LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
Andrius Bogdelis
BALTYMŲ KINAZIŲ IR KITŲ
SIGNALINIŲ MOLEKULIŲ ĮTAKA
ŠIRDIES MIOCITŲ
L TIPO KALCIO SROVEI
Daktaro disertacija Biomedicinos mokslai,
biofizika (02 B)
Disertacija rengta 2006-2010 m. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Kardiologijos institute.
Mokslinis vadovas
prof. dr. Vytenis Arvydas Skeberdis (Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, biofizika – 02 B)
Konsultantas
prof. dr. Jonas Jurevičius (Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, biofizika – 02 B)
TURINYS
SANTRUMPOS ... 5
ĮVADAS ... 7
1. DARBO TIKSLAS, UŽDAVINIAI IR MOKSLINIS NAUJUMAS ... 10
2. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12
2.1. Širdies ląstelės ... 12
2.2. L-VDCC apibūdinimas ir jų laidumo valdymas ... 14
2.3. Bazinė ICa,L ir jos reguliavimo elementai bei mechanizmai ... 15
2.3.1. β-drenerginiai receptoriai ... 16 2.3.2. Muskarininiai receptoriai ... 18 2.3.3. G baltymai ... 19 2.3.4. Adenililciklazė ... 20 2.3.5. cAMP ... 21 2.3.6. Fosfodiesterazės ... 21
2.3.7. Baltymų kinazė A... 22
2.3.8. Baltymų fosfatazės ... 23
2.3.9. Src-nPTK ... 23
2.3.10. Baltymų kinazė C ... 26
2.3.11. Erdvėskyra ... 27
3. MEDŽIAGOS IR TYRIMO METODAI ... 28
3.1. Miocitų išskyrimui ir elektrofiziologiniams eksperimentams naudoti tirpalai ... 28
3.2. Žmogaus širdies miocitų išskyrimas ... 29
3.3. Žiurkės širdies skilvelio miocitų išskyrimas ... 31
3.4. Varlės širdies skilvelio miocitų išskyrimas ... 33
3.5. L tipo Ca2+ srovės registracija ... 34
3.6. Širdies raumenėlių elektromechaninių parametrų registracija ... 36
3.7. Duomenų pateikimas ir statistinis įvertinimas ... 37
3.8. Reagentai... 37
4. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 39
4.1. Bazinės ICa,L tyrimas ... 39
4.1.1. Varlės skilvelių miocitų β-AR signalinės grandinės elementų bazinis aktyvumas ... 39
4.1.2. Žiurkės skilvelių miocitų β-AR signalinės grandinės elementų bazinis aktyvumas ... 42
4.1.3. Žmogaus prieširdžių miocitų β-AR signalinės grandinės elementų
bazinis aktyvumas ... 44
4.2. Bazinės ICa,L tyrimo rezultatų aptarimas ... 48
4.3. β3-AR poveikio žmogaus prieširdžių ICa,L ir susitraukimo jėgai tyrimas ... 49
4.3.1. β3-AR agonistai didina žmogaus prieširdžių miocitų ICa,L ... 49
4.3.2. β3-AR agonistai nedidina varlės skilvelio kardiomiocitų ICa,L ... 50
4.3.3. β3-AR agonistai nedidina žiurkės skilvelio miocitų ICa,L ... 53
4.3.4. β3-AR agonistai didina žmogaus prieširdžio miocitų ICa,L, specifiškai aktyvuodami β3-AR ... 54
4.3.5. NO kelias nedalyvauja β3-AR reguliuojant žmogaus prieširdžių miocitų ICa,L ... 56
4.3.6. β3-AR stimuliuoja žmogaus prieširdžių ICa,L PKA fosforolinimo būdu ... 57
4.3.7. β3-AR agonistai stimuliuoja žmogaus prieširdžio trabekulų susitraukimo jėgą ... 58
4.4. β3-AR poveikio žmogaus prieširdžių ICa,L ir susitraukimo jėgai aptarimas ... 62
4.5. Src-nPTK poveikio žmogaus prieširdžių miocitų ICa,L tyrimas ... 65
4.5.1. PP-1 poveikis bazinei ir ISO stimuliuotai ICa,L ... 65
4.5.2. Ar Gαs gali tiesiogiai aktyvinti Src-nPTK? ... 68
4.6. Src-nPTK poveikio žmogaus prieširdžių miocitų ICa,L aptarimas ... 70
4.6.1. Src-nPTK aktyvavimas ir veikimo būdas ... 70
4.6.2. Src-nPTK veikimo vieta ... 70
4.6.3. Src-nPTK aktyvinimo kelias žmogaus prieširdžių miocituose ... 71
4.7. PKC poveikio žmogaus prieširdžių ICa,L tyrimas ... 72
4.8. PKC poveikio žmogaus prieširdžių ICa,L aptarimas ... 73
5. IŠVADOS ... 75
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 77
7. MOKSLINĖS PUBLIKACIJOS ... 98 8. PADĖKA ... Error! Bookmark not defined.
SANTRUMPOS
AC – adenililciklazė (arba adenilatciklazė) ACh - acetilcholinas
AKAP – A-kinazės inkarinis baltymas β-AR – beta adrenerginis receptorius
[Ca2+]i - Ca2+ koncentracija ląstelės citoplazmoje
Cal A - kalikulinas A
cAMP – ciklinis adenozin -3’,5’-monofosfatas cGMP – ciklinis guanozin -3’,5’-monofosfatas Src - nereceptorinės PTK šeimos narys
DAG - diacilglicerolis Emaks. - maksimalus poveikis
EC50 - koncentracija, reikalinga sukelti pusę maksimalaus stimuliuojamojo
poveikio
GPCR – su G baltymų besijungiantis receptorius IBMX - 3-izobutil-1-metilksantinas
ICa,L – Ca2+ jonų srovė, tekanti L tipo Ca2+ kanalais
Ins(1,4,5)P3 - inizitoltrifosfatas
ISO – izoprenalinas (1-[3’,4’-dihidrofenil]-2-izopropilamino etanolio hidrochloridas)
Kd – medžiagos koncentracija, reikalinga sukelti pusę slopinamojo poveikio
L-VDCC – įtampą valdomas L tipo kalcio jonų kanalas M - muskarininis receptorius
mAKAP - A-kinazės inkarinis baltymas mAKAP NO – azoto (II) oksidas
PDE – fosfodiesterazės
PI(4,5)P2 – inozitolfosfatidil-4,5-difosfatas PKA – baltymų kinazė A
PKC - baltymų kinazė C PKG - baltymų kinazė G PP – baltymų fosfatazė PP 1 - fosfotazė 1 PP 2A - fosfotazė 2A
PTK - baltymų tirozino kinazė PTP – baltymų tirozino fosfotazė
Src-nPTK – src šeimos nereceptorinė baltymų tirozino kinazė TPA - 12-O-tetradekanoilforbol-13-acetatas
VGSC - nuo įtampos priklausomas greitasis Na+ kanalas VSM – varlės skilvelių miocitai
ŽSM – žiurkės skilvelių miocitai ŽPM – žmogaus prieširdžių miocitai
Regentas Poveikis
ACh AC slopiklis
Cal A Balymų fosfatazių (PP1 ir PP2A) slopiklis Karbacholis AC slopiklis
cPKA PKA katalitinis subvienetas
BRL37344 β3-AR agonistas
Forskolinas Tiesioginis AC aktyviklis
IBMX Plataus veikimo neselektyvus PDE slopiklis ISO Neselektyvus β-AR agonistas
H-89 Per membraną prasiskverbiantis PKA slopiklis
L-NMMA NOS slopiklis
Nadololas β1-AR ir β2-AR antagonistas
PKI(15-22) Peptidinis PKA slopiklis PP1 Selektyvus Src-nPTK slopiklis Propranololas β-AR inversinis agonistas Serotoninas 5-HT4 receptorių aktyviklis
TPA PKC aktyviklis
CGP12177 Dalinis β3-AR agonistas, β2-AR antagonistas ir dalinis β1-AR
agonistas, veikiantis per mažo gyminingumo vietas L-748,337 β3-AR antagonistas
ĮVADAS
Širdies sinusiniame mazge generuojami elektriniai impulsai sklinda laidžiąja sistema [1, 2] ir sukelia ritminius širdies susitraukimus. Sinusinio mazgo [3] ląstelės neturi stabilaus ramybės potencialo. Jos nuolat spontaniškai depoliarizuojasi iki slenkstinio lygio – dažnį reguliuojamojo potencialo (angl.
„pacemaker potential“), kurį pasiekus sukeliamas veikimo potencialas [4].
Kiekvienas veikimo potencialas toliau keliauja laidžiąja sistema ir per plyšines jungtis [5, 6] sužadina gebančias susitraukti širdies ląsteles miocitus [7]. Skirtingai nuo sinusinio mazgo ląstelių sveiki širdies miocitai turi stabilų ramybės potencialą, kuris yra apie ~ -80 mV. Kai miocito plazminė membrana (sarkolema) per plyšines jungtis iš kaimyninių ląstelių depoliarizuojama iki ~-60 mV [8-10], atsidaro sarkolemos greitieji Na+ kanalai [9], kurie sukelia greitą sarkolemos depolirizaciją ir suformuoja priekinį veikimo potencialo frontą. Per kelias milisekundes greitieji Na+ kanalai inaktyvuojasi ir Na+ įtekėjimas sumažėja [11]. Netrukus atsidaro tam tikri K+ kanalai ir K+ jonai pradeda ištekėti iš ląstelės, sukeldami nežymią membranos repoliarizaciją, po kurios prasideda plato fazė [9]. Jos metu palaikomas ląstelės potencialas ~ 0 mV. Tai vyksta iš dalies dėl įtampos valdomų lėtųjų L tipo Ca2+ kanalų (L-VDCC)
atsidarymo [7, 9, 12], kurio metu iš ląstelės išorės į ląstelės vidų patenkantis Ca2+ sukelia dar didesnį Ca2+ jonų įtekėjimą į ląstelės sarkoplazmą iš ląstelės viduje esančio sarkoplazmino tinklo per Ca2+ aktyvinamus rianodino kanalus [13, 14]. Ca2+ jonų koncentracios ląstelių sarkoplazmoje padidėjimas daugiau nei tam tikra riba sukelia kardiomiocitų susitraukimą [15]. Kadangi K+ jonų ištekėjimas subalansuoja Ca2+ įtekėjimą, sarkolemos depoliarizacija plato fazėje yra stabili [9]. Ramybės potencialo atsikūrimas (repoliarizacija) vyksta dėl Ca2+ kanalų užsidarinėjimo ir K+ jonų ištekėjimo kai papildomi nuo įtampos
priklausomi K+ kanalai atsidaro. Po to prasideda refrakcijos laikotarpis, kai
kitas širdies ląstelės susitraukimas negali būti sukeliamas (1 pav.).
