOS, è stata trovata essere rispettivamente 451 volte e > 20,000 volte più potente della L-NMMA e della amminiguanidina [66].
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2.2. Composti Eterociclici
Questo gruppo di NOS inibitori non amminoacidici include una gamma di composti eterociclici. Tra i più rappresentati ci sono: indazoli, imidazoli e analoghi della BH4.
2.2.1. Indazoli
Malgrado l’assenza di selettività in vitro in saggi enzimatici o funzionali [67]; il 7-nitroindazolo (detto 7-NI) (21), può essere considerato come il primo inibitore selettivo della nNOS in vivo; infatti, diversi studi hanno dimostrato i suoi effetti protettivi nel dolore, nell’ictus sperimentale [68] e in modelli di topo di MP [69] con minimi effetti sistemici sulla pressione.
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Tra gli inibitori della NOS descritti in letteratura esistono composti recentemente sintetizzati che presentano nella loro struttura molecolare una struttura tiofenica. Tale raggruppamento farmacoforico sembrerebbe costituire l’elemento strutturale fondamentale per un ottimale e selettiva attività antiischemica. In particolare nel 2006 alcuni ricercatori progettarono il derivato 22 che in vitro ha mostrato buone proprietà inibitorie nei confronti della nNOS (IC50= 1,88 µM) .
CH3 S NH NH N H N 22
