INTRODUZIONEMateriali e MetodiRISULTATI E CONCLUSIONI

0.03 23 .15 71-15 De er 1180 3S ier o 71 -16 C86vacci nale A MV 39C B .95 R HZ0602 KS86-1ncp M171N .95 ZM.95 C P .7 5 NADL SUWACp 16.111 M65 7G X. 95 ncp2 AQGN96BI 5 TJ06_BJ0702 24 .15 OSLOS S M079B .91 P 28.1 KM SD.1 F SD0803 M65C K.96 71-03 20.V661.2 05.26 05 .15 L 11803Isolato G M06 5B.9 3 J Rebe 3186 V 6 3 4 6 1 2 3 5 2 3 5 1 1 1 1 3 2 2 3 2 9 1 2 4 3 5 7 8 3 1 1 2 4 1 2 1 1 4 1 2 1 1 2 1k 1l 1e 1n 1i 1a 1c 1j 1b 1m 1p 1o 1new 1h 1d 1f 1q 1g

Quest'opera è stata rilasciata sotto la licenza Creative Commons Attribuzione-Non commerciale-Non opere derivate 2.5 Italia.

Per leggere una copia della licenza visita il sito web http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.5/it/ o spedisci una lettera a Creative Commons, 171 Second Street, Suite 300, San Francisco, California, 94105, USA.

Stampato a cura dell'Unità Operativa di Supporto Biblioteca, Informazione, Editoria (2013).

Key words: BVDV, Pestivirus, caratterizzazione genetica. ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE

DELL’UMBRIA E DELLE MARCHE-PERUGIA

Virus - Lo stipite virale in questione è stato isolato presso i laboratori dell’IZS delle Venezie sulla linea cellulare MDBK, da un campione di sangue precolostrale di un

vitello nato in stalla da un allevamento che veniva monitorato verso i più comuni agenti abortigeni del bovino per avere presentato nei mesi precedenti casi di aborto non diagnosticati. In allevamento veniva applicata in modo regolare ed a cadenza semestrale una profilassi vaccinale per BVD con un vaccino inattivato.

Caratterizzazione genetica - La caratterizzazione genetica è stata effettuata sia a partire dal materiale originale, sia dal terreno colturale infetto. L’RNA totale è stato

estratto mediante il QIAamp Viral RNA mini Kit (QIAGEN). La sintesi del cDNA è stata effettuata utilizzando dei random primers. Lo studio filogenetico è stato effettuato

attraverso analisi di sequenza della regione parziale 5’-UTR e della regione Npro. La regione 5’-UTR è stata amplificata utilizzando la coppia di primers 324/326 che amplifica

un frammento di 288 bp. Per la amplificazione del gene Npro è stata usata una nested PCR condotta utilizzando i primers esterni OI 100 and OL 1400R e i primers interni BD1 e BD3 che amplificano un frammento di 390 bp. Gli amplificati sono stati purificati e sequenziati mediante il kit Big Dye Terminator v1.1 Cycle Sequencing, basato sull’incorporazione di dideossinucleotidi marcati, utilizzando il sequenziatore ABI Prism 3130 DNA Sequencing System. Le sequenze nucleotidiche, allestite da tre diversi

amplificati, sono state allineate mediante il software ClustalX2 con sequenze di stipiti di riferimento presenti in GenBank e rappresentative di ciascun genotipo noto. L’albero

filogenetico è stato costruito utilizzando l’algoritmo di neighbour-joining con il pacchetto MEGAv3.1. L’analisi di bootstrap è stata condotta su 10.000 replicati.

Sulla base dei risultati ottenuti, si è potuta accertare la appartenenza del virus in questione ad un gruppo genetico mai descritto in precedenza e divergente da quelli sino ad oggi conosciuti, con evidenti implicazioni per la classificazione.

I risultati del presente lavoro confermano inoltre ulteriormente la elevata diversità genetica del BVDV nel nostro paese. Ciò è da ascrivere all’assenza di misure di controllo e/o eradicazione dell’infezione da BVDV su vasta scala, con l’eccezione di poche iniziative a livello regionale, es. Veneto. In tale contesto il commercio e la movimentazione degli animali espongono gli allevamenti ad un elevato rischio di introduzione del BVDV

come pure all’insorgenza di nuove varianti contraddistinte da una sempre più elevata diversità genetica.

