LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
MEDICINOS FAKULTETAS
LABORATORINĖS MEDICINOS BIOLOGIJA ANTROS PAKOPOS STUDIJOS
Aurelija Ročytė
SU PR3 IR MPO ANCA SUSIJUSIŲ LIGŲ IMUNODIAGNOSTIKOS
YPATUMAI
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė: Dr. Viltė Marija Gintauskienė
2
TURINYS
SANTRUMPOS ...8
ĮVADAS ...9
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ...11
1. LITERATŪROS APŽVALGA ...12
1.1 Vaskulitų paplitimas ...12
1.2 Vaskulitų klasifikacija ...12
1.3 Vaskulitų etiopatogenezė ir išsivystymo mechanizmas ...14
1.3.1 Specifinių ANCA prieš PR3 ir MPO samprata ir aktualumas ...15
1.3.2 ASV išsivystymo priežastys ir veiksniai ...18
1.3.3 Su PR3 ir MPO ANCA susijusių vaskulitų etiopatogenezė ir išsivystymo mechanizmai ...19
1.3.4 ANCA klasifikacija tiriant netiesioginės imunofluorescencijos metodu ...22
1.3.5 Antikūnų prieš neutrofilų citoplazmos antigenus diagnostika ...23
1.3.6 ASV sąsajos su klinikiniais ir laboratoriniais tyrimais ...24
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI ...25
2.1 Tiriamųjų kontingentas ...25
2.2 ANCA tyrimo metodika ...26
2.2.1 Tyrimo eiga ...26
2.2.2 Reagentų paruošimas ir stabilumas ...28
2.2.3 Tyrimo charakteristika ...28
2.2.4 Tyrimo vertinimas ...28
2.3 C-reaktyvaus baltymo (CRB) tyrimo metodika ...29
2.4 Reumatoidinio faktoriaus (RF) tyrimo metodika ...30
2.5 Antikūnų prieš ciklinius citrulinius peptidus (anti-CCP) tyrimo metodika ...30
2.6 Antikūnų prieš dvispiralę deoksiribonukleorūgštį (anti-dsDNR) tyrimo metodika ...31
2.7 Statistinė duomenų analizė ...32
3. REZULTATAI ...33
3.1 Tiriamųjų demografinių ir laboratorinių duomenų analizė ...33
3.2 Tyrimų rezultatų analizė pagal ligų grupes ...35
3.3 Kiekybinių ir kokybinių laboratorinių tyrimų duomenų analizė pagal amžių ...37
3.4 pANCA su MPO ir cANCA su PR3 dažnis ...38
4. REZULTATŲ APTARIMAS ...40
IŠVADOS ...42
REKOMENDACIJOS ...43
LITERATŪRA ...44
3
SANTRAUKA
Laboratorinės medicinos biologija
SU PR3 IR MPO ANCA SUSIJUSIŲ LIGŲ IMUNODIAGNOSTIKOS YPATUMAI Aurelija Ročytė
Mokslinė vadovė dr. Viltė Marija Gintauskienė
Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos fakultetas. Kaunas; 2017.
Darbo tikslas: įvertinti ir nustatyti su PR3 ir MPO ANCA susijusių ligų imunodiagnostikos ypatumus.
Uždaviniai: 1. Nustatyti specifinių PR3 ir MPO antikūnų dažnį pacientams su teigiamais ANCA rezultatais. 2. Įvertinti teigiamų ANCA rezultatų bei PR3 ir MPO antikūnų pasireiškimą atsižvelgiant į klinikinę raišką. 3. Nustatyti specifinių ANCA PR3 ir MPO antikūnų dažnį atsižvelgiant į tiriamųjų amžių, lytį bei klinikinę raišką. 4. Įvertinti papildomų laboratorinių rodiklių (CRB, RF, anti-CCP ir anti-dsDNR) ypatumus, pacientams su teigiamais ANCA rezultatais, atsižvelgiant į lytį, amžių bei klinikinę raišką.
Metodai ir tyrimo objektas. Tirti pacientai, kuriems 2015–2017 laikotarpiu LSMU ligoninės Kauno klinikų Laboratorinės medicinos klinikoje buvo atlikti ANCA tyrimai. Remiantis gautais ANCA rezultatais, atrinkti 184 pacientai su teigiama ANCA. Jiems buvo nustatyti specifiniai ANCA PR3 ir MPO antikūnai kraujo serume.
Tyrimo rezultatai. Iš 184 tirtų pacientų mėginių, papildomai atlikus patvirtinamuosius ANCA tyrimus su specifiniais MPO ir PR3, 129 (70,1 proc.) pacientams gauti teigiami ANCA rezultatai. Dažniausiai (n=97) buvo rasta pANCA, kuri dažniau rasta moterims nei vyrams, o citoplazminis ANCA tipas – dažniau vyrams nei moterims. Tipiniai pANCA rezultatai kartu su MPO gauti 34 pacientams, sergantiems ASV, o tipiniai cANCA rezultatai kartu su PR3 gauti 10 pacientų su diagnozuota Wegener‘io granuliomatoze (p<0,001). Analizuojant laboratorinių tyrimų rezultatų vidurkius pacientų, su tipiniais pANCA MPO ir cANCA PR3, nustatytas C-reaktyvaus baltymo koncentracijos vidurkio padidėjimas virš normos ribų. RF koncentracijos vidurkio padidėjimas gautas tiriamiesiems su tipiniais cANCA PR3 rezultatais statistiškai reikšmingas (p<0,05).
Išvados: 1. Dažniausiai pacientams su teigiamais ANCA rezultatais, atliekant tyrimus netiesioginės imunofluorescencijos metodu, rasti specifiniai antikūnai prieš MPO ir kiek rečiau – specifiniai antikūnai prieš PR3. 2. Pacientams, sergantiems Wegener‘io granuliomatoze, dažniausiai rasti specifiniai cANCA ir PR3 antikūnai, o sergantiems ASV - pANCA ir MPO antikūnai. 3. Tipiniai pANCA MPO dažniau aptinkami vyresniems nei 51 m. amžiaus vyrams ir moterims, sergantiems ASV, o cANCA PR3 dažniau aptinkami 51–65 m. amžiaus vyrams, segantiems Wegener’io granuliomatoze bei ASV. 4. Vyresniems nei 65 m. amžiaus vyrams su tipiniais pANCA rezultatais,
4 sergantiems ASV, nustatyta didžiausia CRB koncentracija, RF – vyresnėms nei 65 m. amžiaus moterims su teigiamais cANCA, o anti-CCP ir anti-dsDNR – jaunesnėms moterims su netipiniais pANCA rezultatais, sergančioms vaskulitais susijusiais su sisteminėmis jungiamojo audinio ligomis.