Kaip minėta, Ca2+ jonų koncentracijos ląstelių sarkoplazmoje padidėjimas daugiau nei tam tikra riba sukelia kardiomiocito susitraukimą. Šio mikroproceso iniciatoriai yra L-VDCC. Jų atsidarymas gali vykti skirtingais režimais, tai turi įtakos kardiomiocito kontraktilinėms savybėms. Organizmo, kaip visumos, požiūriu širdies susitraukimų dažnį reguliuoja šie mechanizmai: autonominė reguliacija (proprioreceptoriai, chemoreceptoriai, baroreceptoriai, nervas širdies paleidėjas ir vagus nervas), cheminė reguliacija (hormonai, jonai,
pH, mažas deguonies kiekis) ir kiti faktoriai (amžius, lytis, fizinis pajėgumas ir kūno temperatūra) [16].
1 pav. L-VDCC reguliuojamųjų signalinių molekulių išsidėstymas bei veikimo
potencialo ir susitraukimo formavimasis. Pastaba:beta adrenerginis receptorius (β-AR); stimuliuojantis G baltymas (Gαs); antro tipo muskarininis receptorius (M2); slopinantis G
baltymas (Gαi); adenilatciklazė (AC); baltymų kinazė A (PKA); PKA inkarinis baltymas (AKAP); Ca2+ jonų srovė, tekanti per L tipo Ca2+ kanalus (ICa,L); rianodinui jautrūs sarkoplazminio tinklo Ca2+ kanalai (RyR); sarkoplazmonis tinklas (SR); fosfolombanas (PLB);
veikimo potencialas (AP); laisvo kalcio koncentracija ląstelėje ([Ca]i). Modifikuota pagal Bers [7]
ICa,L yra pagrindinis širdies susitraukimo iniciatorius ir moduliatorius [7,
17]. Todėl labai svarbu suvokti, kaip jos amplitudę reguliuoja baltymų kinazės ir kitos signalinės molekulės. Vienas pagrindinių signalinių kelių, reguliuojančių ICa,L amplitudę, yra β-AR/cAMP signalinė grandinė, sukelianti
L-VDCC fosforilinimą per PKA. Pagrindiniai β-AR/cAMP signalinės grandinės elementai yra Gαs baltymai, AC, cAMP ir PKA [7] (1 pav.). Šią
grandinę taip pat veikia ir M receptoriai, per Gαi baltymus slopindami AC
veiklą ir kartu L-VDCC aktyvumą [18-20]. Ši signalinė grandinė turi savo bazinį aktyvumą, kurį apibūdina per L-VDCC tekanti Ca2+ srovė, kai kardiomiocitas neveikiamas jokių medžiagų [15]. Tuo metu esanti baltymų kinazių ir kitų signalinių molekulių aktyvumo pusiausvyra nepakankamai ištirta ir juolab nepalyginta tarp skirtingų gyvūnų rūšių. Šių baltymų kinazių ir kitų signalinių molekulių aktyvumo pusiausvyros ištyrimas gali atskleisti gaires, pagal kurias būtų galima įvertinti širdies veiklos sutrikimus. Taigi, šios studijos metu mes tyrėme ir lyginome skirtingų gyvūnų rūšių bazinius baltymų kinazių ir signalinių molekulių aktyvumus.
Buvo klonuoti trys β-AR tipai (β1-AR, β2-AR, ir β3-AR), tačiau
katelocholaminų poveikis žmogaus širdyje iš esmės priskiriamas tik β1-AR ir
β2-AR. Be tiesioginio poveikio širdies susitraukimo jėgai jie turi įtakos
hipertrofijai [21, 22] ir apoptozei [23, 24], o jų svarba varijuoja priklausomai nuo širdies audinio, patofiziologijos stadijos, amžiaus ar raidos [25]. Tačiau β3
-AR ekspresija žmogaus miokarde taip pat buvo įrodyta tiek mRNA [26, 27], tiek baltymų lygmenyje [27, 28] [29, 30]. Taip pat kaip β1-AR ir β2-AR jie
aktyvina AC riebaluose ir gaubtinėje žarnoje, taip pat CHO ląstelėse, transfekuotose klonuotais receptoriais [31, 32]. Todėl tikėtina, jog β3-AR
aktyvacija žmogaus širdyje turėtų stimuliuoti ICa,L ir didinti kontraktiliškumą.
Tačiau kai kurie tyrimai rodo, jog β3-AR agonistai gali slopinti susitraukimo
jėgą ir susitraukimų dažnį [26, 29, 33]. Tačiau kiti tyrimų duomenys prieštarauja tokiai hipotezei [34-39]. Mūsų studijos tikslas buvo nuodugniau ištirti, koks pavienės ląstelės lygmeniu yra β3-AR vaidmuo žmogaus širdies
funkcijoje.
Trečias aspektas, kurį tyrėme šios studijos metu – Src-nPTK vaidmuo žmogaus širdyje. Žinoma, jog c-Src, Fyn ir c-Yes Src-nPTK šeimos nariai egzistuoja širdyje [40, 41]. Visgi, neaišku, koks vaidmuo Src-nPTK tenka ICa,L
reguliavime. Taip pat neaišku, kurioje nuo cAMP-priklausomos signalinės grandinės vietoje ji veikia ir kaip yra aktyvuojama. Taigi, mes šios studijos metu pabandėme išsiaiškinti šiuos klausimus.
PKC tyrimas buvo paskutinis mūsų studijos uždavinys. Jis buvo įdomus tuo, jog nėra pagrįstų duomenų, koks vaidmuo PKC tenka β-AR/cAMP signalinės grandinės veiklos atžvilgiu, be to, ar apskritai turi jai įtakos.
1. DARBO TIKSLAS, UŽDAVINIAI IR MOKSLINIS
NAUJUMAS
Darbo tikslas
Ištirti baltymų kinazės A, baltymų kinazės C, Src šeimos nereceptorinės baltymų tirozino kinazės ir jų signaliniuose keliuose dalyvaujančių molekulių įtaką širdies miocitų L tipo kalcio srovei.
Darbo uždaviniai:
1. Ištirti varlės ir žiurkės skilvelių bei žmogaus prieširdžių miocitų β-adrenerginių receptorių signalinės grandinės elementų: -β-adrenerginių receptorių, adenilatciklazės, fosfodiesterazių, baltymų kinazės A, baltymų fosfatazių (1 ir 2A) bei įtampos valdomų L tipo kalcio kanalų bazinį aktyvumą.
2. Ištirti β3-adrenerginių receptorių įtaką žmogaus prieširdžių ICa,L ir
susitraukimo jėgai.
3. Ištirti Src šeimos nereceptorinės baltymų tirozino kinazės įtaką žmogaus prieširdžių ICa,L, taip pat nustatyti jos aktyvinimo būdą ir veikimo vietą
-adrenerginių receptorių signalinėje grandinėje.
4. Ištirti baltymų kinazės C įtaką žmogaus prieširdžių ICa,L. Mokslinis darbo naujumas
Disertacinis darbas suteikia naujų išsamių žinių, kaip skirtingos baltymų kinazės ir kitos signalinės molekulės reguliuoja širdies miocitų L tipo kalcio srovę. Tirdami bazinę ICa,L, mes nustatėme skirtingų
gyvūnų rūšių -AR signalinės grandinės molekulių bazinio aktyvumo skirtumus. Ypač svarbu tai, kad patologinės žmogaus širdies β-AR gali būti spontaniškai aktyvūs ir sukelti esminį ICa,L padidėjimą, net tais
atvejais, kai nėra agonistų β-AR. Šioje studijoje mes pirmą kartą pavienės ląstelės lygmeniu įrodėme, koks yra β3-AR vaidmuo
reguliuojant žmogaus prieširdžių ICa,L. Paneigdami nusistovėjusią
jėgą arba kardiomiocitų L tipo kalcio srovę, mes nustatėme ir pagrindėme β3-AR stimuliuojamąjį poveikį L tipo kalcio srovei bei
prieširdžio trabekulų susitraukimo jėgai. Šioje studijoje taip pat pirmą kartą buvo atskleistas ir pagrįstas Src-nPTK kardiomiocituose sukeliamas slopinamasis poveikis L tipo kalcio srovei bei nustatyta Src-nPTK veikimo vieta ir jos aktyvinimas, vykstantis per cAMP-PKA signalinę grandinę. Tiriant PKC vaidmenį, pasitvirtino literatūroje aprašomas PKC nevienareikšmiškas poveikis L tipo kalcio srovei. Kadangi PKC aktyvinimas nespecifiniu aktyvatoriumi skirtingai modeliavo L tipo kalcio srovę, iškėlėme hipotezę apie PKC izoformų specifiškumo svarbą.
2. LITERATŪROS APŽVALGA
2.1. Širdies ląstelės
Širdies ląstelių (kardiomiocitų; širdies miocitų) struktūra lemia jų funkcines savybes (2.1 pav.). Kardiomiocito pagrindinė funkcija - machaninis darbas, todėl kontraktilinis aparatas apima didžiąją dalį kardiomiocito tūrio. Susitraukimas ir atsipalaidavimas reikalauja daug energijos, todėl kardiomiocitai turi daugiau mitochondrijų nei bet kuri kita ląstelė [42]. Sveikų suaugusių žmonių kardiomiocitai yra apie 120 μm ilgio ir 20-30 μm diametro [43]. Palyginus su skeleto raumenų skaidulomis, kardiomiocitai yra žymiai trumpesni ir mažiau apvalūs pagal skersmens pjūvį [16]. Kiekvienos ląstelės viduryje yra vienas arba du branduoliai, o skeleto raumenys turi keletą periferijoje išsidėsčiusių branduolių [43]. Kardiomiocitų galai atsišakoja ir sudaro skaidulų tinklą [44], kurio jungiasi su kaimyninėmis skaidulomis per netaisyklingos formos sarkolemos skersinį sustorėjimą, vadinamąjį įterptinį diską. Pastarasis turi desmosomas, kurios išlaiko skaidulas kartu, bei plyšines jungtis, kurios leidžia veikimo potencialui sklisti iš vienos skaidulos į kitą [16]. Ir skeleto raumenų ląstelėse, ir kardiomiocituose kontraktiliniai baltymai struktūriškai formuoja sarkomerus, kurie rikiuojasi skersai skaidulos, sudarydami ruožuotumą. Ir skeleto, ir širdies raumenų ląstelės turi tuos pačius kontraktilinius baltymus, kurie išsidėsto panašiu būdu [43]. Skersiniai vamzdeliai perduoda signalus išlaisvinti kalcį iš sarkoplazminio tinklo galinių talpyklų. Kardiomiocitų skersiniai vamzdeliai yra platesni, tačiau jų kiekis mažesnis nei skersaruožių raumenų skaidulų. Vienas skersinis vamzdelis viename sarkomere lokalizuojasi ties Z disku. Kardiomiocitų sarkoplazminis tinklas yra mažesnis nei skersaruožių raumenų skaidulose. Dėl to širdies raumuo turi mažesnį viduląstelinį Ca2+ rezervą [16]. Abiejų tipų ląstelės
panašiai susitraukia, tačiau jų reguliavimas skiriasi. Širdies ląstelėje kalcio ištekėjimas iš sarkoplazminio tinklo sukelia susitraukimą, kuris atitinka širdies sistolę - išstumimo fazę širdies cikle [43]. Kaip ir kitose ląstelėse dviejų sluoksnių membranoje yra jonų kanalai, siurbliai ir receptoriniai baltymai [45]. Kad būtų greitai reaguojama į pakitusį kraujo apytakos poreikį, kardiomiocitai turi keletą reguliacinių receptorių su sudėtinga signaline grandine [42].
