LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
Giedrė Šinkūnaitė-Maršalkienė
MATRIKSO METALOPROTEINAZIŲ IR ANGIOTENZINĄ KONVERTUOJANČIŲ
FERMENTŲ RAIŠKOS SĄSAJŲ SU KYLANČIOSIOS AORTOS DILATACINE
PATOLOGIJA TYRIMAS
Daktaro disertacija
Biomedicinos mokslai, biologija (01 B)
Kaunas, 2011
Disertacija rengta 2006–2010 metais Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijoje.
Mokslinis vadovas
prof. habil. dr. Vaiva Lesauskaitė (Lietuvos sveikatos mokslų universi- tetas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, biologija – 01 B, medicina – 07 B)
TURINYS
...
SANTRUMPOS 5
...
ĮVADAS 8
...
Mokslo darbo tikslas ir uždaviniai 10
...
Darbo mokslinis naujumas 11
...
I. LITERATŪROS APŽVALGA 12
1.1. Matrikso metaloproteinazės, jų klasifikacija, struktūra ir ...
aktyvumo reguliacija 12
...
1.1.1. MMP aktyvumo reguliacija transkripcijos lygyje 14 ...
1.1.2. MMP aktyvumo reguliacija per antrines signalines molekules 16 ...
1.1.3. Mutacijų įtaka MMP aktyvumo reguliacijai 17
...
1.2. MMP ir aortos dilatacinės patologijos morfogenezė 18 1.3. MMP genų polimorfizmo ir kylančiosios aortos dilatacinės
...
patologijos sąsajų tyrimai 20
...
1.4. Renino-angiotenzino sistema 22
...
1.4.1. AKF struktūra 23
...
1.4.2. AKF2 struktūra 25
...
1.4.3. AKF I/D polimorfizmas 26
...
1.4.4. RAS ir MMP ryšys 27
...
II. TYRIMŲ METODIKA 29
...
2.1. Tirtasis kontingentas 29
...
2.1.1. Kylančiosios aortos dilatacinės patologijos (KADP) grupė 29 ...
2.1.2. Atsitiktinė Kauno miesto gyventojų imtis 30
...
2.1.3. Referentinė grupė 30
...
2.2. Genominės DNR išskyrimas 31
2.2.1. Genominės DNR išskyrimas iš į parafiną įlietų aortos sienos ...
audinių 31
2.2.2. Genominės DNR išskyrimas iš periferinio kraujo naudojant ...
komercinį rinkinį su kolonėlėmis 31
...
2.3. Genų polimorfizmo tyrimas 31
2.3.1. MMP-3 –1171 5A/6A, MMP-2 –735 C/T, MMP-2 –1306 C/T, MMP-9 –1562 C/T genotipavimo tyrimas tikro laiko PGR
...
metodu 31
2.3.2 Alternatyvus MMP-3 –1171 5A/6A, MMP-2 –735 C/T, MMP-2 –1306 C/T, MMP-9 –1562 C/T VNP genotipavimo tyrimas taikant
...
restrikcijos endonukleazes 34
2.3.3 Angiotenziną konvertuojančio fermento geno I/D polimorfizmo ...
genotipavimas 41
...
2.4. Genų raiška 43
...
2.4.1. mRNR išskyrimas iš aortos sienos 43
...
2.4.2. RNR tirpalo koncentracijos, švarumo ir kokybės įvertinimas 44 ...
2.4.3. Viengrandės RNR vertimas į cDNR 44
...
2.4.4. Pradmenų ir PGR produktų dydžio pasirinkimas 45 2.4.5. Genų raiškos tyrimo tikro laiko PGR metodu kokybės kontrolės
...
kriterijų patikra 45
2.4.6. Genų raiškos tyrimo tikro laiko PGR metodu plokštelių
...
paruošimas 49
...
2.4.7. Genų raiškos tyrimas tikro laiko PGR metodu 50
...
2.5. Aortos sienos imunohistocheminis tyrimas 52
...