5
SUMMARY
Biology of Laboratory Medicine
THE IMUNODIAGNOSTICS FEATURES OF DISEASES RELATED TO PR3 AND MPO ANCA
Aurelija Ročytė
Supervisor: dr. Viltė Marija Gintauskienė
Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Medicine. Kaunas; 2017.
The object of the work: to evaluate the immunodiagnostic features of the diseases, related to PR3 and MPO ANCA.
The objectives: 1. To set the frequency of specific PR3 and MPO antibodies for patients with positive ANCA results. 2. To evaluate the occurrence of specific ANCA PR3 and MPO antibodies according to the clinical presentation. 3. To set the frequency of specific ANCA PR3 and MPO antibodies according to the age, gender and clinical presentation of participants. 4. To assess the peculiarities of additional laboratory indices (CRB, RF, anti-CCP and anti-dsDNR) for patients with positive ANCA results in accordance with gender, age and clinical presentation.
Methodology and the object of the research: The participants of the research were those who had ANCA analyses in the clinic of Laboratory medicine of LSMU Kauno klinikos during the periodo of 2015 – 2017. Based on the obtained ANCA results, 184 patients with positive ANCA were selected. The specific ANCA PR3 and MPO antibodies were defined in blood serum of these patients. Results. 184 patients analyzed were additionally tested by sustaining ANCA tests with specific MPO and PR3 and 129 patients (70.1 %) with ANCA positive results were found. In most cases (n=97) pANCA was identified, which is more often found in women, and the cytoplasmic ANCA type - more common in men. The typical pANCA results with the MPO were obtained in 34 patients, suffering from ASV; and typical cANCA results with PR3 were found in 10 patients suffering from Wegener’s granulomatosis (p<0.001). The analysis of the averages of laboratory tests‘ results of patients with typical pANCA MPO and cANCA PR3 defined the increase above the normal range of the concentration average of C-reactive protein. The increase of RF average concentration obtained in patients with typical cANCA PR3 results is statistically significant (p<0,05).
Conclusions: 1. Performing indirect immunofluorescence in patients with ANCA positive results, more often specific antibodies against MPO are found wherease specific antibodies against PR3 are identified rarely. 2. Specific cANCA and PR3 antibodies are usually found for patients with Wegener’s granulomatosis, and pANCA and MPO antibodies are found for patients with ASV. 3. Typical pANCA MPO is more often determined for older than 51-year-old men and women suffering from ASV and cANCA PR3 is more frequently found among 51-65-year-old men with Wegener’s
6 granulomatosis and ASV. 4. The highest concentration of CRB is determined to men over 65 with typical pANCA and ASV, RF – for women over 65 with positive cANCA, and CCP and anti-dsDNR – for younger women with atypical pANCA results who suffer from vasculitides, related to diseases of systemic connective tissue.
7
INTERESŲ KONFLIKTAS
Autoriui interesų konflikto nebuvo.
ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS
Tyrimai atlikti LSMU ligoninės Kauno klinikų Laboratorinės medicinos klinikoje, Klinikinės chemijos ir genetikos laboratorijoje, gavus LSMU Bioetikos centro leidimą (Leidimas atlikti biomedicininį tyrimą 2015-11-06, Nr. BEC-LMB (M) – 78) (1 priedas).
8
SANTRUMPOS
ACR – (American College of Rheumatology)Amerikos reumatologijos kolegija
AFS – Antifosfolipidinis sindromas
ANA – Antikūnai prieš branduolio antigenus
ANCA – Antikūnai prieš neutrofilų citoplazmos antigenus Anti-CCP – Antikūnai prieš ciklinius citrulinius peptidus
Anti-dsDNR – Antikūnai prieš dvispiralę deoksiribonukleorūgštį
ASV – ANCA susiję vaskulitai
cANCA – Antikūnai prieš citoplazminius neutrofilų citoplazmos antigenus CHCC – (Chapel Hill Consensus Conference) Chapel Hill susitarimo
konferencija
CRB – C reaktyvus baltymas
CSS – Churg-Strauss sindromas
EGPA – Eozinofilinė granulomatozė su poliangitu
ENA – Antikūnai prieš ekstrabilius branduolio antigenus Fcγ – Kristalizacijos regiono fragmentas gama
GN – Glomerulonefritas
GPA – Granuliomatozė su poliangitu
LSMU – Lietuvos Sveikatos Mokslų universitetas
MPA – Mikroskopinis poliangitas
MPO – Mieloperoksidazė
NIF – Netiesioginė imunofluorescencija
pANCA – Antikūnai prieš perinuklearinius neutrofilų citoplazmos antigenus
PM – Polimiozitas
PR3 – Proteinazė 3
RA – Reumatoidinis artritas
RF – Reumatoidinis faktorius
SN – Statistiškai nereikšminga
SRV – Sisteminė raudonoji vilkligė
VTE – Venų tromboembolija
9
ĮVADAS
Pirmą kartą antikūnai prieš neutrofilų citoplazmos antigenus (ANCA) buvo paminėti 1982 m. Davis ir jo kolegų pacientui su segmentiniu nekroziniu glomerulonefritu [1–2]. Vėliau ANCA buvo aprašyti pacientams, sergantiems sisteminiu vaskulitu. Van der Woud ir bendradarbiai pirmieji teigė, kad naudojant netiesioginės imunofluorescencijos (NIF) metodą, kur substratas yra etanolyje fiksuoti neutrofilai, gauti teigiami ANCA tyrimo rezultatai, susiję su granulomatoze ir poliangitu (anksčiau vad. Wegener'io granulomatozei (WG)), yra naudingas rodiklis vertinant ligos aktyvumą [3–5]. A. Merkel atskleidė, kad antikūnai prieš perinuklearinius neutrofilų citoplazmos antigenus (pANCA) gali būti randami sergantiesiems jungiamojo audinio ligomis, įskaitant reumatoidinį artritą (RA), sisteminę raudonąją vilkligę (SRV), antifosfolipidinį sindromą (AFS), polimiozitą (PM) ir dermatomiozitą [3–4]. In vitro tyrimų rezultatai rodo, kad susidarę antikūnai prieš mieloperoksidazę (MPO) ir proteinazę-3 (PR3) veikiami naviko nekrozės faktoriaus alfa (TNFα), lipopolisacharidų arba aktyvuotu komplemento faktoriumi, sužadina neutrofilus, kurie sukelia kraujagyslių endotelio uždegiminį pažeidimą [6–7]. Aktyvuoti ANCA sudaro toksiškus deguonies radikalus, kurie sukelia ląstelių irimą ir gali sunaikinti endotelio ląsteleles in vitro [7].
