Proposta di linee guida per la determinazione degli anticorpi anti-citoplasma nei neutrofili (ANCA)
R.A. Sinicoa, A. Radicea, E. Tonuttib, D. Villaltac, N. Bizzarod, R. Tozzolie, P. Rizzottif, per il Forum Interdisciplinare per la Ricerca nelle Malattie Autoimmuni (FIRMA)
aDivisione di Nefrologia, Ospedale San Carlo Borromeo, Milano
bIstituto di Chimica Clinica, Azienda Ospedaliera S. Maria della Misericordia, Udine
cServizio di Immunologia e Microbiologia, Azienda Ospedaliera S. Maria degli Angeli, Pordenone
dLaboratorio di Patologia Clinica, Ospedale Civile, S.Donà di Piave (VE)
eDipartimento di Medicina di Laboratorio, Ospedale Civile, Latisana (UD)
fLaboratorio di Chimica Clinica ed Ematologia, Azienda Ospedaliera, Verona
Introduzione
Questa proposta di linee guida per la determinazio- ne degli anticorpi anti-citoplasma dei neutrofili è stata messa a punto dal Forum Interdisciplinare per la Ricerca nelle Malattie Autoimmuni (FIRMA), un gruppo italiano costituito da specialisti di diverse di- scipline cliniche (immunologi clinici, internisti, reu- matologi, patologi clinici, nefrologi e dermatologi) esperti nel campo della diagnostica clinica e di labo- ratorio delle malattie autoimmuni. Le raccomanda- zioni contenute in queste linee guida sono derivate dalla più recente letteratura scientifica e dalle indi- cazioni fornite dal gruppo di esperti in una Consensus Conference tenutasi a Monteriggioni (Siena) dal 18 al 20 gennaio 2001.
Indicazioni cliniche
Gli anticorpi anti-citoplasma dei neutrofili (ANCA) sono degli autoanticorpi diretti verso costituenti ci- toplasmatici dei granulociti neutrofili (e monociti);
sono considerati un utile marker sierologico per la diagnostica delle vasculiti primarie sistemiche, quali in particolare la granulomatosi di Wegener (GW) e la poliangioite microscopica (PAM), inclusa la sua variante limitata al rene (la glomerulonefrite necro- tizzante extracapillare "pauci-immune") e, in misura minore, la sindrome di Churg-Strauss1,2 (Tab. I). Le ragioni più frequenti per la richiesta di una determi- nazione degli ANCA sono appunto la diagnosi e/o il monitoraggio delle vasculiti sistemiche primitive3. In presenza di manifestazioni cliniche che suggeri- scono una diagnosi di GW o PAM, quali una sindro- me rene-polmone, un quadro di glomerulonefrite ra-
pidamente progressiva, una vasculite cutanea con sintomi sistemici, noduli polmonari multipli, stenosi tracheale, lesioni destruenti a carico delle alte vie respiratorie, masse retro-orbitarie, mononeurite multipla (Tab. II), la dimostrazione degli ANCA nel siero del paziente ha un’elevata sensibilità (> 90%) e specificità (> 90%) e, di conseguenza, un alto va- lore predittivo per queste malattie4-7. In altre situa- zioni cliniche ANCA-associate (es., malattie infiam- matorie intestinali croniche, epatiti e colangiti au- toimmuni, connettiviti), l’utilità diagnostica è infe- riore8,9. L'identificazione degli ANCA potrebbe, tut- tavia, rivestire un ruolo significativo nella diagnosi differenziale tra rettocolite ulcerosa (RCU) e morbo di Crohn (MC). Nelle vasculiti ANCA-associate il titolo degli ANCA correla, in genere, con l’attività della malattia, anche se non sono rare le eccezioni10.
Test disponibili
Lo studio europeo di standardizzazione delle metodi- che ha dimostrato che gli ANCA sono più corretta- mente rilevati mediante l’uso combinato di una me- todica di immunofluorescenza indiretta (IFI) su leu- cociti umani normali fissati in etanolo e di tecniche ELISA per il dosaggio degli ANCA specifici per la proteinasi 3 (PR3) e la mieloperossidasi (MPO).
L’associazione dei 2 metodi consente di ottenere una specificità > 95%6. Nella fase di screening è consi- gliabile l’esecuzione di entrambe le metodiche, poi- ché esistono campioni positivi soltanto in uno dei due test (5%). Qualora non sia possibile eseguire si- stematicamente entrambi i test, il loro uso combinato è comunque indispensabile nei casi con un forte so- spetto clinico di vasculite ANCA-associata.