2.5.1. AKF, AKF2 ir EMMPRIN raiškos vertinimas 53
...
2.6. Statistinė duomenų analizė 53
...
III. REZULTATAI 55
3.1. Atsitiktinės Kauno miesto gyventojų imties AKF I/D, MMP-2 (–
735) C/T, MMP-2 (–1306) C/T, MMP-3 (–1171) 5A/6A ir MMP-9 (–
...
1562) C/T genotipų dažnio tyrimas 55
3.2. Matrikso metaloproteinazės ir kylančiosios aortos dilatacinė ...
patologija 58
3.2.1. MMP-2 (–735) C/T, MMP-2 (–1306) C/T, MMP-3 (–1171) 5A/6A ir MMP-9 (–1562) C/T genotipų dažnio tyrimas ligonių, operuotų dėl
...
KADP, ir referentinėje grupėse 58
3.2.2. Aortos sienos, kai yra KADP, bei kontrolinio aortos audinio ...
EMMPRIN raiškos vertinimas 59
...
3.3. AKF ir kylančiosios aortos dilatacinė patologija 61 3.4. MMP ir AKF genų variantų kombinacijų sąsajų su KADP
...
tyrimai 64
...
IV. DISKUSIJA 69
...
IŠVADOS 76
...
LITERATŪROS SĄRAŠAS 77
...
PUBLIKACIJŲ SĄRAŠAS 101
...
PADĖKA 103
...
PRIEDAI 104
SANTRUMPOS
ACTB beta-aktinas (angl. beta-actin)
AKF angiotenziną konvertuojantis fermentas AKF2 angiotenziną konvertuojantis fermentas 2 Ang-1 angiotenzinas 1
Ang-2 angiotenzinas 2 AP-1 aktyvus baltymas-1
BAV bivalvulinis aortos vožtuvas
B2M β-2 – mikroglobulinas (angl.β-2 – Microglobulin)
bp bazių poros
cDNR komplementari deoksiribonukleorūgštis
c-fos proto-onkogeno transkripcijos faktorius (angl. Finkel-Binkis- Jinkins murine osteogenic sarcoma virus)
c-jun proto-onkogeno transkripcijos faktorius
CINDI Integruota lėtinių neinfekcinių ligų profilaktikos programa (angl. Countrywide Integrated non–communicable Disease Intervention programe)
DMSO dimetilsulfoksidas (CH₃)₂SO DNR deoksiribonukleorūgštis
dNTP dezoksiribonukleozidtrifosfatai (A, C, G, T) EDTA etilendiamino tetraacetatas
EMMPRIN užląstelinis matrikso metalo proteinazių induktorius (angl.
extracellular MMPs inducer)
ETS transkripcijos faktorių šeima (angl. E-twenty six)
FAM 5’ Karboksi-fluoresceinas, fluorescencinis dažas (angl.5' Carboxy-Fluorescein)
FosB FOSB proto-onkogeno transkripcijos faktorius
gAKF gemalinė angiotenziną konvertuojančio fermento izoforma GAPDH gliceraldehido 3-fosfato dehidrogenazė (angl. Glyceraldehyde
3-phosphate dehydrogenase)
GUSB beta-gliukuronidazė (angl. β-Glucuronidase)
HAPIEE Studija “Sveikatos netolygumai ir senėjimas pereinamojo laikotarpio visuomenėse” (angl. Health, Alcohol and Psychosocial factors In Eastern Europe study) HPRT1 hipoksantin-guanin-fosforiboziltransferazė 1 (angl.
Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase 1) I71.1 ligos kodas, krūtinės aortos dalies aneurizma, plyšusi
I71.2 ligos kodas, krūtinės aortos dalies aneurizma, kai neminimas plyšimas
YWHAZ tirozino 3-monooksigenazė/triptofano 5-monooksigenazę aktyvuojantis baltymas, zeta polipeptidas (angl. tyrosine 3- monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein, zeta polypeptide)
JunB JUNB proto-onkogeno transkripcijos faktorius KADP kylančiosios aortos dilatacinė patologija kb kilobazė (1 000 bazių porų)
kDa kilodaltonai (atominis masės vienetas) LRL lygiųjų raumenų ląstelė
MMP matrikso metaloproteinazė mRNR matricinė ribonukleino rūgštis
MT-MMP membraninio tipo matrikso metaloproteinazė
NCBI Nacionalinis Biotechnologijos informacijos centras (angl.
National Center for Biotechnology Information) PAA pilvo aortos aneurizma
PEA3 polyomą aktyvinantis baltymas (angl. polyoma enhancer protein 3)
PPIA peptidil-prolyl izomerazė (angl. Cyclophilin A) PGR polimerazinė grandininė reakcija
RAS renino angiotenzino sistema
RPLO didysis 60S ribosominis baltymas (angl. 60S acidic ribosomal protein PO)
RRN18S 18S ribosominis baltymas (angl. 18S acidic ribosomal protein) sAKF somatinė AKF forma
ŠS šansų santykis
TAV trivalvulinis aortos vožtuvas
TBP transkripcijos faktoriaus IID TATA baltymas (angl.
Transcription factor IID TATA binding protein)
TIMP matrikso metalo proteinazių audinių inhibitoriai (angl. tissue inhibitors of matrix metalloproteinases)
TGF-β augimą reguliuojantis faktorius (angl. transforming growth factor-beta)
TLK tarptautinė ligų klasifikacija
TUB tubulinas, beta polipeptidas (angl. Tubulin, beta polypeptide) UBC ubikvitinas (angl. Ubiquitin)
VNP vieno nukleotido polimorfizmas Zn²⁺ cinko jonas
DNR bazių nomenklatūra
A Adeninas
C Citozinas
G Guaninas
T Timinas
Terminų žodynėlis
Referentinė grupė – [lot. referens (kilm. referentis) – pranešantis]:
selektyvi asmenų grupė, sudaryta atsižvelgiant į KADP grupės struktūrą pagal amžių ir lytį.
Referentinis genas – [lot. referens (kilm. referentis) – pranešantis]:
selektyvus genas, kurio raiška nekinta kontroliniame ir KADP aortos sienos ėminyje, ir skirtas tiriamųjų genų raiškos padidėjimui ir/arba sumažėjimui įvertinti.
ĮVADAS
! Aortos išsiplėtimas ir plyšimas yra dažniausia kylančiosios aortos patologija, kurios pagrindinis gydymo metodas yra operacinis. Deja, pastaraisiais metais stebimas šios patologijos dažnėjimas (LeMaire ir Russell, 2011) ir mirtingumo nuo jos didėjimas. Remiantis oficialiais statistikos duomenimis, kuriuos pateikė Statistikos departamento prie Lietuvos Respublikos Vyriausybės Demografinės ir migracijos statistikos poskyris 2000 metais vyrų standartizuotas mirtingumas nuo krūtinės aortos aneurizmos ir disekacijos (TLK-10, I71.1 ir I71.2) 100 000 gyventojų buvo 1,7, o 2009 metais – 2,21 (1 pav.), t.y., Lietuvos vyrų mirtingumas nuo krūtinės aortos aneurizmos ir disekacijos 2000–2009 metais padidėjo 61 proc., (p=0,006). Moterų standartizuotas mirtingumas nuo krūtinės aortos aneurizmos ir disekacijos (TLK-10, I71.1 ir I71.2) 100 000 gyventojų 2000–
2009 mažai kito (p=0,997).