ANCA laikomi patogenais, išlaisvinančiais lizės fermentus, kurie sukelia kraujagyslių uždegimą, atpalaiduoja reaktyvias deguonies formas ir sukelia sisteminius vaskulitus. Su ANCA susijusių vaskulitų (ASV) problema yra ta, kad sisteminiai nekrozuojantys vaskulitai, kurie, nepaisant pažangaus gydymo imunosupresantais, yra didelė mirtingumo priežastis. Su ANCA susijusių vaskulitų klinikinis pasireiškimas apima platų ligų apraiškos spektrą: nuo gyvybei pavojingos lokalizuotos ligos iki sisteminių organų pažeidimų [7]. Teisingas ištyrimas pradiniame ligos etape yra ypač svarbus, nes leidžia laiku diagnozuoti vaskulitus ir gali turėti įtakos kryptingam gydymo pasirinkimui, išvengiant klaidingo gydymo imunosupresantais pacientams be vaskulitų [8, 4, 9]. Didelius iššūkius kelia retų ligų, tokių kaip su ANCA susijusių vaskulitų, epidemiologijos tyrinėjimas (ASV) [10].
Esant klinikiniams simptomams teigiamas ANCA tyrimo rezultatas padeda patvirtinti diagnozę, o esant silpnai išreikštiems simptomams neigiamas rezultatas diagnozę atmeta. Įprastą klasikinį ANCA atrankos tyrimą papildžius granuliocitų substratais, kurių sudėtyje esama monospecifiškų MPO ir PR3 substratų, šis tyrimas įgyja dar daugiau diagnostinių privalumų. Teigiami rezultatai gali būti patvirtinti tos pačios tyrimo procedūros metu, o nespecifiniai ar neaiškūs fluorescenciniai vaizdai gali būti įvertinti su didesniu tikslumu. Dažnai ANCA antikūnų nustatymas naudojamas smulkiąsias kraujagysles apimančių vaskulitų diagnozei patvirtinti arba atmesti bei šių ligų uždegiminiam aktyvumui stebėti. Kai kurių kitų ligų, pavyzdžiui, uždegiminės žarnų ligos, pirminio sklerozuojančio cholangito atvejais, rekomenduojama nustatyti ANCA. Tai palengvina diferencinę diagnozę bei suteikia tam tikros papildomos informacijos [11–12].
10 Su ANCA susiję vaskulitai yra liga visam laikui pakeičianti paciento gyvenimą. Dar neseniai vaskulitai buvo vadinami blogos prognozės ligomis, nes tyrimų galimybės buvo ribotos, o gydymo dažnas pacientas netoleruodavo. Atsiradus naujoms tyrimų galimybėms (ANCA specifinių antikūnų prieš PR3 ir MPO nustatymas), iš esmės pasikeitė šių pacientų prognozę. Taigi tiksli ankstyva diagnostika ir laiku pradėtas gydymas gali žymiai pagerinti ligos eigą ir baigtį bei paciento gyvenimo kokybę [13].
11
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: įvertinti ir nustatyti su PR3 ir MPO ANCA susijusių ligų imunodiagnostikos ypatumus.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti specifinių PR3 ir MPO antikūnų dažnį pacientams su teigiamais ANCA rezultatais.
2. Įvertinti teigiamų ANCA rezultatų bei PR3 ir MPO antikūnų pasireiškimą atsižvelgiant į klinikinę raišką.
3. Nustatyti specifinių ANCA PR3 ir MPO antikūnų dažnį atsižvelgiant į tiriamųjų amžių, lytį bei klinikinę raišką.
4. Įvertinti papildomų laboratorinių rodiklių (CRB, RF, anti-CCP ir anti-dsDNR) ypatumus, pacientams su teigiamais ANCA rezultatais, atsižvelgiant į lytį, amžių bei klinikinę raišką.
12
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Vaskulitų paplitimas
Vaskulitai – tai grupė retų, autoimuninių ligų, turinčių labai įvairių klinikinių požymių. Joms būdingas simptomas – kraujagyslių uždegimas su arba be nekrozės [2, 14]. Vaskulitai gali pažeisti dideles, vidutines ar mažas arterijas, arterioles, kapiliarus, venules ir venas. Jie gali būti pirminės kilmės su neatpažįstama priežastimi arba antrinės, kurį gali sukelti infekcija, piktybinis navikas arba kita autoimuninė liga [15]. Vaskulitai, tokie kaip granuliomatozė su poliangitu (GPA), mikroskopinis poliangitas (MPA) ir eozinofilinė granulomatozė su poliangitu (EGPA), dažniausiai pažeidžia smulkiąsias kraujagysles. Jie yra siejami su antikūnų prieš neutrofilų citoplazmos antigenus buvimu. MPA, GPA ir EGPA yra priskiriami su ANCA susijusių vaskulitų grupei [16].
Didžiausias sergamumas Europoje yra 46–184 ligos atvejai milijonui gyventojų per metus stebimas sergant ASV ligomis. GPA, MPA ir EGPA ligomis per metus vidutiniškai serga atitinkamai 2,1–14,4, 2,4–10,1 ir 0,5–3,7 žmonių iš milijono gyventojų. Šios ligos pasitaiko dažniau vyresniems nei 60 metų pacientams ir yra šiek tiek labiau paplitusios tarp vyrų. Penkerių metų išgyvenamumas sergantiesiems GPA, MPA ir EGPA ligomis nustatytas atitinkamai 74–91, 45–76 ir 60–97 proc. pacientų [2]. Mirtingumas negydant siekia net 80 proc. per metus, o su dabartiniais gydymo pasiekimais mirtingumas sumažėja iki 25 proc. per 5 metus [14, 10].
Lyčių pasiskirstymas tarp pacientų su ASV yra gana panašus. Tačiau šiuo metu dauguma tyrimų rodo, kad šiek tiek daugiau serga vyrai. Vyresnio amžiaus pacientai dažniau serga ASV [10].
Retų reumatinių ligų paplitimas Lietuvoje, pavyzdžiui, sisteminės raudonosios vilkligės yra 0,02 proc. Maždaug toks pat procentas yra ir visumos kitų sisteminių vaskulitų [17].