I sieri ANCA positivi da pazienti affetti da vasculiti sistemiche primitive producono all'IFI due patterns caratteristici:
- C-ANCA: colorazione citoplasmatica granulare diffusa, spesso con accentuazione dell'intensità della fluorescenza tra i lobi nucleari. Questo pattern è as- sociato nel 90-95% dei casi alla presenza di autoan- ticorpi specifici per la PR3.
- P-ANCA: colorazione perinucleare e/o nucleare, causata nell’80% circa dei casi dalla presenza di MPO-ANCA (include i cosiddetti GS-ANA).
Nella maggior parte dei pazienti affetti da GW in forma attiva e generalizzata si riscontrano C-ANCA con specificità per la PR3, in circa il 20-30% si tro- vano invece P-ANCA con specificità per la MPO.
Circa il 70-80% dei pazienti affetti da poliangioite microscopica o glomerulonefrite extracapillare ne- crotizzante pauci-immune presenta P-ANCA speci- fici per la MPO mentre il 30% ha C-ANCA specifici per la PR3. Occasionalmente sono stati descritti quadri C-ANCA/MPO-ANCA e P-ANCA/PR3-AN- CA11,12.
ANCA (sia C che P) sono presenti anche nel 40- 60% dei pazienti affetti da sindrome di Churg- Strauss.
P-ANCA o patterns fluoroscopici atipici sono de- scritti, con diversa prevalenza, in pazienti affetti da malattie intestinali infiammatorie croniche, epatopa- tie e malattie reumatologiche8,9. Sono causati da anti- corpi diretti contro antigeni (lattoferrina, elastasi, bactericidal/permeability increasing protein, beta- glicuronidasi, catepsina G, azurocidina, lisozima, high mobility group proteins, alfa-enolasi, actina, catalasi e altri non ancora identificati) diversi da quelli generalmente associati alle vasculiti (PR3 e MPO), il cui ruolo patogenetico e/o significato clini- co sono ignoti.
P-ANCA e ANCA atipici possono essere rilevati in corso di alcune vasculiti iatrogeniche.
Deve essere ribadito che il solo riscontro di positivi- tà ANCA, in assenza di dati clinici indicativi, non può essere considerato diagnostico e motivare l'ini- zio di un trattamento terapeutico.
Immunofluorescenza indiretta (IFI)
Requisiti minimi da rispettare per una corretta dia- gnostica (Fig. 1):
• Esecuzione del test IFI su tutti i sieri dei pazienti nuovi (circa il 10% degli ANCA nelle vasculiti è dimostrabile solo mediante questa metodica).
• Campioni di pazienti noti, positivi solo in IFI, possono essere successivamente testati solo con questa metodica anche se, talvolta, gli autoanti- corpi possono diventare rilevabili anche in ELI- SA in un secondo tempo. Sieri che sono risultati positivi o nel PR3 o nel MPO-ELISA possono
essere testati successivamente solo per l'antigene rilevante, dal momento che è un’evenienza assai rara un cambio di specificità antigenica.
• È opportuno utilizzare come substrato per l'IFI una preparazione contenente sia neutrofili che linfociti. P-ANCA e ANCA atipici reagiscono so- lo con neutrofili e monociti, mentre gli ANA rea- giscono con i nuclei di tutte le cellule (per questo la presenza di linfociti nei citocentrifugati aiuta a discriminare tra ANCA e ANA). Talvolta, in pre- senza di un quadro P-ANCA, si può notare una fluorescenza nucleare dei linfociti vicini ai neu- trofili positivi a causa del leakage (causato dal fissativo) di componenti citoplasmatiche dei gra- nulociti che aderiscono successivamente ai nu- clei dei linfociti vicini.
Suggerimenti per una diagnostica ottimale:
• Tutti i campioni positivi in IFI e negativi nei test ELISA specifici per la PR3 e la MPO dovrebbero essere titolati.
• Titolare i sieri se, oltre agli ANCA, sono presenti ANA o altre positività non meglio caratterizzate, potenzialmente interferenti. In questi casi può es- sere utile testare e titolare nella stessa seduta, il campione nuovo e il positivo precedente dello stesso paziente. Se le uniche cellule fluorescenti sono granulociti e monociti (linfociti negativi quando presenti nel substrato) non è indispensa- bile la titolazione dei sieri.