0 1,00 2,00 3,00 4,00
2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 1,07 1,29 1,30 1,25 1,36 1,54
0,44 0,67
1,06 1,01 1,70
1,43 1,39 1,87
1,35 2,60
2,02 2,29 3,11
2,21
Vyrų krūtinės aortos dalies aneurizmos (I71.1-I71.2), p=0,006
Vyrų krūtinės aortos dalies aneurizmos eksponentinė patikimumo kreivė Moterų krūtinės aortos dalies aneurizmos (I71.1-I71.2), p=0,997
Moterų krūtinės aortos dalies aneurizmos eksponentinė patikimumo kreivė
1 pav. Vyrų ir moterų mirtingumas dėl krūtinės aortos dalies aneurizmos (TLK-10, I71.1 – I71.2) 2000–2009 m.
Pastaba: Duomenys gauti iš Demografinės ir migracijos statistikos poskyrio (Statistikos departamentas prie Lietuvos Respublikos Vyriausybės). TLK-10 – Tarptautinė ligų klasifikacija; I71.1 – krūtinės aortos dalies aneurizma, plyšusi; I71.2 – krūtinės aortos dalies aneurizma, kai neminimas plyšimas.
Yra žinoma, kad kylančiosios aortos plėtimąsi gali sąlygoti uždegimas (sifilinis aortitas ar gigantinių ląstelių arteritas), aterosklerozė, fibrilino geno mutacijos, sukeliančios Marfano sindromą (Francke, ir kt., 1995), įgimti kolageno pokyčiai, kurie pasireiškia Ehler-Danlos sindromu (Pepin, ir kt., 2000), augimą reguliuojančio faktoriaus (angl. transforming growth factor- beta, TGF-β) geno mutacijos, kurios lemia Loeys-Dietz sindromą (Loeys, ir kt., 2005) ar aktino geno mutacijos, sukeliančios šeiminę krūtinės aortos dilatacinę patologiją (Guo, ir kt., 2007), tačiau dažniausiai priežastys, sukėlusios krūtinės aortos plėtimąsi, lieka nežinomos. Paskutiniu dešimtmečiu pasikeitė požiūris į kylančiosios aortos dilatacinės patologijos (KADP) morfogenezę. Jei anksčiau į aortos aneurizmą buvo žiūrima kaip į
„mechaninę” problemą, atsirandančią vien tik dėl hemodinaminių veiksnių, tai dabar pripažįstama, kad tai yra sudėtingas biologinis procesas (Thompson, ir kt.,2002), kuriame ypač svarbus vaidmuo tenka aortos medijos lygiųjų raumenų ląstelėms bei pakitusiai užląstelinei medžiagai.
Nustatyta, kad formuojantis aortos sienos aneurizmai ar jos disekacijai, medijos elastines ir kolageno skaidulas ardo proteazės, priklausančios matrikso metaloproteinazių (MMP) šeimai (Ishii, ir kt., 2000; Kadoglou, ir kt., 2004). Jas pradeda gaminti aortos medijos lygiųjų raumenų ląstelės (LRL), kai jų fenotipas pasikeičia iš kontrakcinio į sintezinį (Kamijima, ir kt., 1999; Lesauskaitė, ir kt., 2001). Priežastys, dėl ko keičiasi LRL fenotipas, yra nežinomos. Siekiant jas nustatyti tiriami aortos dilatacinės patologijos formavimosi ląsteliniai ir molekuliniai mechanizmai.
Šiuolaikiniai molekulinės biologijos tyrimai leidžia nustatyti genų mutacijas, sąlygojančias baltymo raiškos pokyčius transkripcijos ir transliacijos lygmenyse, bei formuojantis KADP, įvertinti jų įtaką patologinių procesų morfogenezei. Tuo požiūriu yra tiriamos MMP raiškos padidėjimo priežastys ir mechanizmai. Transkripcijos lygyje MMP raiška gali priklausyti nuo geno promotoriaus mutacijų bei įvairių transkripcijos faktorių (Sternlicht ir Werb, 2001). Didelį susidomėjimą kelia eksperimentiniai darbai, įrodantys renino-angiotenzino sistemos (RAS) sąsajas su MMP sistema (Wang, ir kt., 2005). Nustatyta, kad Ang-2 aktyvina transkripcijos faktorius, o pastarieji sužadina MMP raišką (Browatzki, ir kt., 2005). Tai skatina kompleksiškai tirti RAS bei MMP sistemos narių įtaką aortos sienos remodeliavimuisi, formuojantis KADP, bei šiuos duomenis verifikuoti klinikiniais tyrimais. Tikimės, kad šių mechanizmų pažinimas taps pagrindu naujų KADP diagnostikos ir gydymo metodų paieškai.