1.2 Vaskulitų klasifikacija
Pirmieji bandymai klasifikuoti sisteminius vaskulitus į atskiras kategorijas buvo grindžiami kraujagyslių dydžiu [14–15]. 1990 metais Amerikos reumatologijos kolegija (American College of Rheumatology (ACR), atlikusi epidemiologinius ir klinikinius tyrimus, pasiūlė patvirtintą septynių labiausiai paplitusių vaskulito formų klasifikavimo kriterijų sistemą, kuri yra paremta pacientų klinikiniais požymiais. 1994 metais Chapel Hill konferencijos sutarimu (Chapel Hill Consensus Conference (CHCC) buvo pateikti pagrindinių vaskulitų tipų apibrėžimai ir patvirtinti pagrindiniai šių ligų specifiniai diagnostiniai žymenys. Buvo išplėsti anksteni vaskulitų klasifikavimo kriterijai, taip pat įtraukiant su ANCA susijusius vaskulitus [10, 18]. 2012 metais peržiūrėta CHCC nomenklatūra, didžiausią dėmesį skiriant etiologijos, patogenezės, patologijos ir klinikinių charakteristikų
13 kategorizavimui. 2012 metų CHCC rekomendacijos yra išsamesnės, apimančios keturias naujas pagrindines vaskulitų kategorijas: kintamų kraujagyslių vaskulitus; vieno organo vaskulitus; vaskulitus, susijusius su sistemine liga, ir vaskulitus, susijusius su "galima etiologija". 2012 metų CHCC vaskulitų nomenklatūra pagal skirtingo dydžio kraujagyslių pažeidimą pateikta 1 lentelėje. 2012 metais CHCC pripažino, kad per tam tikrą laiką vieno organo autoimuninė liga gali virsti sisteminiu vaskulitu. Taip pat pripažintos ASV subkategorijos, tokios kaip MPA, GPA ir EGPA (2 lentelė). PSO Tarptautinis ligų klasifikacijos komitetas (WHO International Classification of Diseases committee) rekomendavo 2012 metų CHCC pakeisti keletą pavadinimų su aprašomaisiais terminais: "Henoch-Šionleino purpura" buvo pakeista "IgA vaskulitu", o "Churg-Strauss sindromas" į "EGPA". Bendru sutarimu buvo pasiūlyti visų atskirų vaskulitų sindromų apibrėžimai [18].
1 lentelė. Vaskulitų nomenklatūra Didelių kraujagyslių vaskulitai Takayasu arteritas
Gigantinių ląstelių arteriitas Vidutinių kraujagyslių vaskulitai Mazginis poliartritas
Kawasaki liga
Smulkiųjų kraujagyslių vaskulitai Su ANCA susiję vaskulitai: Mikroskopinis poliangitas Granulomatozė su poliangitu
Eozinofilinė granulomatozė su poliangitu Imuninio komplekso smulkiųjų kraujagyslių vaskulitai:
Glomerulų bazinės membranos nefropatija Krioglobulineminis vaskulitas
IgA vaskulitas (anksčiau Henoch-Šionleino purpura) Hipokomplementinis urtikarinis vaskulitas (anti-C1q
vaskulitas) ANCA – antikūnai prieš neutrofilų citoplazmos antigenus.
Pacientų su ASV ligos valdyme rekomenduojama atsižvelgti į tris pagrindinius klinikinius elementus: pirmąjį, susijusį su ligos etapu, antrąjį – skirtumu tarp aktyvios ligos ir žalos, bei trečiąjį – susijusį su gyvenimo kokybės (GK) įvertinimu (quality-of-life (QOL)). Tinkama priemonė vertinant ligos aktyvumą pacientams, sergantiems ASV, yra Birmingemo vaskulito aktyvumo balas (Birmingham Vasculitis Activity Score (BVAS)), kuris įvertina atskirų organų pažeidimą ir ligos aktyvumą kiekvienoje organų sistemoje [18].
14 2 lentelė. 2012 metų CHCC su ANCA susijusių vaskulitų (ASV) apibrėžimai
Su ANCA susiję vaskulitai Nekrozuojantis vaskulitas, daugiausia pažeidžiantis smulkiąsias kraujagysles (kapiliarus, venules, arterioles ir smulkiąsias arterijas). Susijęs su specifiniais PR3 ar MPO antikūnais. Ne visi pacientai turi antikūnus prieš neutrofilų citoplazmos antigenus (ANCA). Pridedamas priešdėlis, nurodantis ANCA reaktyvumą, pvz., PR3 ANCA, MPO ANCA ar ANCA neigiamas.
Granulomatozė su poliangitu (Wegenerio)
Nekrozinis granuliacinis uždegimas, apimantis viršutinius ir apatinius kvėpavimo takus. Dažniausiai paveikia smulkiąsias ir vidutines kraujagysles (kapiliarus, venules, arterioles, arterijas ir venas). Dažniausiai pasitaikantis yra nekrozinis glomerulonefritas.
Eozinofilinė granulomatozė su poliangitu (Churg Straussas)
Eozinofilų turtingas ir nekrozinis granuliacinis uždegimas. Dažnai paveikiami kvėpavimo takai. Nekrozinis vaskulitas daugiausia įtakos turi smulkioms ir vidutinėms kraujagyslėms. Susijęs su astma ir eozinofilija. ANCA dažnai randama, kai yra glomerulonefritas.
Mikroskopinis poliangitas
Nekrozinis vaskulitas, daugiausia įtakos turi smulkiosioms kraujagyslėms (kapiliarams, venulėms ar arteriolėms). Nekrozinis arteriitas gali būti susijęs su smulkiomis ir vidutinėmis arterijomis. Labai dažni pasireiškia nekrozinis glomerulonefritas ir/ar plaučių kapiliarų pažeidimas. Granuliomatozinio uždegimo nėra.
ANCA – antikūnai prieš neutrofilų citoplazmos antigenus; PR3 – proteinazė 3; MPO – mieloperoksidazė.
1.3 Vaskulitų etiopatogenezė ir išsivystymo mechanizmas
Sisteminių vaskulitų klasifikacijos pažanga padėjo geriau suprasti pagrindinių uždegimo priežasčių patogenezę, įskaitant ląstelinį uždegimą, imuninio komplekso sąlygojamą uždegimą ir uždegimą tarpininkaujant antikūnams. Įvairūs uždegimai, susiję su endotelio ląstelių aktyvavimu, gali sukelti tokias komplikacijas, kaip kraujagyslių užakimas, audinių irimas ir lėtinė ligos eiga. Sisteminių vaskulitų metu vykstantis endotelio ląstelių aktyvavimas panašus ir susijęs su reumatoidinio artrito bei sisteminės raudonosios vilkligės patogeneze. Todėl šios ligos dažnai pasireiškia kartu su netipinėmis vaskulitų formomis. Šių ligų metu padidintas baltymo endotelino-1 kiekis gali būti siejamas su kraujagyslių tinklo reguliacijos sutrikimais [15].