2.1 pav. Širdies miocitai ir jų struktūra: A – varlės skilvelių miocitas; B –
žiurkės skilvelių miocitas; C – žmogaus prieširdžių miocitas; D – miocito struktūra ( http://physioweb.uvm.edu/muscle_physio/cntrctl_systm/ cntrctl_excitation.htm): 1 – sarkolema, 2- galinės talpyklos, 3 – skersiniai vamzdeliai, 4 – sarkoplazminis tinklas, 5 – mitochondrijos, 6 –miofibrilės, 7 – A
juosta, 8 – I juosta, 9 – Z diskas, 10 – branduolys.
Maksimali širdies našumo procentinė dalis, galinti padidėti daugiau nei norma, vadinama širdies rezervu. Jaunų bei sveikų suaugusių žmonių širdies rezervas yra nuo 300 iki 400 proc., o treniruotų žmonių pasitaiko nuo 500 iki 600 proc.. Tačiau, atsiradus širdies sutrikimui, širdies rezervas gali labai sumažeti. Kaip normalaus širdies rezervo pavyzdį galima būtų paminėti tai, jog sveiko jauno suaugusio žmogaus širdies našumas, atliekant atskirus pratimus, gali padidėti penkis kartus nei normos, o tai atitinka 400 proc. širdies našumo didesnio nei norma. Bet koks veiksnys, trukdantis širdžiai patenkinamai pumpuoti kraują, mažina širdies rezervą. Tai gali nutikti dėl išeminės širdies ligos, miokardo fizinio sužalojimo, vožtuvų patologijos, vitaminų stygiaus, paveikiančio širdies raumenį, ir daugelio kitų veiksnių. [46] Iš tokių veiksnių
yra ir signalinių molekulių, reguliuojačių ICa,L, veiklos ir raiškos sutrikimai [29,
33, 47-49], pavyzdžiui, pastebėta, kad esant nenormaliam širdies ritmui, gali pakisti Src-nPTK/PP balansas, dėl to išsiderina ICa,L reguliacija [47].
2.2. L-VDCC apibūdinimas ir jų laidumo valdymas
L-VDCC (2.2 pav.) yra vieni iš šešių molekulinio klonavimo būdu nustatyti nuo įtampos priklausomi Ca2+ kanalai (likusieji: P/Q, N, R, T) [50]. L-VDCC yra plačiai pasiskirstę įvairiuose audiniuose [51, 52]. Kardiomiocituose nustatyti dviejų tipų kalcio kanalai: L-VDCC ir T-VDCC. Tačiau T-VDCC fiziologinė reikšmė yra neištirta [15]. Spėjama, jog T-VDCC gali būti kaip mažas pagalbininkas kalcio praleidime į sarkoplazmą [7]. L-VDCC apibūdinami kaip stipriai jautrūs dihidropiridinui, aktyvuojami aukštos įtampos ir sąlyginai lėtos inaktyvacijos kanalai [52]. L-VDCC yra išsidėstę ląstelės sarkolemoje ir skersinių vamzdelių membranoje [53, 54].
2.2 pav. L-VDCC struktūra. Pastaba: 1,4-dihidropiridinas (DHP), benzotiazepinas (BTZ), fenilalkilaminas (PPA). Modifikuota pagal Bodi [17].
Širdies L-VDCC sudaryti iš keturių [17] polipeptidinių subvienetų, turinčių skirtingas molekulines mases [51].
α1 subvienetas. Identifikuota dešimt α1 subvienetų. Visi jie turi tam
tikras funkcijas ir išsidėstymą. Keturi šeimos nariai yra L tipo kanalai. Iš jų tik α1C izoforma yra paplitusi širdyje [55]. Tačiau yra duomenų, jog prieširdžiuose
ekspresuojama ir α1D izoforma [56]. α1 subvienetas formuoja jonų kanalą ir turi
keturis homologinius domenus. Kiekvienas domenas turi šešis numanomus transmembraninius regionus (S1 – S6), kurių S4 regionas sudaro įtampos jutiklį. α1 subvienete taip pat yra Ca2+ antagonisto prisijungimo, PKA [51],
PKC ir PKG fosforilinimo vietos [57].
β subvienetas. Klonuoti keturi β subvienetai (β1 – β4). β2, β3
subvienetai ir β1 subieneto β1b izoforma randamos širdyje [55]. β2 subvienetas širdyje dominuoja [57]. β subvienetai, ir α1 subvienetai turi nuo cAMP
priklausomos baltymų kinazės fosforilinimo vietą [51], [57]. β subvienetai turi didelę įtaka α1 subvieneto savybėms. Jis moduliuoja α1 subvieneto kinetiką ir
nuo įtampos priklausomas savybes [55].
α2/δ subvienetai. α2/δ subvienetų kompleksą koduoja keturi genai
(CACNA2D1-4). α2/δ-1 subvienetų kompleksas randamas žmogaus širdyje.
α2/δ-3 mRNA taip pat aptinkama žmogaus širdyje, bet ne pelės [12]. α2/δ
subvienetų kompleksas dalyvauja padidinant kalcio kanalo srovę [57].
L-VDCC gali būti trijų būsenų: užsidarę, atsidarę ir inaktyvavęsi [52]. Esant ląstelės ramybės potencialui, L-VDCC būna uždari. Membranai depoliarizavusis iki tam tikro laipsnio, L-VDCC atsidaro [17]. L-VDCC atsidarymas gali būti dviejų rėžimų: pirmasis, daug trumpų pliūpsnių, sąlygojamų trumpalaikių atsidarymų; antrasis, ilgesnės trukmės, besitęsiantys atsidarymai [58], kurie vyksta, pvz., dėl fosforilinamojo poveikio [59]. Užsitęsus membranos depoliarizacijai, kanalas pereina į nelaidžiąją būseną, t.y. inaktyvuojasi. Yra du inaktyvacijos būdai: nuo įtampos priklausoma ir nuo Ca2+ priklausoma inaktyvacija [60].
2.3. Bazinė ICa,L ir jos reguliavimo elementai bei mechanizmai
L-VDCC valdymą galima suskirstyti į dvi dalis: pirmojoje dalyje apsprendžiama, kada kanalai atsidarys ir užsidarys [12], o antrojoje dalyje apsprendžiamas kanalų buvimo atidarytosios/uždarytosios būsenos dažnis bei vienetinio kanalo atviros būsenos tikimybė bei vidutinė trukmė [59, 61]. Kaip minėta, L-VDCC atidarymą valdo įtampa, o užsidarymą papildomai valdo ir Ca2+ jonai [62]. Kanalų atviros būsenos tikimybę ir trukmę reguliuoja įvairios signalinės molekulės [59, 61]. Per L-VDCC tekanti srovė, kai kardiomiocitas neveikiamas jokių medžiagų, yra bazinė srovė [15].
Klasikiniai ICa,L reguliacijos kelio komponentai ir mechanizmai yra šie:
generuoja cAMP, o šis aktyvina PKA, kuri fosforilinimo būdu keičia L-VDCC atsidarimo dažnį bei atsidarymo tikimybę. Šią grandį, didinančią ICa,L, gali
nutraukti PDE, skaidydamos cAMP [59, 61, 63, 64], PP slopindamos aktyvintus L-VDCC [65] ir M receptoriai, slopindami AC aktyvumą per Gαi baltymus
[66-68]. Nuo β3-AR, PKC ir Src-nPTK priklausomi ICa,L reguliavimo mechanizmai
yra mažiau ištirti. Toliau išsamiau aptariame kiekvieną ICa,L reguliacijos kelio
komponentą, kokį vaidmenį jis atlieka ICa,L reguliavimo procese bei signalinių
komponentų erdvėskyros savybes.
2.3.1. β-drenerginiai receptoriai
Tarp kelių L-VDCC aktyvumą kontroliuojamųjų kelių geriausiai aprašytas β-adrenerginis ICa,L stimuliavimo kelias. Per β-AR endogeniniai
katecholaminai sukelia teigiamą inotropinį ir dalį teigiamo chronotropinio poveikio [7, 60]. Iki šiol buvo klonuoti trys β-AR tipai: β1-AR, β2-AR ir β3-AR
[21]. Daugiausia diskusijų sukėlusio β3-AR ekspresija žmogaus širdies
miokarde buvo nustatytas tiek mRNA lygiu [26, 27] tiek ir baltymų raiškos lygiu [27-30].
Labiausiai ištirtas ICa,L reguliavimo kelias yra β1-AR ir β2-AR > Gαs >
AC > cAMP (<PDE) > PKA> L-VDCC [63, 64] (2.3 pav.). β2-AR aktyvinimo
sukeltas cAMP sklidimas ląstelės vidinėje erdveje yra labiau lokalizuotas nei β1-AR. Nors abiejų receptorių sugeneruoti cAMP vienodai efektyviai aktyvuoja
L-VDCC, esančius sarkolemoje, visgi β1-AR sugeneruotas cAMP dėl plataus
sklidimo efektyviau veikia toliau nuo sarkoleminės membranos esančius baltymus (fosfolombaną ir(arba) troponiną I) [69, 70].
β3-AR signalo perdavimo kelio tyrimų rezultatai nėra vienareikšmiški.
β3-AR kaip ir β1-AR ar β2-AR riebalinėse ir gaubtinės žarnos ląstelėse, taip pat
CHO ląstelėse transfekuotose klonuotais β3-AR jungiasi su AC [31, 32, 71].
Todėl β3-AR aktyvinimas žmogaus širdyje turėtų stimuliuoti ICa,L ir didinti
susitraukimo jėgą. Visgi įrodyta, jog β3-AR agonistai slopina susitraukimo jėgą
žmogaus endomiokardo biopsijose, paimtose iš transplantuotų širdžių [26, 33], taip pat ir kairiojo skilvelio mėginiuose, paimtuose iš patologinių ir sveikų eksplantuotų širdžių [29]. Šį β3-AR signalą, kurį perduoda Gi/0 baltymas ir
trečiojo tipo endotelio NO sintazės, gaminamas NO [26, 33, 72], sukelia veikimo potencialo sutrumpėjimą [26, 73]. Panašūs duomenys gauti jūrų kiaulyčių širdis Langendorfo perfuzinėje sistemoje paveikus β3-AR agonistu
BRL37344 [74]. NO dalyvavimą patvirtino ir mutageneziniai eksperimentai. NOS3 slopikliai (arginino analogai) teigiamai veikia ISO inotropinį poveikį laukinių pelių širdyse, tačiau neturi poveikio ADRB3-/- bei NOS3-/- pelių širdyse [75] Kitame tyrime ADRB1-/-/ADRB2-/-naujagimių pelių kardiomiocitų kultūroje izoprenalinas sumažino spontaninį susitraukimų dažnį panašiai kaip β3-AR agonistas CL31624 [76]. Be to, šis neigiamas chronotropinis ISO
poveikis virsta teigiamu, miocitus paveikus Bordetella kokliušo toksinu [76], o tai patvirtina hipotezę, kad perduodant β3-AR signalą dalyvauja Gi/0 baltymas.