Mokslo darbo tikslas ir uždaviniai
Darbo tikslas – įvertinti veiksnių, darančių įtaką matrikso metalo proteinazių (MMP-2, MMP-3, MMP-9) ir angiotenziną konvertuojančių fermentų raiškai, reikšmę kylančiosios aortos dilatacinės patologijos morfogenezei.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti matrikso metalo proteinazių (MMP-2 (–735) C/T, MMP-2 (–1306) C/T, MMP-3 (–1171) 5A/6A, MMP-9 (–1562) C/T) bei angiotenziną konvertuojančio fermento (AKF I/D) transkripciją didinančių genotipų dažnį atsitiktinėje 45–74 metų Kauno miesto gyventojų imtyje.
2. Įvertinti matrikso metalo proteinazių transkripciją didinančių (MMP-2 (–735) C/T, MMP-2 (–1306) C/T, MMP-9 (–1562) C/T), MMP-3 (–1171) 5A/6A) genų polimorfizmo bei aortos sienos užląstelinio matrikso metaloproteinazių induktoriaus EMMPRIN raiškos sąsajas su KADP.
3. Įvertinti angiotenziną konvertuojančio fermento transkripciją didinančio geno polimorfizmo (AKF I/D) bei aortos sienos AKF ir AKF2 raiškos sąsajas su KADP.
4. Nustatyti MMP-2 (–735) C/T, MMP-2 (–1306) C/T, MMP-3 (–1171) 5A/6A, MMP-9 (–1562) C/T) bei AKF I/D genotipų derinių įtaką KADP susiformavimui.
Darbo mokslinis naujumas
Šis mokslinis tyrimas leidžia detaliau įvertinti molekulinius kylančiosios aortos dilatacinės patologijos (KADP) morfogenezės mechanizmus. Tai pirmasis darbas, kuriame kompleksiškai, panaudojant molekulinės genetikos ir audinio tyrimo metodikas, nagrinėjamos renino-angiotenzino bei MMP sistemų įtaka KADP atsiradimui.
! Pirmą kartą buvo nustatytas atsitiktinės Lietuvos gyventojų imties (n=1128) MMP-2 (–735) C/T, MMP-2 (–1306) C/T, MMP-3 (–1171) 5A/
6A ir MMP-9 (–1562) C/T genotipų dažnis. Šie duomenys naudojami vertinant širdies kraujagyslių ligų, piktybinių navikų eigos prognozavimo genetinius veiksnius.
Nustatėme, kad KADP ir referentinės grupės asmenų MMP-2 (–735) C/
T, MMP-2 (–1306) C/T, MMP-3 (–1171) 5A/6A ir MMP-9 (–1562) C/T genotipų dažnis statistiškai patikimai nesiskyrė. Galima teigti, kad MMP genų polimorfizmas tiesioginės įtakos aortos medijos LRL fenotipo pokyčiams neturi, tačiau svarbi yra padidėjusi aortos medijos LRL užląstelinio MMP induktoriaus EMMPRIN raiška. Tai leidžia suformuluoti hipotezę, kad EMMPRIN, būdamas MMP transkripcijos faktoriumi (Attia, ir kt., 2010), gali indukuoti LRL pasikeitimą iš kontraktilinio į sintezinį tipą ir didesnę MMP raišką. Šios hipotezės patvirtinimas reikalauja tolimesnių tyrimų.