Autoantikūnai vaidina pagrindinį vaidmenį su ANCA susijusių vaskulitų patogenezėje. Šie antikūnai yra nukreipti prieš fermentus, kurie yra įtraukti į neutrofilų ir monocitų granules [19]. Naiviosios T ląstelės infekcijų sukėlėjus perduoda dendritinėms ląstelėms, esančioms ant kraujagyslių sienelių. Dendritinės ląstelės identifikuoja ir fagocituoja bei pristato svetimus antigenus įgyto imuniteto ląstelėms. Pavyzdžiui, pacientams, sergantiems gigantiškų ląstelių arteriitu, už kraujagyslių sužalojimą yra atsakingos CD4+ T ląstelės, kurios sužadina makrofagus ir monocitus uždegimo metu
15 išsiskyrimą [15, 20]. Audiniuose esančios T ląstelės taip pat išskiria interferoną-gama, kuris yra pagrindinis uždegimą skatinantis citokinas, susijęs su gigantiškų ląstelių arteriito patogeneze. Ilgalaikis uždegimas tarpininkaujant T ląstelėms, makrofagams ir prouždegiminiams citokinams sukelia didelį intimos sustorėjimą ir kraujagyslės okliuziją. Specifinių autoantikūnų sąveikai yra reikalingi endotelio ląstelių membranose esantys antikūnų kristalizacijos fragmento gama (Fcγ) receptoriai, pavyzdžiui, sergant vaskulitu, ANCA jungiasi prie neutrofilų, inicijuodami audinių – kraujagyslių sunaikinimą. Sisteminis vaskulitas gali būti kelių fenotipų, kurie išsivysto veikiant skirtingiems patogeniniams mechanizmams. Priklausomai nuo uždegimo stiprumo ir pobūdžio, pažeidžiamos vidutinės ar smulkios kraujagyslės (arteriolės, venulės ir kapiliarai) organizmo audiniuose ir organuose [5]. Ląstelinis uždegimas yra būdingas gigantiškų lastelių ateriitui, o imuninių kompleksų ir ANCA inicijuotas uždegimas stebimas sergant vidutinių ir smulkių kraujagyslių nekrozuojančiu vaskulitu [15].
Vaskulitas gali atsirasti daugelyje autoimuninių ligų, įskaitant RA ir SRV, Sjogren'o sindromas, sklerodermija ir sarkoidozė. Vaskulitas yra žinoma RA komplikacija, dažnai pasireiškianti praėjus keletui metų po pirminės ligos pradžios [15, 19]. Šiems pacientams vaskulitas pasireiškia uždegimine reakcija, kuri skatina aterosklerozės vystymąsi, todėl atsiranda gerokai didesnė rizika susirgti širdies ir kraujagyslių ligomis bei mirtingumui, lyginant su sveikais gyventojais [15, 21, 19].
1.3.1 Specifinių ANCA prieš PR3 ir MPO samprata ir aktualumas
Antikūnai prieš neutrofilų citoplazmos antigenus daugiausiai siejami su smulkiųjų kraujagyslių (arterijų, arteriolių, venulių ir venų) vaskulitais visuose organuose [22–23, 5, 20]. ANCA yra autoantikūnai, nukreipti prieš specifinius antigenus, proteinazę 3 (PR3) ir mieloperoksidazę (MPO), esančius neutrofilų granulėse ir monocitų lizosomose [24–28]. PR3 yra uždegimą skatinanti proteinazė, priklausanti neutrofilų serino proteazės šeimai, kuri saugoma azurofilinėse granulėse. Tai šeimininko audinių žalingo poveikio tarpininkai uždegimo metu. MPO fermentas yra randamas neutrofilų granulėse ir monocitų lizosomose. Jis katalizuoja vandenilio peroksido virtimą hipochloritu ir hipochlorito rūgštimi. Įdomu, kad tarp daugybės azurofilinių granulių baltymų tik PR3 ir MPO yra susiję su ANCA ir sisteminiais vaskulitais. ANCA prieš proteinazę 3 (PR3 ANCA) arba mieloperoksidazę (MPO ANCA) randama daugiau kaip 90 proc. pacientų, sergančių aktyvia ligos forma [14]. Taip pat ANCA svarbūs neutrofilų aktyvinime, o tiesioginis audinių sužalojimas in vitro rodo, kad ANCA dalyvauja sisteminių kraujagyslių sutrikimų patogenezėje [29, 26, 1].
Nėra nustatyta aiškaus ryšio tarp ANCA titro ir ligos aktyvumo. Tam tikri tyrimai rodo, kad ANCA titro padidėjimas gali būti sekančio recidyvo prognostinis ženklas. Judith Land atliktas tyrimas parodė, kad pacientams, sergantiems GPA, PR3 ANCA titras buvo silpnai susijęs su ligos aktyvumu: sumažėjimas PR3 ANCA – su remisijos trumpesniu laiku, o didėjimas – su paūmėjimu. ANCA titrų
16 padidėjimas remisijos metu yra tik silpnas prognozinis ženklas atkristi ateityje [5]. Specifinių PR3 ir MPO antikūnų titrų padidėjimas ne visiškai atspindi ligos aktyvumą [23, 5, 30, 16].
Su ANCA susijusių vaskulitų klinikinis pasireiškimas yra nevienalytis ir apima platų ligų apraiškos spektrą: nuo gyvybei pavojingos lokalizuotos ligos iki atskirų organų vaskulitų [7]. ANCA vaidina svarbų vaidmenį vaskulitų patofiziologijoje ir stipriai pagerino ankstyvą diagnostiką bei gydymą [21, 9]. ANCA tyrimai yra plačiai naudojami atrankai, diferencijuojant su ANCA susijusius vaskulitus [25].
ASV yra reta, bet sunki autoimuninė liga [28, 31]. Šių sutrikimų etiopatogenezė vis dar nėra iki galo ištirta, tačiau klinikinių, in vitro ir in vivo eksperimentinių tyrimų duomenys aiškiai rodo specifinių PR3 ir MPO antikūnų vaidmenį autoimuninių reakcijų išsivystime. Daugiau nei 90 proc. pacientų, sergančių ASV, patvirtinti kiti teigiami serologiniai tyrimai bei teigiami citoplazminio ar perinuklearinio tipo ANCA rezultatai [32, 20]. Ligų, su kuriomis susijusi ANCA, skaičius didėja [33, 4, 8, 3].
Daugiau nei 80 proc. pacientų, sergančių granuliomatoze su poliangitu, turi PR3 ANCA, o tik 10 proc. turi MPO ANCA. Priešingai, mikroskopinis poliangitas, eozinofilinė granuliomatozė su poliangitu (anksčiau Churg-Strauss sindromas) ir izoliuotas (idiopatinis) nekrozuojantis glomerulonefritas paprastai yra susiję su MPO ANCA [19, 34, 5, 1]. Plaučių pažeidimus dažnai lydi mikroskopinis poliangitas. Jis pasireiškia pacientams, kurių kraujyje randama MPO ANCA [29]. MPO ANCA arba PR3 ANCA (bet retai abu modelius) galima aptikti 85–90 proc. pacientų, kuriems yra izoliuotas (idiopatinis) nekrozuojantis glomerulonefritas, o teigiamų tyrimų diagnostinis jautrumas ir specifiškumas yra maždaug 90 proc. [27].