2.3 pav. β-adrenerginis L-VDCC stimuliacijos kelias. Pastaba: β-adrenerginis receptorius (β-AR); Gαs baltymas (Gsα); adenilatciklazės 5 ir 6 izoformos (AC 5/6); ciklinis
adenozin -3’,5’-monofosfatas
(cAMP); baltymų kinazė A (PKA); nuo įtampos priklausomas L tipo kalcio kanalas (L-VDCC); Ca2+ koncentracija ląstelės citoplazmoje ([Ca2+]i).
Visgi, atlikta nemažai tyrimų, kurių duomenys prieštarauja šiai hipotezei. Pavyzdžiui, keliose publikacijose teigiama, jog pelės širdyje nėra funkcionalių β3-AR [34-36]. Žmogaus β3-AR ekspresija pelės širdyje lemia AC
aktyvinimą per Gs baltymus ir teigiamą inotropinį poveikį, paveikus β3-AR
agonistais [37]. Kiti autoriai žmogaus prieširdžiuose ir silpstančiuose skilveliuose nerado slopinamojo β3-AR agonistų poveikio [38, 39, 77].
Pastarieji atradimai yra svarbūs, nes β3-AR baltymų kiekis padidėja iki trijų
kartų skirtingose širdies patologijų modeliuose [29, 48, 49].
Yra duomenų, jog kai kurie receptoriai yra aktyvūs netgi kai nėra agonisto. Tokiais atvejais, priešingai nei paveikus agonistu, įprastiniai antagonistai neveikia. Tačiau spontanį receptorių aktyvumą galima slopinti
inversiniais agonistais [78]. Spontaniškai aktyvių receptorių nustatymas ne visada lengva užduotis, nes jų aktyvumas nėra aiškiai išreikštas [79]. Ląstelėje gali būti tam tikras spontaniškai aktyvių receptorių kiekis ir jie palaiko tam tikrą AC aktyvacijos laipsnį. [80] Todėl spontaninis β-AR aktyvumas taip pat gali neigiamai veikti širdies funkciją, kaip kad β-AR padidėjui ekspresija, sukelianti širdies hipertrofiją, progresuojantį širdies sutrikimą [81], padažnėjusį susitraukimą [82] ar lėtinį širdies nepakankamumą [48].
2.3.2. Muskarininiai receptoriai
Penkios (M1-M5) muskarininių acetilcholino receptorių izoformos
nustatytos molekulinio klonavimo būdu, kurių keturios (M1-M4) atitinka
funkcionuojančius potipius žmogaus širdyje. M5 receptoriaus buvimas širdyje
yra abejotinas [83]. Mokslinėje literatūroje aprašyti keli muskarininių acetilcholinino receptorių signalų perdavimo keliai: 1) ACh aktyvina PP2A [84] ir(arba) PP1 [85]; 2) ACh aktyvina Gα0 [86, 87] arba Gβ2/3 γ2/4 ir tokiu būdu
tiesiogiai slopina L-VDCC (per M4 receptorių) [87]; 3) ACh aktyvina NO kelią
[88, 89]; 4) ACh slopina AC [66-68] (per M2 ir galimai per M4) [90] per Gαi
baltymą (2.4 pav.) arba aktyvuoja PKC (per M1 bei galimai per M3 ir M5), kuri
savo ruožtu slopina L tipo kalcio kanalą) [90]. Visgi, NO kaip pagrindinis muskarininio signalo perdavimo reguliatorius yra tik ankstyvojo embriono kardiomiocituose [91], o vėlesnės stadijos NO signalo perdavimas persijungia į NO-nepriklausomą kelią [92, 93] Taip pat yra duomenų teigiančiu, jog NO kelias nebūtinai dalyvauja [94] arba jis neturi reikšmingos įtakos muskarininio ICa,L reguliavimui žmogaus kardiomiocituose [95], arba NO gali būti tik kaip
kompensavimo mechanizmas, mažinantis β-adrenerginę širdies dažnio reguliaciją, kai širdies parasimpatinė kontrolė yra sutrikusi [96].
M1-3 receptoriai pirmiausia aktyvina Gαq, o M2-4 - Gαi baltymus [18],
todėl manoma, kad poveikis sukeliamas per atitinkamus jų efektorius PKC arba AC [19, 20]. Žmogaus širdyje dominuoja M2 receptorius [18].
2.4 pav. β-adrenerginio L-VDCC stimuliacijos kelio slopinimo mechanizmas
per muskarininius receptorius. Pastaba: muskarininis receptorius (M2); Gαi baltymas (Giα); β-adrenerginis receptorius (β-AR); Gαs baltymas (Gsα); adenilatciklazės 5 ir 6 izoformos
(AC 5/6); ciklinis adenozin -3’,5’-monofosfatas
(cAMP); baltymų kinazė A (PKA); nuo įtampos priklausomas L tipo kalcio kanalas (L-VDCC); Ca2+ koncentracija ląstelės citoplazmoje ([Ca2+]i). Pagal Harvey ir Belevych [97]
2.3.3. G baltymai
Guanozino nukleotidus prisijungiantys baltymai sutrumpintai vadinami G baltymais [98]. Signalus iš GPCR G baltymai perduoda baltymams vykdytojams [99]. Su membrana susiję heterotrimerai susideda iš Gα, Gβ ir Gγ subvienetų. Žmogaus genome nustatyta bent 16 α genų, 5 β genai ir 12 γ genų. Gα izoformos skirstomos į keturis pošeimius: Gαi, Gαs, Gαq ir Gα12 [100].
Signalą apdorojantis G baltymas paprastai yra prisijungęs prie pradinį signalą pajaučiančio GPCR, kurio aktyvinimas sukelia receptoriaus podomenių persitvarkymą ir signalo perdavimą inaktyviam Gα-GDP/Gβγ, kartu skatinamas GDP atpalaidavimas ir GTP prisijungimas. Tai sukelia Gα atsiskyrimą nuo Gβγ. Gα-GTP ir Gβγ nukrypsta į efektorius arba, kitaip tariant, baltymus – vykdytojus, pvz., AC [98].
Nustatyta, kad Gαs tiesiogiai aktyvuoja AC, Gαi tiesiogiai slopina AC
[19], o Gαq netiesiogiai aktyvuoja PKC [20]. Naujausiais duomenimis, Gαs
baltymas aktyvuoja ir Src-nPTK [101, 102], kuri yra vienas iš mūsų tyrimo objektų.
2.3.4. Adenililciklazė
Fermentai, sintezuojantys cAMP iš ATP, vadinami adenililciklazėmis [103]. Molekulinio klonavimo būdu nustatytos ir apibūdintos devynios AC izoformos (AC1-AC9) [104] ir du splaisiniai AC8 variantai [105]. Išskyrus pirmąją AC, visos kitos aptinkamos širdyje. Širdyje dominuoja AC5 ir AC6 [105]. AC izoformos yra prisijungusios prie membranos [106], tačiau sudaro tik 0,001 proc. visų membranos baltymų [107]. Visos AC izoformos turi didelį sekų homologiškumą savo katalitinių vietų pirminėje struktūroje ir tokią pačią 3D struktūrą [103, 105]. Kiekviena AC izoforma susideda iš mažo N-galo domeno [108] bei toliau einančių dviejų transmembraninių regionų – TM1 ir
TM2 bei dviejų citoplazminių domenų – C1 ir C2. C2 domenas yra C-galo
domenas. Kiekvienas TM1 ir TM2 domenas susideda iš šešių membranoje
įsigręžusių α-spiralių. Citoplazminiai domenai suskirstyti į C1a ir C1b bei C2a ir
C2b [106, 108-110]. C1a ir C2a domenai yra pakankamai konservatyvūs,
homologiški vienas kitam ir atstovauja visą katalitinį aparatą. Tirpale C1a ir C2a
domenai heterodimerizuojasi vienas su kitu. Šie domenai taip pat gali formuoti homodimerus. O domenai, kilę iš skirtingų izoformų, gali formuoti chimerinius heterodomenus [109]. TM1 ir TM2 domenai gali tarnauti kaip membranos
įtampos sensoriai, kurie struktūriškai reguliuoja AC [108]. Šie domenai taip pat gali nukreipti AC į membraną [108, 109] ir būti tartum pastoliai, link kurių gali susirinkti kiti signaliniai baltymai [108].
Visos AC izoformos yra aktyvinamos Gs ir slopinamos Gi [103],
tačiau kiekviena iš jų yra reguliuojama daugiau jai specifiniu būdu. Pavyzdžiui,
1 grupę AC, kurią sudaro AC1, AC3 ir AC8, stimuliuoja kalmodulinas nuo
Ca2+ priklausomu būdu. 2 grupę AC, kurią sudaro AC2, AC4 ir AC7, gali stimuliuoti Gβγ subvienetai. AC2 ir AC7 gali būti aktyvuojamos ir PKC. 3
grupę AC, kurią sudaro AC5 ir AC6, slopina Gαi bei PKA ir Ca2+. 4 grupę AC
sudaro tik viena AC9, kuri yra unikali tarp AC dėl savo reliatyvaus nejautrumo forskolinui [104]. AC reguliavimo būdas gali skirtis netgi tai pačiai izoformai skirtinguose ląstelių tipuose. Reguliavimas taip pat gali skirtis tarp AC izoformų skirtingų sukirpimo variantų [107].
Visos AC izoformos turi labai mažą bazinį aktyvumą [108], kuris žymiai padidėja prisijungus Gαs subvienetui [108, 111]. Kiti reguliatoriai veikia
tik kai kurias AC izoformas ir gali turėti skirtingą poveikį, lyginant vieną izoformą su kita [104, 108]. AC aktyvumą gali veikti fosforilinimas baltymų kinazėmis, kurios dažniausiai turi slopinamąjį poveikį ne baziniam, bet įvairių
aktyvatorių padidintam AC aktyvumui, ir šie poveikiai yra neigiamo grįžtamojo ryšio mechanizmo dalis [111].
2.3.5. cAMP
cAMP – tai ląstelės viduje plačiai paplitęs antrinis signalų perdavėjas, kurį generuoja AC. cAMP perduoda informaciją keletui baltymų, tarp jų ir jonų kanalams, kuriuos veikia cikliniai nukleotidai ir PKA [112]. Be to, cAMP sukelia baltymas-baltymas sąveiką nepriklausomai nuo fosforilinimo [105]. Ši molekulė reguliuoja įvairias ląstelės funkcijas, pvz., Ca2+ įtekėjimą, jaudrumą ir genų ekspresiją, taip pat ir skirtingoms ląstelėms specifinius procesus, pvz., gliukogenolizę ir lipolizę [112]. Širdyje cAMP tarpininkauja katecholaminams reguliuojant širdies susitraukimų dažnį ir jėgą. cAMP kiekis ląstelėje priklauso nuo PDE ir AC aktyvumo [105, 112]. cAMP koncentracija ir kartu poveikis subląsteliniuose skyriuose gali labai skirtis nuo visos likusios ląstelės [113].