Ciò pone anche importanti interrogativi sull’attuale impiego dei vaccini. E’ infatti noto che i tradizionali vaccini che occupano la più ampia fascia di

mercato in Italia contengono per lo più i soli genotipi BVDV-1a e BVDV-1b. E’ lecito pertanto chiedersi se siano in grado di proteggere totalmente nei

confronti di genotipi circolanti geneticamente divergenti da quelli in essi contenuti. A tale proposito, è bene sottolineare come, nell’allevamento in

questione, venisse regolarmente applicata la profilassi vaccinale per BVD, senza peraltro impedire l’introduzione della variante virale.

Figura 2 - Albero filogenetico costruito utilizzando la regione N-pro di BVDV La diarrea virale del bovino (BVD) è una delle malattie economicamente più rilevanti della specie bovina.

L’agente causale è un virus ad RNA (BVDV) appartenente alla famiglia Flaviviridae, genere Pestivirus.

Allo stato attuale, se ne conoscono tre specie, il BVDV di tipo 1 (BVDV-1), di tipo 2 (BVDV-2) e di tipo 3 (BVDV-3).

Di questi, il BVDV-1, il più diffuso in Europa, è distinto in almeno 17 subgenotipi contraddistinti dalle lettere dell’alfabeto (da BVDV-1a a BVDV-1q).

In Italia, studi di genotipizzazione a carico di BVDV circolanti, hanno dimostrato la presenza di almeno 10 subgenotipi diversi (BVDV1a, BVDV1b, BVDV1d, BVDV1e, BVDV1f, BVDV1g, BVDV1h, BVDV1j, BVDV1k, BVDV1l) a conferma della elevata eterogeneità genetica del BVDV.

La caratterizzazione genetica di questo virus si avvale delle moderne tecniche di analisi di sequenza a carico delle regioni del genoma 5’-UTR, Npro

ed E2. Nel presente studio viene descritta la caratterizzazione di un isolato BVDV circolato nel nord Italia.

Figura 1 - Albero filogenetico costruito utilizzando la regione 5’UTR di BVDV

con il patrocinio di 0.02 Buff alo-A1 CH -SM01 11803Si ero L 71 -15 519 Deer -GB1 721 ZM -95 SH9 23-15 IS25CP B44006 M -M T-00 J BJ0701 11803Isolato Bu ff_al oe s SD-1 AsturZ-36 P G NADL OSLOSS 26 -V6 39 W A 71-03 V360 F So-C P75 Deer-NZ1 N Y-1 C86va cci nal e 71-16 SD080 3 1k 1l 1e 1n 1i 1a 1c 1j 1b 1m 1o 1new 1h 1d 1g 1q 1p 1f BVDV-1 - subgenotipi a b c d e f g h i j k l m n o p q 5’NTR 84.40-85.60 82.30-86.40 86.40 85.60 82.80-85.20 86.00-86.80 85.20-87.60 85.20-86.00 82.00 85.60-85.90 84.00-84.40 80.50-81.30 83.50-84.80 85.20 85.90 87.90-88.30 81.50 new N-pro 69.60-76.30 74.20-79.00 69.60-74.20 69.60-74.50 71.70-76.30 81.10-85.60 75.60-79.70 74.90-79.00 73.10-77.30 71.70-74.90 71.60-73.70 71.30-77.20 75.90-80.8 70.20-73.00 75.10-77.90 73.40-77.90 75.50-79.30 new Tabella 1 - Percentuale di

similarità con i diversi

subgenotipi di BVDV1

INTRODUZIONE

Materiali e Metodi

RISULTATI E CONCLUSIONI

come in base all’analisi

filogenetica effettuata a carico delle sequenze

5’-UTR ed Npro, il virus

non si collochi all’interno

di nessun cluster noto ma va a configurare un gruppo genetico distinto (Figure 1 e 2, Tabella 1)

con percentuali di

similarità in 5’-UTR del

80,5-88,3% e in Npro del 69,9-85-6%, con gli

altri subgenotipi