Pacientams, sergantiems su PR3 susijusiu vaskulitu, atkryčio atvejų pasitaiko daug dažniau nei pacientams, sergantiems su MPO susijusiu vaskulitu. Tyrimai rodo, kad, atsižvelgiant į gydymo reakciją, atkryčių dažnumą ir rezultatus, su specifiniais PR3 antikūnais susiję ASV skiriasi nuo su MPO susijusių ASV [18]. Patologinis inkstų biopsijos tyrimas nurodo, kad ne tik MPO ANCA, bet ir už ląstelės ribų esanti MPO, sudaranti in situ imuninius kompleksus iš MPO ir MPO antikūnų, gali vaidinti svarbų vaidmenį glomerulų kapiliarų sužalojimo patogenezėje su MPO ANCA susijusių vaskulitų atveju [34, 19, 30].
Specifiniai antikūnai prieš PR3, susiję su ASV, yra labiau paplitę šiaurinėse pasaulio dalyse, o su ASV susiję antikūnai prieš MPO, yra labiau paplitę pietų Europos, Azijos ir Ramiojo vandenyno, Naujosios Zelandijos ir Australijos regionuose (3 lentelė). Su PR3 susijusia ASV sergantiems pacientams yra būdingas didelis HLA-DPB1*0401 alelio paplitimas, lyginant su pacientais, sergančiais su MPO susijusia ASV ar sveikais žmonėmis. Histologiškai su MPO ir PR3 susiję ASV yra panašūs, bet skiriasi kokybiškai [35].
17 Xu ir kt. pastebėjo, kad pacientams su ASV yra didesnis venų tromboembolijos (VTE) paplitimas [36]. Inkstų pažeidimų daugiausia pasitaikė pacientams su specifiniais MPO antikūnais, o su specifiniais PR3 ANCA – viršutinių ir apatinių kvėpavimo takų granuliaciniai uždegimai ar kiti nespecifiniai inkstų pažeidimai. Skirtumai lėmė ASV kategorijų paskirstymą remiantis autoantikūnų specifiškumu, o ne ligos fenotipu [20].
Izoliuotas (idiopatinis) nekrozuojantis glomerulonefritas yra dažniausia sparčiai progresuojančio glomerulonefrito priežastis, susijusi su padidėjusiu mirtingumu bei sergamumu [20, 24]. Greitai progresuojantis glomerulonefritas su ASV sukelia sunkiausias ligos formas ir tai sudaro iki 80 proc. visų greitai progresuojančių glomerulonefritų [20]. Daugiau kaip pusė pacientų, sergančių ASV su glomerulonefritu, turi plaučių ligą. Tai taip pat susiję su padidėjusiu sergamumu bei mirtingumu. Plaučių pakenkimai gali būti labai įvairūs: nuo alveolių infiltracinių pažeidimų iki sunkios plaučių hemoragijos. Esant sunkiai plaučių hemoragijai vyrauja specifiniai PR3 ANCA, kurie koreliuoja su ASV susijusiais inkstų pakenkimais (vadinamuoju plaučių-inkstų sindromu) ir tai nepaisant gydymo yra susiję su dar didesniu mirtingumu [16].
Viršutinių kvėpavimo takų (ausų, nosies ir gerklės) uždegimai yra labiau paplitę sergantiems GPA (90 proc.) ir mažiau MPA (35 proc.) bei EGPA (50 proc). Uždegimai gali pasireikšti sinusitu, rinitu arba akių uždegimu (episkleritu, uveitu, iritu). Pacientams, sergantiems ASV, viršutinių kvėpavimo takų pakenkimai susiję su padidėjusia atkryčio rizika [16].
3 lentelė. Amerikos Nefrologų draugijos pateikti panašumai ir skirtumai tarp PR3 ASV ir MPO ASV [35]
(Marc Hilhorst. JASN are provided here courtesy of American Society of Nephrology. Journal of the American Society of Nephrology. 2015)
Ypatybės PR3 ASV MPO ASV
Epidemiologija ♂ / ♀ santykis Geografinis paskirstymas Genetika HLA-DPB1 HLA-DQ PRTN3 CTLA-4 HLA-DRB*15 Didesnis
Labiau paplitę šiaurės vakarų Europoje ir Šiaurės Amerikoje. Dažnis 11,3 / mln / metus Didžiojoje Britanijoje ir 3 / mln / metus Ispanijoje. Labiau paplitę Mažiau paplitę Labiau paplitę Mažiau paplitę
Labiau paplitę juodaodžiams
Mažesnis
Labiau paplitę Pietų Europoje, Azijoje ir Ramiojo vandenyno regione. Dažnis 5,9 / mln / metus UK ir 7,9 / mln / metus Ispanijoje. Mažiau paplitę Labiau paplitę Mažiau paplitę Labiau paplitę Nepaplitę
18 Klinikiniai duomenys
Pasireiškimo amžius Organai
Plaučiai
Alveolinė plaučių hemoragija Ausys, nosis ir gerklė
Nervų sistema Oda Širdis Kita Paūmėjimų dažnis Pacientų išgyvenamumas Inkstų veikla Infekcija Širdies ir kraujagyslių Veiklos sutrikimai Venų tromboembolija Piktybiniai navikai Gydymas Etiologija Patofiziologija
In vitro sąveikos su ANCA
Neutrofilai
Endotelio ląstelės
Monocitai
In vivo su gyvūnų modeliais
Nesiskiria
Dažniausiai ausų, nosies ir gerklės Kavitacijos pažeidimai Daugiau Nekrozinis pažeidimas Panašus dažnis Nesiskiria Nesiskiria Didesnis Panašus/geresnis Panaši/geresnė Nesiskiria Mažiau atvejų Nesiskiria Nesiskiria Nesiskiria S. aureus
Žemas vitamino D kiekis
Nesiskiria
PR3 sukelia endotelio ląstelių apoptozę
PR3 ANCA skatina tirpaus kraujagyslių endotelio augimo faktorių inhibitoriaus (sFlt1) išsiskyrimą iš monocitų
Mažiau sėkmingi pelių modeliai, galbūt dėl skirtingos sąveikos PR3 su neutrofilų scpecifiniu rceptoriumi NB1 (CD177)
Nesiskiria
Dažniausiai inkstų ribotumas Fibrozinis pažeidimas Mažiau Polipai Panašus dažnis Nesiskiria Nesiskiria Mažesnis Panašus/blogesnis Panaši/blogesnė Nesiskiria Daugiau atvejų Nesiskiria Nesiskiria Nesiskiria Susijęs su siliciu Nesiskiria
MPO skatina oksidantų gamybą ląstelėje
MPO ANCA neskatina paleisti sFlt1
Sėkmingi pelių ir žiurkių modeliai, atsiradę iš vaskulito ir nekrozinio GN
ANCA – Antikūnai prieš neutrofilų citoplazmos antigenus; PR3 – Proteinazė 3; MPO –Mieloperoksidazė; ASV – Su ANCA susiję vaskulitai; GN – Glomerulonefritas.