2.3.6. Fosfodiesterazės
Fosfodiesterazės yra mutageninių fermentų superšeima, kuri reguliuoja signalo perdavimą, kontroliuodama erdvėje ir laike cAMP ir cGMP kiekį [114]. PDE hidrolizuoja viduląstelinius ciklinius nukleotidus cAMP ir cGMP į neaktyvius 5′ monofosfatus [115]. Žinoma vienuolika PDE šeimos narių (PDE1-PDE11), susidednčių iš 60 skirtingų PDE izoformų [116]. Šią įvairovę lemia 21-22 genai, koduojantys daugiau kaip 100 mRNR produktų, atsiradusių dėl alternatyvaus genų sukirpimo [114, 117]. PDE tarpusavyje skiriasi aktyvinimo būdais, substrato specifiškumu, kinetika ir išsidėstymu audiniuose [116]. Keturi PDE izofermentai (PDE1, PDE2, PDE3 ir PDE4) randami skirtingų žinduolių, tarp jų ir žmogaus širdyje. Taip pat yra duomenų, jog ir PDE5 [118, 119] bei PDE8 egzistuoja širdyje [119].
Pagrindiniai PDE aktyvinimo keliai: PDE1 priklausoma nuo Ca2+; PDE2 stimuliuojama cGMP; PDE3 slopinama cGMP; PDE4 prikausoma nuo PKA; PDE5 priklausoma nuo cGMP [120].
PDE4, PDE7 ir PDE8 hidrolizuoja išskirtinai cAMP; PDE5, PDE6 ir PDE9 - išskirtinai cGMP; o PDE1, PDE2, PDE3, PDE10 ir PDE11 izofermentai hidrolizuoja ir cAMP, ir cGMP [121]. Žinduolių PDE turi HD
(Pfam katalogo nr. PF01966) domeną C-gale, kuris turi didelį giminingumą cAMP ir(arba) cGMP. N-galo pusėje išsidėstę domenai reguliuoja PDE fermentinį aktyvumą bei subląstelinę lokalizaciją. Kai kurios PDE turi baltymų kinazėms skirtas fosforilinimo vietas bei lipidų modifikacijos vietas [120]. PDE aktyvumą reguliuoja viduląstelinių ciklinių nukleotidų koncentracija, fosforilinimas, sąveika su reguliaciniais baltymais, sublastelinė erdvėskyra, Ca2+/kalmodulino prisijungimas, taip pat genų ekspresija [121].
2.3.7. Baltymų kinazė A
cAMP aktyvinama serino ir treonino baltymų kinazė - PKA [130], kitaip dar žinomas kaip A kinazė arba nuo cAMP priklausoma kinazė [122]. PKA perkelia γ fosfatą nuo ATP ant baltyminių substratų, kurie yra jos taikiniai [123]. PKA dalyvauja reguliuojant daugelį pavienės ląstelės procesų: metabolizmą, genų kopijavimą, membranos jonų sroves, ląstelės augimą ir mirtį. PKA sudaro du katalitiniai subvienetai, ir reguliacinis subvienetas dimeras. Abu C subvienetai jungiasi su dimeriniu R subvienetų ir suformuoja neaktyvų holofermentinį kompleksą [124]. Prisijungus cAMP prie reguliacinio subvieneto, katalitinis subvienetas atsipalaiduoja ir gali fosforilinti savo baltyminius substratus. Reguliaciniam subvienetui saveikaujant su AKAP, holofermetas lokalizuojamas į specifines subląstelines vietas [125]. Yra keturios PKA izoformos [124]. Šių izoformų įvairovė pasiekiama katalitiniams subvienetams prisijungus prie skirtingų reguliacinių subvienetų homodimerų izoformomų (Iα and Iβ, IIα ir IIβ) [125]. Nepaisant daug bendrų panašumų, reguliacinio subvieneto izoformos atlieka gana skirtingas funkcijas [125]. PKA izoformos yra skrtingai išsidesčiusios ląstelėse, todėl gali reguliuoti skirtingus ląstelės process [126].
PKA, fosforilindama L-VDCC, didina jų atsidarymo tikimybę bei vidutinį laiką, kurį kanalai būna atviri, todėl padidėja visos ląstelės ICa,L [7].
Nustatyta, jog PKA fosforilina L-VDCC α1C subvieneto izoformą, α1D
2.3.8. Baltymų fosfatazės
Signalą perduodantis fermentas, kuris defosforilinana intraląstelinius baltymus fosforilintus ties serino, treonino ir tirozino liekanomis yra PP [129, 130]. PP struktūriškai ir funkciškai yra skirtingi fermentai. PP koduoja trys skirtingos genų šeimos. Dvi iš jų (PPP ir PPM) defosforilina fosfoserino ir fosfotreonino liekanas, trečioji (PTP) defosforilina fosfotiroziną. PTP šeimai priklauso ir dvigubo specifiškumo pošeimis, galintis defosforilinti ne tik fosfotiroziną, bet ir fosfoseriną bei fosfotreoniną [129]. PTP šeimai priklauso į receptorius panašios ir citozolinės fosfotazės [131]. PPM šeimai priklauso PP2C [130, 132]. PPP šeimai priklauso PP1, PP2A, PP2B (PP2B dar vadinamas kalcineurinu) [130, 132, 133] ir į PP2A panašios fosfatazės: PP4, PP5, PP6, PP7 [134]. Naudojant kalikuliną A, galima nuslopinti PP1, PP2A, PP4 ir PP5 [132]. Širdies raumenyje jos visos randamos [135-137]. Mūsų duomenimis, ICa,L įtakos turi tik PP1 ir PP2A [138, 139].
PP1 aktyvumą reguliuoja į insuliną panašus hormonas gliukagonas, α-adrenerginiai ir β-α-adrenerginiai agonistai, gliukokortikoidai ir skydliaukės hormonai [140]. PP1 slopina šie endogeniniai slopikliai: inhibitorius 1, inhibitorius 2, DARPP-32. Visi šie slopikliai gali būti aktyvinami PKA [140]. PP2A aktyvumui įtakos turi daugelis baltymų [141, 142]. Ahn‘a ir kolegos aptiko, kad PP2A yra aktyvuojamas PKA [143]. Stimuliuotos PP2A aktyvumas yra sietinas su mAKAP. Šis kompleksas slopina PDE4 fosforilinimą ir aktyvumą [144]. Benitah‘as ir jo kolegos savo straipsnyje pastebi, kad intraląstelinė kardiomiocitų perfuzija PP2A katalitiniu subvienetu sumažino ICa,L, o PP1 neturėjo poveikio pelės skilveliui. Tuo tarpu PP1 slopinimas
padidina, o PP2A slopinimas neturi poveikio ICa,L [145]. Tai gali rodyti, kad
PP1 yra atsakinga už bazinį ICa,L slopinimą [146], o PP2A atsakingas už PKA
aktyvuotos ICa,L slopinimą. Yra duomenų, kad PP2A defosforilina L-VDCC α1C
izoformos seriną 1828 fosforilinta PKA [65]. Kad PP1 defosforilintų α1C,
duomenų nėra [145].
2.3.9. Src-nPTK
Baltymų tirozino kinazės yra dviejų rušių: receptorinės PTK ir nereceptorinės PTK [147, 148]. Nereceptorinės PTK skirstomos į šeimas, pavyzdžiui, Src, Csk, Jak ir Fak [147]. Kardiomiocituose Src šeimos tirozino
kinazės gali reguliuoti membranos jonų sroves, o svarbiausia - L-VDCC srovę [149]. Src šeimą susideda iš 11 narių [150]: Blk, Brk, Fgr, Frk, Fyn, Hck, Lck, Lyn, c-Src, Srm, c-Yes [147]. Remiantis Benatti ir Baldari, Src šeimos nariai (aštuoni iš jų yra gerai charakterizuoti žinduolių ląstelėse) yra suskirstyti į du pošeimius, remiantis aminorūgščių sekomis. Pirmojo pošeimio nariai c-Src, Fyn ir c-Yes yra plačiai pasiskirstę skirtinguose audiniuose, o antrojo pošeimio nariai Lck, Blk, Lyn, Hck, Fgr apsiriboja hematopoetinėmis ląstelėmis [151]. Frk atsiduria trečioje grupėje ir daugiausia yra ekspresuojamas epitelio ląstelėse [152].
Yra labai mažai duomenų, nurodančių, kokie Src-nPTK nariai egzistuoja širdyje. Puceat ir kolegos nustatė c-Src ir Fyn ekspresiją naujagimių ir suaugusių žiurkių kardiomiocituose [40]. Kovacic ir jo kolegos rado ir c-Yes narį žiurkės širdies skilvelio miocituose [41]. Beje, jų tyrimo metu endotelinas sukeldavo c-Src, Fyn ir c-Yes persiskirstymą į skirtingas kardiomiocito vietas. Taigi, Src-nPTK nariai turi skirtingus taikinius kardiomiocituose [41]. Nors, Roskoski savo straipsnyje neįžvelgia didelių funkcinių skirtumų tarp skirtingų Src-nPTK narių [153].
Subląsteliniame lygmenyje Src-nPTK narių išsidėstymas yra pakankamai platus, be to jos gali būti perkeliamos į kitą vietą [147, 152]. Pažymėtina, kad tos pačios kinazės ekspresijos laipsnis skirtingose ląstelėse gali skirtis [152].
Src-nPTK (2.5 pav.) slopina endogeniniai katalitiniai ir nekatalitiniai slopikliai [154]. Visiškai nuslopinta Src-nPTK yra uždaros būsenos: SH2 domenas yra susijungęs su fosforilintu Tyr527, o SH3 – susijungęs su SH2-kinazės sąsajoje esančiu poliprolino II tipo spiralės elementu [155, 156]. O visiškai užslopinta Src-nPTK lieka autoinhibavimosi būsenos, kurioje ji negali fosforilinti substratų. Tačiau autoinhibitacinė forma lengvai gali pereiti į aktyvią [157, 158]. Src-nPTK struktūra ir forma yra svarbios reguliacinėms savybėms. Iš esmės Src-nPTK yra reguliuojama dviem mechanizmais: 1) jungimasis su SH2 ir(arba) SH3 domenais; 2) per aktyvacinės kilpos Tyr416 ir(arba) per konservatyvios tirozino liekanos Tyr527 fosforilinmą-autofosforilinimą-defosforilinimą [155, 156]. Src-nPTK reguliavimui įtakos gali turėti ir šios fosforilinimo vietos: Ser12, Ser17, Ser48, Ser72, Thr34, Thr46, Tyr138, Tyr213 [159]. Src-nPTK turi keletą aktyvumo lygių, kurie susiję su jos formomis, o pastarosios priklauso nuo aktyvavimo ir slopinimo mechanizmų [154, 156].
2.5 pav. Src-nPTK struktūra.
Be biologinių atsakų tirozino fosforilinimas reguliuoja ir ląstelės dauginimąsi, migraciją, diferenciaciją bei išgyvenamumą [152]. Todėl Src-nPTK reguliacija yra griežta. Nukrypimas nuo Src-Src-nPTK reguliavimo normos gali sukelti esminę aktyvaciją, o tai gali paskatinti ląstelės transformaciją ir vėžio vystimasį. Norint išvengti reguliavimo klaidų normaliose ląstelėse, Src-nPTK, veikiant keletui vidinių slopiklių, yra laikoma neaktyvios būsenos [154-156].