• L’utilizzo di substrati cellulari fissati con forma- lina può essere utile in alcune circostanze sia per discriminare tra diverse condizioni patologiche che per descriverle in modo più esauriente. I P- ANCA mostrano un pattern citoplasmatico su vetrini fissati con formalina mentre gli ANA per- dono in genere la loro reattività; gli ANCA atipi- ci, che sono un gruppo molto eterogeneo, posso- no mostrare pattern citoplasmatico o diventare negativi13.
Figura 1. Procedura diagnostica per la determinazione degli ANCA.
Commenti:
• I campioni di siero da testare non devono essere inattivati al calore; questa pratica può procurare risultati falsi-positivi.
• La diluizione ottimale dei sieri va stabilita in ogni laboratorio in base alle diverse variabili analitiche; generalmente essa varia tra 1: 20 e 1:40.
• L’aggiunta di sieroalbumina umana all’1% al tampone di diluizione e lavaggio (generalmente
PBS), può contribuire ad eliminare la fluorescen- za di fondo.
• È preferibile utilizzare un antisiero secondario anti-IgG piuttosto che anti-Ig totali, perchè sod- disfa le esigenze diagnostiche e riduce la fluore- scenza di fondo, evitando risultati falsamente po- sitivi.
• L’uso di controcoloranti quali l’Evans blue dimi- nuisce l’intensità della fluorescenza e può ma- scherare i deboli positivi.
• È indispensabile la disponibilità di un sistema ot- tico efficiente, possibilmente calibrato con stan- dards a diversa intensità di fluorescenza.
ELISA ANTIGENI
Requisiti minimi:
• I produttori dei kit commerciali devono sempre specificare la metodica di purificazione; se gli antigeni sono purificati “in house”, deve essere
Tabella I. Percentuale di positività dei diversi pattern di fluorescenza e delle specificità antigeniche nelle malattie ANCA-associate (PR3, proteinasi 3; MPO, mieloperossidasi; LF, lattoferrina; ELA, elastasi; GS-ANA, anticorpi anti-nucleo granulocita-specifici).
ANCA positività Antigene bersaglio
pattern %
VASCULITI SISTEMICHE
1. Granulomatosi di Wegener C-ANCA PR3 (70-80%)
(forme generalizzate) (80-90%)
P-ANCA MPO (20-30%)
2. Poliangioite microscopica C-ANCA PR3 (20-30%)
(80-85%)
P-ANCA MPO (70-80%)
3. Sindrome di Churg Strauss C-ANCA PR3 (30-40%)
(50%)
P-ANCA MPO (60-70%)
4. Poliarterite nodosa classica P-ANCA (10%) MPO (90%)
GLOMERULONEFRITE NECROSANTE C-ANCA PR3 (20%)
PAUCI-IMMUNE IDIOPATICA (80%)
P-ANCA MPO (80%)
MALATTIE REUMATICHE
1. Artrite Reumatoide GS-ANA/P-ANCA (30% ?) LF, sconosciuto ANCA atipici
2. Lupus Eritematoso Sistemico P-ANCA (<20%) LF, ELA, MPO
Tabella II. Principali indicazioni cliniche per la ricerca degli ANCA
• sindrome polmonare-renale / emorragia polmonare
• glomerulonefrite rapidamente progressiva
• vasculite cutanea con sintomi sistemici
• noduli polmonari / lesioni croniche destruenti delle alte vie aeree
• sinusiti e otiti croniche
• stenosi tracheale subglottica / massa retro-orbitaria
• mononeuriti multilple
scelta una procedura che causi la minore denatu- razione delle proteine antigeniche.
• Antigeni nativi (estrattivi) sono a tutt’oggi da preferire a quelli ricombinanti, la cui validità e utilità deve essere ancora verificata.
• Quando si utilizzano preparazioni antigeniche nuove, si cambiano le caratteristiche o la marca dei kit commerciali in uso, i risultati devono es- sere confrontati e validati in rapporto alla “vec- chia preparazione”.
Requisiti ottimali:
La purezza degli antigeni preparati in laboratorio dovrebbe essere controllata in ELISA e/o Western- blot, con l’ausilio di antisieri policlonali e monoclo- nali specifici, per verificare un’eventuale contami- nazione di antigeni ANCA minori, in particolare la lattoferrina.
TEST
Requisiti minimi per una corretta diagnostica:
• I campioni devono essere esaminati in duplicato.
• I campioni positivi per ANCA in IFI, con fluore- scenza tipica o atipica e tutti i sieri con ANA po- sitività devono essere testati in fase solida per la ricerca di PR3-ANCA e MPO-ANCA.