ASV dažniausiai reikalauja gydymo citotoksiniais ir priešuždegiminiais medikamentais, taigi, tiksli diagnozė yra reikalinga išvengiant nereikalingo ir rizikingo gydymo [37]. Imuninę sistemą slopinančios terapijos – šiuolaikinių imunosupresantų – naudojimas 1-ų metų mirtingumo dažnį dėl ASV gali sumažinti nuo 80 proc. iki 3–18 proc. [7]. Ankstyvas gretutinių ligų ištyrimas leidžia laiku diagnozuoti susirgimus ir turi įtakos kryptingam gydymo pasirinkimui [9].
1.3.2 ASV išsivystymo priežastys ir veiksniai
ASV ligų išsivystymą lemia infekciniai ir neinfekciniai veiksniai. ANCA pasireiškimas gali būti siejamas su nuolatine bakterine arba virusine infekcija, ypač sergant bakteriniu endokarditu, tačiau tai gali neturėti įtakos glomeronefrito ir vaskulito vystymuisi. Su infekcija susijusį ANCA vaskulitą galima įtarti tada, kai pacientui nustatomi antikūnai prieš abu PR3 ir MPO baltymus bei aptinkami kiti,
19 tokie kaip kardiolipino autoantikūnai ar krioglobulinai. Pacientai, kuriems nustatoma ne patogeninė infekcija ir aktyvuojamas ANCA susidarymas, gali iššaukti ne infekcinius su ANCA susijusius glomerulonefritus. Vaistai, įskaitant propiltiouracilas, hidralazino, D-penicilamino, alopurinolio, minociklino ir anti-TNF agentai bei kiti aplinkos veiksniai gali sukelti ANCA autoimunines reakcijas. Visavachaipan teigė susidūręs su Greivso liga sergančiais septyniais pacientais, kurie gavo propiltiouracilas ir kuriems išsivystė su ANCA susijusios ligos [38]. Silicio dioksidas yra vienas iš pagrindinių ANCA sukeltų ligų rizikos veiksnys [38–39].
Įvairūs genai yra glaudžiai susiję su ANCA sukeltais vaskulitais. Jei liga yra nulemta genetiškai pagal tam tikra fenotipą, tai gali turėti įtakos ANCA specifiškumui. Tačiau nėra žinoma, kiek genas lemia klinikinį vaskulito fenotipą [39].
Be genetinių veiksnių, aplinkos veiksniai prisideda prie imuninės funkcijos sutrikimo, autoimuniteto vystymosi (MPO ar PR3) ir vėlesnių organų pažeidimų. Aplinkos veiksniai, toksinai, farmakologinis gydymas ir infekcijos yra susiję su ligos patogeneze [20]. Įdomu tai, kad vaistų sukelti vaskulitai dažniausiai siejami su MPO ANCA [18]. Atipinė ANCA gali atsirasti nuo vaisto poveikio, sergant uždegimine žarnų liga arba reumatoidiniu artritu [25].
1.3.3 Su PR3 ir MPO ANCA susijusių vaskulitų etiopatogenezė ir išsivystymo mechanizmai
Su ANCA susijusių vaskulitų etiologija ir patogenezė yra daugiaveiksnė, prie jų prisideda genetiniai faktoriai, aplinkos poveikis, infekcijos, įgimta ir įgyta imuninė sistema, pažeidimo intensyvumas bei trukmė [22, 20, 40]. Skirtingos struktūros (RNR grandinės sekos), specifiškumo ir imunogeniškumo (pvz., dėl ląstelių apoptozės) patogeninių ANCA išsivystymą gali sukelti skirtingi epitopai, kurių susidarymą gali lemti išorės faktoriai, tokie kaip vaistai, mikrobai, virusai ir kt. [40, 20].
Patogeninis antikūnų prieš neutrofilų citoplazmos antigenus vaidmuo pagrįstas in vitro tyrimais [41–42, 20, 7, 25]. Xiao vienas iš pirmųjų panaudojo peles nustatant ASV, joms buvo sukeltas sunkus inkstų pažeidimas [20]. 2002 metais aprašytas tyrimas naudojant pelės specifinius antikūnus prieš MPO, kurie suleisti laukinėms pelėms. Joms pasireiškė sunkūs kraujagyslių pažeidimai, šlapimo takų anomalijos, neutrofilų susikaupimas glomeruluose ir ankstyvas centrinis nekrozuojantis glomerulonefritas su specifiniais IgG klasės antikūnais prieš MPO [5]. Wistar-Kioto bandymai su žiurkėmis taip pat nurodė MPO patogeninį vaidmenį, sukeliantį ASV ir inkstų pažeidimus. Naudojant žiurkių imunizacijai išgrynintus žmogaus specifinius antikūnus prieš MPO, joms išsivystė židininis nekrozuojantis glomerulonefritas ir plaučių vaskulitas [20]. Ekspermentinių tyrimų gyvūnų
20 modeliuose, susijusių su specifinių PR3 antikūnų sukeltomis ligomis, yra pateikiama daug mažiau nei su MPO, o PR3 struktūros ir raiškos skirtumams naudojamos žmogiškosios in vivo sistemos [38].