Src-nPTK dalyvauja įvairių receptorių signaliniuose keliuose, kurie savo ruožtu kontroliuoja skirtingo spektro receptorių sukeliamas biologines funkcijas [152], tarp jų ir β-AR įtaką ICa,L [160]. Visgi, kol kas neaišku, kokią
įtaką Src-nPTK turi ICa,L. Literatūroje galima rasti duomenų tiek apie ICa,L
aktyvinimą, tiek apie slopinimą. Pavyzdžiui, Greiser naudojo genisteiną ir PP-1 Src-nPTK slopinimui. Šių dviejų slopiklių poveikis sergantiesiems ritmo sutrikimu buvo skirtingas [47]. Žmogaus prieširdžių miocituose genisteinas didino ICa,L [161], turėjo dvifazį poveikį [162] ar mažino ICa,L jūrų kiaulyčių
kardiomiocituose [163]. Pažymėtina, kad genisteinas gali veikti neselektyviai, pvz., yra duomenų kad genisteinas slopina ICa,L [164, 165] arba slopina nuo
PTK nepriklausomu budu neigiamą inotropini endotelino-1 poveikį, sukeltą persidengimo su izoprenalinu metu šuns skilvelio trabekulose [166]. Tokie duomenys kelia klausimą, ar genisteinas, kaip Src-nPTK slopiklis, yra patikimas, ir dėja nesuteikia aiškaus atsakymo apie Src-nPTK įtaką ICa,L.
Taip pat neaišku, kokioje cAMP signalinio kelio vietoje Src-nPTK veikia, kas ją aktyvuoja. Yra duomenų, kad Src-nPTK yra aktyvuojama PKC,
bet ne per molekulinius kelius, priklausomus nuo PKA ir PP 1/2A [149]. Kiti mokslininkai teigia, kad Src nPTK gali būti aktyvuojama β2-AR, Gαs baltymo
ir(arba) PKA [102]. Hipotetinės Src-nPTK veikimo vietos yra β-AR [167], Gα [168] ir L-VDCC [169].
2.3.10. Baltymų kinazė C
Plati lipidų kilmės serine/threonine kinazių šeima, kuri klasifikuojama pagal veikimo būdą ir reguliacinio domeno homologiškumą yra PKC [170]. PKC klasifikuojamos į klasikinius PKC izofermentus (cPKC), aktyvuojamus Ca2+ ir diacilglicerolio (esant fosfatidilserinui (PS)) [170-172]. Ši grupė yra gausiausia ir apima , I, II ir γ izofermentus [170, 171]. Taip pat neįprastus
PKC izofermentus (nPKC), apimančius , , ir . Jos aktyvuojamos DAG ir PS, bet ne Ca2+ [170-172]. Ir atipinius PKC izofermentus (aPKC). Pastarieji yra priklausomi nuo lipidų, tačiau nereikia DAG ar Ca2+ jų aktyvacijai [170, 171]. aPKC apima , ir izofermentus [171, 173]. Neseniai klonavus PKC, nustatytas ketvirtasis pošeimis, kuris kartu su PKC sudaro nauja grupavimą. [174] Kaip teigia Nishizuka, PKC izofermentus be Ca2+ ir DAG su PS gali aktyvuoti ir kiti kofaktoriai [171].
Klasikinės grandinės, aktyvinančios PKC, driekiasi nuo endotelino, 1
adrenerginių, M1-3, ir angiotenzino II receptorių. Pastarųjų receptorių
suaktyvintas baltymas Gq stimuliuoja fosfolipazę C [18, 175, 176]. Ši
hidrolizuoja PI(4,5)P2, todėl generuojami du antriniai signalo perdavėjai: Ins(1,4,5)P3 ir DAG [20, 175]. DAG tiesiogiai aktyvina PKC, o Ins(1,4,5)P3 - išlaisvindamas Ca2+ iš ląstelės vidinių talpyklų [20].
Nuo Ca2+ priklausomi izofermentai PKC- ir PKC- dominuoja skilveliniame miokarde, o PKC- ir PKC- - prieširdyje. PKC- ir PKC- raiška prieširdyje ir skilvelyje vienoda, tarp kairiojo ir dešiniojo prieširdžio izofermentų ekspresijos skirtumo nepastebėta [177].
Yra duomenų, kad PKC veikia L-VDCC. Tačiau dėl skirtingų duomenų poveikis nėra aiškiai apibrėžtas, pvz., PKC gali aktyvuoti, slopinti arba veikti dvifaziškai [57]. Tačiau akivaizdu, kad skirtingos PKC izoformos gali sukelti skirtingą poveikį L-VDCC, pvz., cPKC βII izoforma sukelia ICa,L padidėjimą
2.3.11. Erdvėskyra
Žinduolių ląstelių plazminė membrana yra lipidų dvisluoksnis, pirmiausiai sudarytas iš tūkstančių lipidų ir membraninių baltymų rušių. Be to kad, plazminė membrana yra fizinė ląstelės riba, ji dar funkcionuoja ir kaip selektyvus rėtis (angl. "sieve"), per kurį praeina medžiagos ir informacija [180]. Todėl joje yra daug struktūrų, tokių kaip, membraniniai plaustai (angl. "rafts") arba kalveolės [181, 182].
Yra duomenų, jog įvairių klasių GPCR (pvz., β-AR, M) signaliniai komponentai, reguliuojantys cAMP gamybą, yra išsidėstę kalveolino-3 įdubose [183]. Taip pat yra duomenų, rodančių, kad signalai, sklindantys iš skirtingų šaltinių ir sukeliantys cAMP gamybą, nesusimaišo, o tartum padalijami į specifinius erdvės skyrius [184].
Raumeninėse ląstelėse dominuoja kalveolinas-3 [185, 186], tačiau yra duomenų, jog skilvelio miocitai taip pat ekspresuoja kalveoliną-1, kuris dalyvauja signalų perdavimo procese [185]. Kalveolėse bei membraniniuose plaustuose aptinkma įvairių signalinių grandinių komponentų, tarp jų ir -AR, M receptorių, Gs, Gi baltymų, AC5/6, PKA, c-Src [182, 187-190]. Taip pat
yra duomenų, jog kalveolėse arba membraniniuose plaustuose randama ir joninių kanalų, pavyzdžiui, L-VDCC [182, 191, 192] Įdomu tai, kad adrenerginė stimuliacija įtraukia -arestiną į plazminę membraną, o šis savo ruožtu šalia kitų funkcijų, gali pritraukti PDE – visa tai sukelia vietinio cAMP irimą [193, 194] Be to, yra duomenų, jog cAMP baseinai (angl. "pool") lokalizuojasi širdies T vamzdeliuose, kur gali būti randama didžioji kalveolių dalis [183, 195]. Įvertinus visus šiuos duomenis, paaiškėja, kad cAMP yra gaminama bei sukelia atsaką iš membraninių plaustų ir kalveolių [196]. Todėl -adrenerginės stimuliacijos kelias yra tiksliai lokalizuotas, o tai padidina signalų perdavimo ir reguliacijos efektyvumą [182, 197, 198]. Kaip minėta, β2
-AR aktyvinimo sukeltas cAMP sklidimas ląstelės vidinėje erdveje yra labiau lokalizuotas nei β1-AR. Nors abu sugeneruoti cAMP laukai vienodai efektyviai
aktyvuoja L-VDCC esančius sarkolemoje, visgi β1-AR sugeneruotas cAMP
laukas dėl savo plataus pasklidimo efektyviau veikia toliau nuo sarkoleminės membranos esančius baltymus (fosfolombaną ir(arba) troponiną I) [69, 70].
3. MEDŽIAGOS IR TYRIMO METODAI
3.1. Miocitų išskyrimui ir elektrofiziologiniams eksperimentams naudoti tirpalai
Širdies preparatų transportavimui naudotas tirpalas
Kardiopleginis šv. Tomo tirpalas (mM): NaCl 110, KCl 16, MgCl2 16,
CaCl2 1,2, D-gliukozė 5, HEPES 10. Tirpalas įsotinamas deguonimi ir pH iki
7,4 nustatomas tirpalą titruojant NaOH (1 M).
Žmogaus širdies ląstelių išskyrimui naudoti tirpalai
Krebso tirpalas (mM): HEPES 10, NaCl 35, D-gliukozė 10, sacharozė
134, Na2HPO4 16, NaHCO3 25, KCl 4,7, KH2PO4 1,2. Tirpalas prieš ląstelių
išskyrimą įsotinamas O2 95 proc. ir CO2 5 proc. mišiniu. pH iki 7,2 nustatomas
su NaOH (1 M).
Krebso/JSA tirpalas: paruošiamas Krebso tirpale ištirpinant 4 mg/ml JSA
(>98 proc. grynumo, be riebalų rūgščių).
BDM/EGTA tirpalas: 3 mg/ml BDM (2,3- butandiono monoksimas) ir 0,1
mg/ml EGTA ištirpinami paruoštame Krebso tirpale.
HEPES tirpalas (mM): HEPES 25, NaCl 130, D gliukozė 5, KCl 4,8,
KH2PO4 1,2. Tirpalo pH 7,4 nustatomas su NaOH.
HEPES/JSA tirpalas: paruošiamas HEPES tirpale ištirpinant 1 mg/ml
JSA.
Pirminio išskyrimo tirpalas: Krebso/JSA (10 ml) tirpalas su 0,6 mg/ml
kolagenazės (type 2; 281 u/mg, Worthington), 0,6 mg/ml proteazės (type XXIV; 10,5 u/mg; SIGMA) ir 0,1 mg/ml elastazės (6,88 u/mg, Fluka).
Antrinio išskyrimo tirpalas: Krebso/JSA tirpalas su 1 mg/ml kolagenazės
(type 2; 281 u/mg, Worthington).
Žmogaus miocitų laikymo tirpalas (mM): NaCl 120, KCl 5,4, MgCl2 5, D
gliukozė 20, HEPES 10 ir natrio piruvatas 5. pH 7,4 (NaOH).
Žiurkės širdies ląstelių išskyrimui naudotas tirpalas
Žiurkės širdies ląstelių išskyrimo ir laikymo tirpalas (mM): NaCl 120,
KCl 5,8, NaHCO3 4,3, KH2PO4 1,3, MgCl2 1,5, D gliukozė 14,1, HEPES 20.
Varlės širdies ląstelių išskyrimui naudotas tirpalas
Varlės širdies ląstelių išskyrimo ir laikymo tirpalas, kurio sudėtis buvo
(mM): NaCl 113, KCl 2,5, MgCl2 1,8, NaHCO3 5, NaH2PO4 0,5, kreatinfosfato
Na druska 5, D gliukozė 5, Na piruvatas 5, HEPES 15. Tirpalo pH iki 7,4 nustatomas titruojant NaOH (1 M).
Elektrofiziologiniams eksperimentams naudoti tirpalai
Žmogaus ir žiurkės ląstelių išorinis kontrolinis tirpalas (mM): NaCl 127,
Hepes 10, CsCl2 20, NaHCO3 4, NaH2PO4 0,8, MgCl2 1,8, CaCl2 1,8, D
gliukozė 5, natrio piruvatas 5. Tirpalo pH iki 7,4 nustatytas tirpalą titruojant NaOH (1 M).
