Maurizio Ruscio
“Azienda Sanitaria Universitaria Integrata di Trieste”
“Due to the complex characteristics of the pathogen, indirect pathogen
detection using serological methods continues to play a pivotal role in the diagnosis of Lyme borreliosis”
GMS German Medical Science 2017, Vol. 15, ISSN 1612-3174
Dinamica anticorpale (variabile)
o Fattori proinfiammatori o Dose di inoculo
o Patogenicità del ceppo
IgM+ nel 10-50%
Aguero, 2005
The genome is quite small (approximately 1.5
megabases) and consists of a linear chromosome of 910 kilobases as well as
9 linear and 12 circular plasmids.
Fraser, 1997
The organism has few proteins with biosynthetic activity
The only known virulence factors of B.b. are surface proteins (OSP A-F) that allow the spirochete to attach to mammalian cells
Borrelia burdorferi sensu lato
La Borrelia burgdorferi sl
Borrelia afzelii Borrelia garinii
Borrelia burgdorferi ss Borrelia bavariensis Borrelia spielmanii Borrelia bisettii
Borrelia valaisiana Borrelia lusitaniae
Borrelia japonica, tanukii, turdae, sinica
Borrelia andersonii Borrelia miyamotoi
Borrelia lonestari
Patogenesi
Patogenesi
1. Strategie di evasione del patogeno
. proteine salivari dell’Ixodes
. maschera la superficie cellulare con proteine o inibitori dell’ospite o dell’Ixodes
. modifica l’espressione fenotipica delle Osp . fattore H forma resistenza al complemento
. si lega al plasminogeno (collageno, fibronectina, laminina)
Patogenesi
2. Risposta immunitaria dell’ospite
. risposta dell’immunità riconosce le Osp (lipoproteine) con attivazione sistema del complemento, cell bersaglio
(macrofagi , cell dendritiche) con produzione di cytokine
. con la progressione dell’infezione c’è l’attivazione T helper e B linfociti con produzione di ac specifici
Le manifestazioni della malattia di Lyme
mesi anni
Ad eccezione dell'EM, tutte le altre
manifestazioni della LD richiedono i test sierologici per confermarne la diagnosi.
La corretta interpretazione dei risultati dipende dal quadro sindromico,
dall'anamnesi e dal tempo trascorso tra il suo esordio e l’esecuzione dei test.
mesi anni
Le manifestazioni della malattia di Lyme
mesi anni
Le manifestazioni della malattia di Lyme
mesi anni
Le manifestazioni della malattia di Lyme
Wilking H, et al.
Antibodies against Borrelia burgdorferi sensu lato among Adults, Germany, 2008-2011. Emerging Infect Dis. 2015
I test sierologici per LD e la loro evoluzione
Prima del 1995: ELISAs
whole-cell sonicate (WCS) parzialmente purificato o proteine ricombinanti Bb sl
IFAs
Western blot (WB)
I test sierologici in Europa
• Non sottostanno a nessuna forma di validazione clinica
• Market annovera molti kit diagnostici
• Varietà preparazione Ag (estrattivi, ricombinanti, misti) con differenti performances analitiche
• Alto grado di variabilità dei risultati
Müller I et al. Evaluating frequency,
diagnostic quality, and cost of Lyme borreliosis testing in Germany: a retrospective model analysis.
Clin Dev Immunol.2012
I test sierologici in Europa
• Scarsa standardizzazione
• Scarsa armonizzazione tra risultati di Laboratori diversi
• Bassa adesione a CQ
Hunfeld KP, et al. Quality of Lyme disease serology. Lessons from the German Proficiency Testing Program 1999-2001. A preliminary report. Wien Klin Wochenschr. 2002
L’evoluzione dei test sierologici per LD anni 2000
CLIA – proteine e/o preptidi sintetici immunodominanti
specifiche e conservate tra B.burgdorferi sl
L’evoluzione dei test sierologici per LD
VLsE (Variable major protein – Vmp 35 kDa)
o Ag espresso nel mammifero o Forte risposta immunitaria o Immunoevasione
Il complesso VlsE è formato da 3 domini definiti: 2 regioni costanti ai terminali COOH e NH2; 1 regione VARIABILE interna
L’evoluzione dei test sierologici per LD
VLsE (Variable major protein – Vmp 35 kDa)
C6 (VLsE – IR6 epitopo immunodominante) ricombinante 26 aminoacidi ELISA
L’evoluzione dei test sierologici per LD
VLsE (Variable major protein – Vmp 35 kDa)
C6 (VLsE – IR6 epitopo immunodominante) ricombinante 26 aminoacidi ELISA
OspC (Outer surface protein C 23 kDa) pepC10 (kinetic ELISA)
(rVLsE/pepC10) e OspC1
Interpretation criteria
Ag
IgG: positive if >=5 bands of the following are present:
p18,p23,p28,p30,p39,p41,p45,p58,p66, p93
IgM: positive if >=2 bands of the following is/are present:
p23 OspC, p39 BmpA, p41
Dresler et al, Engstrom et al.
Two-tier test algoritm (TTTA)
GMS German Medical Science 2017, Vol. 15, ISSN 1612-3174
Infezione primaria
IgG
IgM
WB - Borrelia
LIMITAZIONI : soggettività dell‘interpretazione (specie IgM) costi e tempi di refertazione
L’evoluzione dei test sierologici per LD
ELISAs –WCS
Wormser, 2012
Thell 2016 mod
Wormser, 2012
Ledue, 2008
Bacon, 2003
Un approccio alternativo
Un approccio alternativo
Thell 2016 mod
I pitfalls nell’interpretazioni dei risultati
• window period
• esame post-trattamento
• background seropositivity
• re-infezione
• utilizzo dei test per sorveglianza vs diagnosi
• home tests
Richiesta del test
In presenza di un ragionevole
sospetto clinico
Pretest probability
I. manifestazioni cliniche
II. epidemiologia nell’area interessata III. attività svolte
IV. stagionalità (-)
V. morso di zecca (1/3)
Bayes’ Theorem
predictive values of the test
accuracy (sensitivity and specicficity) pretest likelihood (prior probability)
take-home message
La diagnosi di LD è una diagnosi clinica La sola positività del test sierologico non
significa LD
I test sierologici hanno un forte potere predditivo negativo in pazienti
immunocompetenti con sintomi protratti La presenza di sole IgM anti Bb ha scarso
valore predditivo positivo in pazienti immunocompetenti con sintomi protratti
Nuovi approcci
Multiplex assays (10 Ag- Luminex tecnology)
Metabolomics LC-MS (modello statistico) metabolic profile 44 molecole lipofile e lipidi
(<1500 kD)(Sensibilità 88% vs 48% di TTTA) ( Molins, 2015)
Immuno-PCR (iPCR)
magnetic bead-C6-ac paziente-reporter ac-oligonucleotide tag