Mūsų darbe pirmą kartą nustatytos apsauginės genų variantų kombinacijos, statistiškai patikimai mažinančios KADP galimybę. Jas sudaro mažesnę AKF raišką sąlygojantis I/I genotipas deriniuose su mažesnę MMP-2, MMP-3, MMP-9 raišką sąlygojančiais genotipais (atitinkamai MMP-2 (–1306) C/T, MMP-3 (–1171) 6A/6A ir MMP-9 (–1562) C/C). Priešingai, didesnę genų raišką sąlygojančios genotipų kombinacijos, t.y. AKF D/D ir MMP-2 (–735) C/C, MMP-2 (–1306) C/C ir MMP-3 5A/5A, reikšmingai didina KADP galimybę. Šie duomenys patvirtina renino-angiotenzino ir MMP sistemos svarbą KADP morfogenezei. Taip pat nustatėme, kad aortos sienoje, kai yra KADP, yra didesnė AKF2 mRNR ir baltymo raiška lyginant su kontroliniu aortos sienos audiniu. Iki dabar duomenų apie AKF2 vaidmenį KADP morfogenezei nebuvo paskelbta.
I. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Matrikso metaloproteinazės, jų klasifikacija, struktūra ir aktyvumo reguliacija
Matrikso metaloproteinazės (MMP) – tai proteoliziniai fermentai, sudarantys didelę, nuo cinko ir kalcio jonų priklausomą endopeptidazių šeimą. MMP ir kolagenazės buvo atrastos 1962 m. mokslininkų Gross ir Lapier (1962), kurie nustatė, kad, vykstant buožgalvių uodegų pokyčiams, juose sintetinamas fermentas, ardantis fibrilinį kolageną. Šiuo metu nustatytos 28 skirtingos proteinazių rūšys, iš jų 23 – proteinazių rūšys aptinkamos žmoguje bei 24 – proteinazių rūšys pelėse (Page-McCaw, ir kt., 2007). MMP klasifikuojamos numeriais (nuo MMP-1 iki MMP-28), o pagal struktūrines ypatybes ir skaidomus substratus skirstomos į šeimas:
kolagenazes, želatinazes, stromelizinus, matrilizinus, membraninio tipo MMP (1.1.1 pav.). Šių šeimų fermentai dalyvauja įvairiuose procesuose:
kolagenazės dalyvauja persitvarkant kolageniniam užląsteliniam matriksui, ardo fibrilinį kolageną; želatinazės skaido želatiną; stromelizinai skaido bazinės membranos komponentus, taip pat fibronektiną ir net nefibrilinį kolageną; matrilizinai dalyvauja ankstyvoje naviko genezėje; membraninio tipo MMP skaido želatiną, fibronektiną, lamininą. Šie fermentai skaido ir modifikuoja beveik visus užląstelinio matrikso komponentus (Chakraborti, ir kt., 2003). Pagrindinės MMP savybės:
1. Ardo užląstelinio matrikso komponentus;
2. Sekretuojamos latentinės formos, reikalauja aktyvacijos proteoliziniam aktyvumui;
3. Veikia, kai yra neutralus pH;
4. Kiekviena MMP turi specifišką inhibitorių;
5. Šių fermentų katalizinio domeno metalo jonas būtinas MMP aktyvumui;
Nustatyta, kad yra 24 skirtingi genai, koduojantys MMP šeimai priklausančias proteazes. Šių proteolizinių fermentų pirminę struktūrą sudaro mažiausiai trys homologiški baltymo domenai: signalinis peptidas – tai domenas, atsakingas už fermentų sekreciją; propeptidas, kuris pašalinamas, kai fermentas tampa aktyvus; katalizinis domenas, kuriame yra Zn²⁺ jonas, būtinas fermentiniam aktyvumui. Želatinazių katalizinis domenas yra unikalus ir skiriasi nuo kitų MMP tuo, kad jo sudėtyje yra trys fibronektinai. Įdomu tai, kad šis domenas suformuoja kolageno prisijungimo