Žmogaus ir žiurkės ląstelių vidinis kontrolinis tirpalas (mM): HEPES 10,
CsCl 140, EGTA 5, MgCl2 4, CaCl2 0,062, kreatino fosfato dinatrinė druska 5,
Na2ATF 3, Na2GTP 0,42. Tirpalo pH 7,3 nustatytas tirpalą titruojant CsOH (1
M). Kai kuriems eksperimentams naudotas ląstelių vidinis tirpalas, kurio pH buvo 8,3 (nustatytas tirpalą titruojant CsOH (1 M)).
Varlės ląstelių išorinis kontrolinis tirpalas (mM): NaCl 107, Hepes 10,
CsCl2 20, NaHCO3 4, NaH2PO4 0,8, MgCl2 1,8, CaCl2 1,8, D-gliukozė 5, natrio
piruvatas 5. Tirpalo pH iki 7,4 nustatytas tirpalą titruojant NaOH (1 M).
Varlės ląstelių vidinis kontrolinis tirpalas (mM): HEPES 10, CsCl 120,
EGTA 5, MgCl2, CaCl2 0,062, kreatino fosfato dinatrinė druska 5, Na2ATF 3,
Na2GTP 0,42. Tirpalo pH 7,3 nustatytas tirpalą titruojant CsOH (1 M).
Žmogaus ir žiurkės raumenėlių išorinis Tyrodė tirpalas (mM): NaCl 137,
KCl 5,4, CaCl2 1,8, MgCl2 0,9, gliukozė 5, Hepes 10. Tirpalo pH iki 7,4
nustatytas tirpalą titruojant NaOH (1 M), temperatūra +36±0,5oC.
3.2. Žmogaus širdies miocitų išskyrimas
Žmogaus prieširdžių miocitai (ŽPM) buvo išskirti iš LSMU Kardiochirurgijos klinikoje operuotų pacientų prieširdžių biopsijų. Darbui su žmogaus preparatais buvo gautas Kauno regioninio biomedicininių tyrimų Etikos komiteto leidimas atlikti biomedicininius tyrimus (Nr.BE-2-18, 2006 05 13). Biopsijos į laboratoriją buvo transportuojamos šaltame (+4° C) šv. Tomo kardiopleginiame tirpale, kuris prieš tai būdavo įsotinamas deguonimi.
Prieširdžio arba skilvelio biopsija iš transportavimo tirpalo perkeliama į plokščią lėkštelę užpildytą BDM/EGTA tirpalu. Atsargiai, stengiantis nepažeisti audinių, raumens mėginys sukarpomas maždaug 1 mm3 dydžio
gabalėliais. Taip pat nukarpomas ir pašalinamas jungiamasis ir riebalinis audinys.
Susmulkinti raumens gabalėliai perpilami į 25 ml tūrio stiklinėlę apvaliu plokščiu dugnu. Čia jie kelis kartus praplaunami 5-7 ml švaraus BDM/EGTA tirpalo. Po to nuo sukarpyto raumens gabalėlių nupilamas BDM/EGTA tirpalas ir raumens gabalėliai užpilami 10 ml pirminio išskyrimo tirpalo. Stiklinėlė 30-40 min. įstatoma į +37° C temperatūros termostatą-kratytuvą, kur stiklinėlė purtoma maždaug 200 kartų per minutę intensyvumu, tirpalą nuolat įsotinant O2
95 proc. ir CO2 5 proc. mišiniu. Po 30 - 40 min. tirpalas nupilamas, o ant likusių
stiklinėlėje gabalėlių užpilama 10 ml antrininio išskyrimo tirpalo, ir stiklinėlė vėl 15-20 min. įstatoma į +37° C temperatūros termostatą kratytuvą. Purtoma 200 kartų per minutę intensyvumu, visą laiką tirpalą įsotinant O2 95 proc. ir
CO2 5 proc. mišiniu. Po 15-20 min. miokardo gabalėlių purtymo antrinio
išskyrimo tirpalas nupilamas į du 15 ml tūrio mėgintuvėlius (maždaug po 5 ml tirpalo į kiekvieną mėgintuvėlį). 15 ml talpos mėgintuvėliai su nupilta nuo audinių ląstelių suspensija pripildomi HEPES/JSA tirpalu iki 12 - 13 ml. Ląstelės nusodinamos jas centrifuguojant 1 min. 500 - 900 apsisukimų per minutę greičiu. Po to nuo mėgintuvėlio dugne nusėdusių ląstelių nupilamas skystis, o ląstelės užpilamos 3 - 4 mililitrais laikymo tirpalo.
Likę stiklinėlėje miokardo gabalėliai dar kartą užpilami 10 ml naujai pagaminto (37° C) antrinio išskyrimo tirpalo ir vėl tokiomis pačiomis sąlygomis, purtomi termostate kratytuve (15 - 20 min.). Po to ląstelės nuo likusių nesuirusių audinių atskiriamos filtruojant jas per HEPES/JSA tirpalu suvilgytą nailoninį filtrą. Nufiltruotas tirpalas su ląstelėmis vėl paskirstomas į du 15 ml talpos mėgintuvėlius, ir ląstelės nusodinamos centrifuguojant (kaip aprašyta aukščiau).
Po visų išskyrimo etapų gautos ląstelės supilamos į vieną arba du mėgintuvėlius, užpilamos laikymo tirpalu ir dar kartą nusodinamos 1 minutę centrifuguojant 500 - 900 aps./min. greičiu. Po centrifugavimo nuo ląstelių nupilamas skystis ir jos užpilamos 3 - 4 ml ląstelių laikymo tirpalu.
Visi tirpalai, kuriais buvo užpilami tiek širdies raumens gabalėliai, tiek jau išskirtos ląstelės, prieš tai buvo filtruojami 0,45 m filtrais. Ląstelių išskyrimo metu mikroskopu nuolat buvo stebimas ir vertinamas ląstelių išsiskyrimas iš audinio. Pagal ląstelių išsiskyrimo intensyvumą buvo sprendžiama, kiek laiko jas purtyti prminio ir antrinio išskyrimo tirpaluose. Išskirtos širdies ląstelės buvo laikomos kambario temperatūroje ir eksperimentams naudotos praėjus 8 - 10 val. po išskyrimo.
3.3. Žiurkės širdies skilvelio miocitų išskyrimas
Darbui su gyvūnų širdies preparatais buvo gautas Lietuvos Respublikos valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos leidimas naudoti laboratorinius gyvūnus mokslo tiriamajam projektui (Nr. 0122, 2004.12.02.). Vienetiniai žiurkės širdies skilvelio miocitai (ŽSM) iš linijinių Wistar žiurkių širdžių buvo išskiriami taikant fermentinį miocitų izoliavimo metodą, visą suaugusio gyvūno širdį per aortą perfuzuojant išskyrimo tirpalais.
Žiurkei atlikus cerebralinę dislokaciją ir atidarius krūtinės lastą, nedelsiant į plakančią širdį buvo suleidžiama 0,5 ml heparino injekcija (5000 u/ml) tam, kad būtų išvengta kraujo sukrešėjimo ir širdies kraujagyslių užsikimšimo. Po to žiurkės širdis buvo atsargiai atpreparuojama ir, išėmus iš krūtinės ląstos, nedelsiant kanuliuojama (pincetais praverta aorta atsargiai užmaunama ant specialaus stiklinio vamzdelio) ant klasikinės Langendorfo perfuzinės sistemos (3.1 pav.). Ant kaniulės užmauta aorta buvo užspaudžiama segtuku ir nedelsiant pradedama perfuzija išskyrimo tirpalu. Tada aorta buvo patikimai priveržiama siūlu prie kaniulės ir nuo širdies pašalinami nereikalingi audiniai.
Dar prieš išskyrimo pradžią Langendorfo sistema buvo užpildoma išskyrimo tirpalu su 1 mg/ml JSA (>98 proc. grynumo) ir 1 mM Ca2+.
Pakabinus žiurkės širdį ant perfuzinės Langendorfo sistemos, širdis pirmiausia buvo praplaunama kambario temperatūros skyrimo tirpalu su 1 mM Ca2+. Šiuo tirpalu širdis buvo perfuzuojama 5 - 8 min. ir, širdžiai susitraukinėjant, iš jos buvo išplaunamas kraujas. Tirpalas per širdį tekėjo maždaug 4 ml/min. greičiu, o perfuzijos greitis buvo reguliuojamas didinant arba mažinant žarnelių, per kurias tekėjo tirpalai, užspaudimą. Po to širdis apie 5 - 10 min. buvo plaunama +37° C temperatūros bekalciniu skyrimo tirpalu su 1 mg/ml JSA.
Praplovus širdį bekalciniu tirpalu, buvo pradedama perfuzija +37° C temperatūros išskyrimo tirpalu, į kurį įdėti širdies jungiamąjį audinį ardantys fermentai. Į 30 ml išskyrimo tirpalo su JSA (1 mg/ml) buvo dedama 15 mg kolagenazės (type 2; 281 u/mg, Worthington). Po 8 - 10 min. perfuzijos šiuo fermentiniu tirpalu jis buvo pakeičiamas šviežiai pagamintu tokiu pačiu fermentiniu išskyrimo tirpalu, ir žiurkės širdies perfuzija buvo tęsiama dar 5 - 10 min. +37° C temperatūroje (perfuzijos laikas priklauso nuo širdies dydžio ir būklės).
3.1 pav. Langendorfo perfuzinės sistemos schema. Pastaba: kaniulė (D) įkišama į žiurkės širdies aortą ir širdis patalpinama termostatuojamoje kameroje (E). Širdis perfuzuojama
tirpalais, kuriais užpildytos Langendorfo sistemos talpos (A). Tirpalai iš kolbų patenka į termostatinį tirpalų šildytuvą (B), kuriame sušildomi iki +37° C temperatūros. Burbulų gaudyklė (C) neleidžia perfuzijos metu į širdį patekti susidarantiems oro burbuliukams.
Po širdies audinių suardymo fermentais, širdis apie 5 min. buvo plaunama bekalciniu skyrimo tirpalu su 1 mg/ml JSA (+37° C temperatūros). Širdį perfuzuojant +37° C temperatūros skyrimo tirpalais, ji buvo laikoma atitinkamu tirpalu užpildytoje +37° C temperatūros termostatuojamoje kameroje. Tirpalo perteklius iš termostatuojamos kameros į Langendorfo sistemos perfuzinę talpą buvo grąžinamas naudonant peristaltinį siurbliuką. Po perfuzijos širdis buvo
nuimama nuo Langendorfo sistemos ir praplaunama nuo fermentų kambario temperatūros bekalciniame išskyrimo tirpale (25 ml) su JSA (1 mg/ml) bei pašalinami prieširdžiai. Po to skilvelio audinys perkeliamas į kolbelę su 15 ml bekalcinio tirpalo, čia sukarpomas ir švelniai purtomas, pipete maišant tirpalą. Gauta ląstelių suspensija atskiriama nuo raumens gabalėlių, filtruojant tirpalą nailoniniu filtru, ir supilama po 5 ml į du 15 ml tūrio mėgintuvėlius. Mėgintuvėliai papildomi bekalciniu išskyrimo tirpalu iki 10 ml ir dedami į stalinę centrifugą, kur ląstelės nusodinamos, 1 min. centrifuguojant 500 - 900 aps./min. greičiu. Po centrifugavimo nuo nusodintų ląstelių pipete nusiurbiamas tirpalas, jos užpilamos 4 - 5 ml bekalcinio skyrimo tirpalo. Ca2+ koncentracija šiame tirpale palaipsniui didinama iki 1 mM. Visi išskyrimo metu naudoti tirpalai prieš naudojimą buvo filtruojami 0,45 m filtrais bei įsotinami deguonimi. Išskirtos širdies ląstelės buvo laikomos kambario temperatūroje ir eksperimentams naudotos 8 - 10 val. po išskyrimo.