• I campioni precedentemente positivi per PR3- ANCA o MPO-ANCA possono essere testati suc- cessivamente soltanto nell’appropriato ELISA (PR3-ANCA o MPO-ANCA) dal momento che un cambiamento della specificità antigenica ber- saglio degli ANCA in pazienti affetti da GW o PAM è evenienza eccezionale.
• In ogni piastra devono essere sempre inclusi con- trolli positivi e negativi, eventuali controlli interni e “bianchi”; i risultati devono essere calcolati per estrapolazione da una curva costruita mediante di- luizioni scalari degli standard (almeno 5 punti).
Suggerimenti per una diagnostica ottimale:
• Tutti i campioni di siero (anche quelli negativi all’IFI), in presenza di fondato sospetto clinico, dovrebbero essere testati in ELISA Ag-specifici per la ricerca di PR3-ANCA e MPO-ANCA poi- ché il 5% dei sieri di pazienti affetti da vasculiti ANCA-associate sono positivi soltanto nei test in fase solida.
• I test devono consentire determinazioni quantita- tive e con coefficienti di variabilità intra e inter- assay inferiori al 20%.
• La scelta del cut-off deve essere sempre verifica- ta in ciascun laboratorio (anche per i kit commer- ciali); il valore deve essere calcolato dopo avere valutato un adeguato numero di controlli sani e patologici. Idealmente, per assicurare una sensi-
bilità e specificità ottimali, dovrebbero essere calcolate le receiver operating characteristic curves (ROC) per ciascun test ELISA, conside- rando almeno una specificità del 90% verso le patologie di controllo. In alternativa si può consi- derare un range di normalità calcolato come la media delle unità arbitrarie ±2 deviazioni stan- dard3.
• Talvolta può essere utile confrontare, nella stessa seduta analitica, campioni precedentemente posi- tivi e campione nuovo positivi dello stesso pa- ziente.
Commenti:
• E’ disponibile un siero di riferimento per C-AN- CA specifico per la PR3 (contattare Dr. A. Wiik.
Statens Seruminstitut, Denmark, e-mail [email protected]).
• Un legame aspecifico dovrebbe essere sospettato quando nello stesso campione sono rilevati con- temporaneamente PR3-ANCA e MPO-ANCA a basso titolo. Non ci sono standard per PR3 e MPO-ANCA, i risultati devono perciò essere espressi in unità arbitrarie.
• Nella routine diagnostica delle vasculiti ANCA- associate è necessario e sufficiente testare i sieri in sistemi ELISA PR3 e MPO-specifici, in quan- to sono questi gli antigeni clinicamente rilevanti in termini di prevalenza e significato diagnostico.
Non è consigliato l'utilizzo di test diagnostici per l'identificazione delle specificità minori ANCA- correlate (lattoferrina, lisozima, elastasi, BPI e altre), in quanto non è stata dimostrata finora una correlazione con patologie o quadri clinici pecu- liari.
Refertazione dei risultati degli ANCA
• Per una corretta interpretazione dei risultati com- plessivi, i risultati ottenuti nei test IFI ed ELISA dovrebbero essere comunicati contemporanea- mente; se ciò non fosse praticabile, i risultati de- gli ELISA dovrebbero seguire il prima possibile i risultati dell'IFI.
• I risultati dei test ELISA vanno riportati in termi- ni quantitativi come unità arbitrarie. Può essere utile una definizione quantitativa-discreta dei ri- sultati, cioè in range, secondo lo schema: negati- vo, basso positivo, medio positivo e alto positivo.
Nomenclatura14
• C-ANCA: classica fluorescenza granulare cito- plasmatica con accentuazione centrale o interlo- bulare.
• C-ANCA (atipico o omogeneo): fluorescenza diffusa omogenea senza accentuazione interlobu- lare.
• P-ANCA: fluorescenza perinucleare con o senza estensione nucleare; include gli ANA granulocita specifici.
• ANCA atipico: include tutte le altre fluorescenze granulocita o monocita-specifiche.
Commenti:
• L'utilizzo dei termini C-ANCA e P-ANCA inve- ce di cANCA e pANCA è da preferire in quanto in conformità con lo stile utilizzato per la descri- zione delle specificità antigeniche (PR3-ANCA e MPO-ANCA).
• L'intensità della fluorescenza dovrebbe essere ri- portata come negativa, debolmente positiva, po- sitiva o fortemente positiva solo sulla base della diluizione di screening.
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