3.4. Varlės širdies skilvelio miocitų išskyrimas
Vienetiniai varlės (Rana temporaria) širdies skilvelio miocitai (VSM) buvo išskiriami taikant fermentinį miocitų izoliavimo metodą [199]. Specialia adata suardžius varlės stuburo ir galvos smegenis, buvo atpreparuojama varlės širdis. Atpreparuota širdis įdedama į 25 ml talpos stiklinėlę, pripildytą atšaldytu (iki +8° C) ir deguonimi įsotintu ląstelių išskyrimo tirpalu, į kurį papildomai buvo įdėta 80 M CaCl2. Čia širdis buvo praplaunama nuo kraujo bei
pašalinami nereikalingi audiniai. Po to širdis perkeliama į Petri lėkštelę, užpildytą atšaldytu ir deguonimi įsotintu skyrimo tirpalu su 80 M CaCl2, kur
širdis buvo kanuliuojama, t.y. per aortą (ją praveriant pincetais) į skilvelį buvo įkišamas specialus stiklinis vamzdelis. Širdis prie kaniulės pritvirtinama, aortą užveržiant siūlu. Prieš kanuliavimą kaniulė buvo užmaunama ant 20 ml talpos švirkšto, pripildyto atšaldytu skyrimo tirpalu su 80 M CaCl2. Kai širdis buvo
pritvirtinta prie kaniulės, atsargiai spaudžiant švirkštą, širdis dar kartą praplaunama ir patikrinama širdies perfuzija (t.y. kaip lengvai skystis spaudimo metu pasišalina iš skilvelio). Jei skystis iš išplėsto skilvelio nepasišalino, skilvelis buvo šiek tiek įkerpamas, kad tirpalas ištekėtų iš širdies. Kai širdies perfuzija buvo pakankama, kaniulė su pritvirtinta širdimi pernešama ant klasikinės Langendorfo perfuzinės sistemos. Dar prieš išskyrimo pradžią Langendorfo sistema būdavo praplaunama išskyrimo tirpalu su 1 mg/ml JSA (>98 proc. grynumo) ir 20 M EGTA, kad būtų surišamas ir išplaunamas
sistemoje esantis Ca2+, tik po to Langendorfo sistemos talpos buvo pripildomos ląstelių išskyrimo tirpalais. Visi išskyrimo metu naudoti tirpalai prieš naudojimą buvo filtruojami 0,45 m filtrais bei įsotinami deguonimi.
Pakabinus varlės širdį ant perfuzinės Langendorfo sistemos, širdis visų pirmiausia buvo praplaunama bekalciniu skyrimo tirpalu su JSA (1mg/ml) ir 20 M EGTA. Tokia širdies perfuzija vyko 10 - 15 min. +30° C temperatūroje. Tirpalas per širdį tekėjo apie 4 ml/min. greičiu, o perfuzijos greitis buvo reguliuojamas didinant arba mažinant žarnelių, per kurias tekėjo tirpalai, užspaudimą. Po to širdis buvo perfuzuojama skyrimo tirpalu, į kurį buvo įdėta širdies jungiamąjį audinį ardančių fermentų. Į 25 ml išskyrimo tirpalo su JSA (1 mg/ml) buvo dedama 3 mg kolagenazės (Yacult S; 500 u/mg aktyvumo) ir 10 mg tripsino (type XIII). Tokiu +30° C temperatūros fermentiniu tirpalu ląstelės perfuzija vyko apie 10 min. Po to perfuzija buvo atliekama dar kartą tokios pat sudėties naujai pagamintu fermentiniu tirpalu. Antrą kartą širdis buvo perfuzuojama 10 - 15 min., priklausomai, nuo širdies dydžio ir būklės. Tiek širdį praplaunant bekalciniu tirpalu su EGTA, tiek fermentiniais išskyrimo tirpalais, širdis buvo laikoma atitinkamu tirpalu pripildytoje termostatuojamoje kameroje (+30° C). Iš termostatuojamos kameros tirpalo perteklius į Langendorfo sistemos perfuzinę talpą buvo grąžinamas panaudojant peristaltinį siurbliuką.
Po perfuzijos širdis nuo fermentų praplaunama išskyrimo tirpale (25 ml) su JSA (1 mg/ml) ir pašalinami prieširdžiai. Skilvelis perkeliamas į indelį su 20 ml skyrimo tirpalo su 80 M Ca2+. Atsargiai įkerpama skilvelio siena ir pincetu
iš skilvelio išpurtomos ląstelės. Ląstelės laikomos skyrimo tirpale (50 ml), kuris papildomas aminorūgščių rinkiniu (MEM, SIGMA) bei penicilino (200 u/ml) ir streptomicino (0,2 mg/ml) mišiniu (SIGMA). Ląstelių laikymo tirpale Ca2+ koncentracija nuo 80 M palaipsniui didinama iki 1 mM. Ląstelių suspensija paskirstoma po 3 - 4 ml į užsukamus 5 ml tūrio mėgintuvėlius, kuriuose iki eksperimento laikoma +4° C temperatūroje.
3.5. L tipo Ca2+ srovės registracija
Šio tyrimo metu L tipo Ca2+ srovė (ICa,L) vienetiniuose žmogaus, žiurkės
ir varlės širdies miocituose registruota fiksuotos įtampos metodu (angl.
"whole-cell patch clamp"). Visos ląstelės “patch-clamp” metodu matuojama srovė,
tekanti per visus membranoje esančius veiklius kanalus. Norint registruoti ląstelės ICa,L, kitos per ląstelės membraną tekančios srovės buvo blokuojamos.
Visos K+ jonų srovės buvo nuslopintos tiek išoriniame, tiek vidiniame kontroliniame tirpale K+ jonus pakeičiant Cs+ jonais. Žmogaus ir žiurkės ląstelėse Na+ kanalų slopinimui prieš ICa,L registravimą ląstelės membrana buvo
depoliarizuojama nuo -80 mV ramybės potencialo iki -50 mV (impulso trukmė - 50 ms), be to, į išorinį tirpalą buvo įdedama 3 M tetrodotoksino (TTX). Kad būtų blokuojami Na+ kanalai varlės širdies ląstelėse, į išorinį fiziologinį tirpalą buvo įdedama 0,5 M TTX.
ICa,L registracijai ir analizei naudotas automatizuotas “patch-clamp”
stiprintuvas „VP500“ (Bio-Logic, Prancūzija) bei programinė įranga „Visual-Patch v1.30“ (Bio-Logic, Prancūzija). Kalcio jonų srovės registracijos metu ląstelė buvo depoliarizuojama kas 8 sek. nuo -80 mV palaikomojo pastovaus ramybės potencialo iki 0 mV. Registruojant ICa,L žmogaus ir žiurkės
kardiomiocituose, depoliarizuojamojo impulso trukmė buvo 400 ms (3.2 pav. B), o varlės širdies ląstelėse – 200 ms. ICa,L amplitude buvo laikomas skirtumas
tarp registruojamos srovės maksimumo ir srovės, registruotos depoliarizuojamojo impulso paskutinę milisekundę vertės.
Tiriamos ląstelės buvo dedamos į Petri lėkštelę, esančią ant invertuoto mikroskopo stalelio, pripildytą ir praplaunamą išoriniu perfuzijos tirpalu. Eksperimentai buvo atliekami tik su ląstelėmis, kurios neturėjo vizualiai pastebimų formos arba struktūros pakitimų.
Išorinio tirpalo pakeitimas ties tiriama ląstele buvo atliekamas naudojant automatinį tirpalų pakeitėją RSC-200 (Bio-Logic, Prancūzija). Kontrolinis išorinės perfuzijos tirpalas ir išoriniai tirpalai su tiriamomis veikliosiomis medžiagomis buvo patiekiami ant ląstelės, ją patalpinant ties 800 m skersmens kapiliaro anga, per kurią buvo leidžiamas norimos sudėties išorinis tirpalas. Tirpalo tėkmės greitis buvo apie 150 l/min. Visi naudoti tirpalai prieš tai buvo nufiltruoti 0,45 m filtrais.
Eksperimentų metu naudotos iš stiklinių kapiliarų (Drummond, JAV) pagamintos mikropipetės, kurios buvo gaminamos dviejų žingsnių tempimo būdu mikropipečių gamybai skirtu prietaisu (PP- 830, Narishige, Japonija). Mikropipetės buvo pripildomos vidinio kontrolinio tirpalo. Jų varža, įmerkus jas į išorinį fiziologinį tirpalą, buvo 0,6 - 1,3 M. Prieš prisiurbiant ląstelę prie mikropipetės, buvo kompensuojamas fazinis potencialas (angl. "junction
potential") tarp išorinio ir vidinio pipetės tirpalų. ICa,L registracijos metu (3.2 A
pav.) šis potencialų skirtumas buvo kompensuojamas automatiškai. Mikropipetės galiuko skersplotyje esanti ląstelės membrana buvo pramušama panaudojus -1 V, 500 ms trukmės elektrinį impulsą.
3.2 pav. L tipo Ca2+ srovės registracija visos ląstelės patch klampo metodu.
Pastaba: visos ląstelės patch klampo metodu registruojama Ca2+ srovė, tekanti per visus ląstelės membranoje esančius L tipo Ca2+ kanalus. Šių eksperimentų metu kontroliuojama ir keičiama
išorinio tirpalo sudėtis. Be to, ląstelė dializuojama mikropipetę užpildančiu vidiniu tirpalu, kurio sudėtis eksperimento metu nebuvo keičiama (A). Žiurkės ir žmogaus širdies miocitų L tipo Ca2+ srovė registruota kas 8 sek. depoliarizuojant ląstelę nuo -80 mV palaikomojo ramybės
potencialo iki -50 mV (50 ms), po to iki 0 mV (impulso trukmė - 400 ms). ICa,L amplitude laikomas skirtumas tarp registruotos srovės maksimumo ir 400-ąją milisekundę registruotos
srovės (B).
Eksperimentai buvo atliekami kambario temperatūroje (+18 - +22 oC), eksperimento metu temperatūra nekito daugiau nei vienu laipsniu.
3.6. Širdies raumenėlių elektromechaninių parametrų registracija
Operacijų metu izoliuoti žmogaus širdies preparatai transportavimui į laboratoriją buvo dedami į atšaldytą iki +4° C temperatūros kardiopleginį šv. Tomo tirpalą. Žiurkių širdys išimtos iš krūtinės ląstos taip pat buvo dedamos į šaltą kardiopleginį šv. Tomo tirpalą, iš jų buvo atpreparuojami raumenėliai eksperimentams. Raumenėliai (ilgis - apie 3-4 mm, storis - 1-2 mm), iš abiejų galų buvo užrišami paliekant kilpeles. Vienas raumenėlio galas buvo