Nėra aiškaus sutarimo dėl MPO ir PR3 autoantikūnų patogeniškumo. ANCA patogeniškumą iliustruoja Judith Land aprašytas vaskulito požymių pasireiškimo atvejis, naujagimiui po transplacentinio MPO perdavimo [5, 42]. Kita vertus, natūralus MPO ir PR3 autoantikūnų buvimas sveikam asmeniui trukdo teisingai įvertinti sąsajas su ligos aktyvumu bei prieštarauja ANCA patogeniškumo suvokimui. Naujausi straipsniai pateikia epitopo specifiškumą pabrėžiant ANCA patogeniškumą. Tam tikri specifiški MPO epitopai buvo rasti esant aktyviai ligos formai, kiti - remisijos metu, taip pat rasti pas sveikus asmenis. aa447-459 epitopas yra išskirtinis, rodantis aktyvią ligos formą ir aptinkamas visoje Ig frakcijoje. Neigiamą ANCA rezultatą su šiuo epitopu gali užmaskuoti reaktyvus baltymas ceruloplazminas. Ne visi autoantikūnai prieš neutrofilų citoplazmos antigenus būna vienodi – daugelis jų būna patogeniški. Autoimuninių reakcijų susidaryme dalyvaujančių autoantikūnų kiekis priklauso nuo antigeno epitopų plitimo [5]. Natūralūs ANCA, rasti prieš MPO molekules su epitopais, rodo, kad pirma vystosi reakcija su natūraliomis epitopų molekulėmis. Vėliau ANCA virsta patogeniniais [5, 30].
Sveikų asmenų kraujyje rasti cirkuliuojantys specifiniai antikūnai prieš MPO ir PR3 vertinami kaip "natūralūs" arba nepatogeniniai autoantikūnai. Lyginant patogeniškus ANCA prieš MPO su natūraliais autoantikūnais, pastarieji turi mažesnius titrus, mažesnį polinkį ir gebėjimą aktyvuoti neutrofilus in vitro bei mažesnį epitopų specifiškumą. Natūralių autoantikūnų epitopų specifiškumas gali skirtis nuo patogeninių autoantikūnų. Epitopų moduliacija (epitopų plitimas) gali būti įtakota endogeninių arba egzogeninių dirgiklių, todėl nepatogeniniai autoantikūnai tampa patogeniškais [40].
Cirkuliuojantys neutrofilai, turintys netipiškus PR3 ir MPO, paprastai yra neaktyvūs. Ciavatta rado, kad patekusių į kraujotaką neutrofilų netipinė antigenų raiška suaktyvėja esant organizme ANCA. Pacientų, sergančių ASV, neutrofilai turi didesnį kiekį (MPO/PR3) antigenų ląstelės paviršiuje [20]. ANCA autoantigenų raiškos supratimas paaiškina autoimunines reakcijas bei patogenines sąveikas [38]. Specifinių PR3 ANCA ir MPO ANCA sukeltos ligos apibūdinamos skirtingai pagal klinikinius ir histopatologinius požymius [5].
Abdgawad ir kt. pastebėjo sąsajas tarp padidėjusios PR3 ir CD177 ekspresijos (NB1 glikoproteino) ant neutrofilų membranos. Jerke ir kt. taip pat pastebėjo PR3 sąsają su CD177 ir rado įrodymų, kad šis kompleksas sąveikauja su komplemento receptoriumi Mac - 1, skatinančiu neutrofilų aktyvaciją. PR3 sąveika su susijusiomis molekulėmis vaidina svarbų vaidmenį ne tik PR3 ANCA neutrofilų aktyvacijoje, bet ir PR3, kaip antigeno, pateikime imuninei sistemai [38].
Su ANCA susijusių vaskulitų patogeninį mechanizmą turėtų paaiškinti patologinė ir klinikinė ASV išraiška. Ūmios ASV fazės metu yra būdinga nekrozė su neutrofilų ir monocitų infiltracija. Per kelias dienas neutrofilai pakeičiami mononuklearinių leukocitų (makrofagų, monocitų ir T limfocitų).
21 Taip pat išryškėja imunoglobulinų trūkumas ar jų nusėdimas kraujagyslių sienelėse. ASV patogenezė skiriasi nuo kitų vaskulitų patogenezės, imunoglobulinų nusėdimu kraujagyslių sienelėse, susidarant imuniniams kompleksams, kurie sukelia vaskulitus ar nusėdę ant glomerulų membranos – autoimuninį membraninį glomerulonefritą [22, 38]. Maždaug 10 proc. pacientų, sergančių ASV, kurių ANCA rezultatas neigiamas, turi klinikinį ir patologinį požymių pasireiškimą, panašų į pacientų su teigiamais ANCA, t.y. patogeniškumo kelias gali būti panašus arba toks pat kaip vaskulitų [22].
Mikrodalelės neutrofiluose susideda iš adhezijos molekulių ir proteazės gausos, kurie apima ANCA autoantigenus PR3 ir MPO. ANCA gali indukuoti neutrofilų mikrodalelių išsiskyrimą iš neutrofilų. Šios mikrodalelės per molekulių adhezijos reguliavimo centrus jungiasi prie endotelio ląstelių ir taip susidaro išskirtų uždegiminių citokinų (IL-6 ir IL-8) padidėjusios endotelio reaktyviosios deguonies formos [20]. Citokinai, tokie kaip naviko nekrozės faktorius (TNF), IL-18 ir granuliocitų makrofagų kolonijas stimuliuojantis faktorius, didina neutrofilų skaičių sergantiems ASV, kurie skatina ANCA atsiradimą, didėjant autoantigenų raiškai. Savo ruožtu, padidėjus ANCA prisijungimui prie endotelio gaminasi citokinai. Sužadinti citokinai išlaisvina papildomus neutrofilų aktyvavimo veiksnius, sukeliančius antigenų atsipalaidavimą ant neutrofilų paviršiaus ir aplink neutrofilus [20, 1, 22]. Neutrofilai ir jų produktai yra pagrindiniai veiksniai, pradedantys autoimunines reakcijas ir kraujagyslių irimą bei granuliacinį uždegimą [21]. Chahrazade Kantari ir kiti įrodė, kad didelis procentas specifinių PR3 teigiamų antikūnų ant neutrofilų membranos skatina vaskulito ir reumatoidinio artrito vystymąsi ar progresavimą. Specifiniai PR3 ant neutrofilų membranos buvo rasti pacientams, sergantiems sepsiu. Duomenys aiškiai rodo, kad specifinių PR3 išraiška yra ASV ir kitų uždegiminių ligų, susijusių su neutrofilais, patogeninis veiksnys [19].
Daugelis eksperimentinių tyrimų duomenų in vitro ir in vivo nurodo ne tik autoantikūnų, bet ir ląstelinio imuniteto patogeninį vaidmenį [30, 40]. T ląstelių vaidmuo autoimuniame procese yra įvairus ir gali būti nulemtas daugelio patogeninių mechanizmų, įskaitant T ląstelių reguliavimo disfunkciją, efektorinių ląstelių hiperaktyvaciją ir tam tikrų T ląstelių pogrupių disbalansą [26, 42]. B ląstelės, išskirdamos citokinus ir dalyvaudamos limfoidinio audinio formavimęsi, gali veikti kaip antigeną pateikiančios ląstelės. Taip autoimuninių ligų paveiktuose organuose palaikomas lėtinis uždegimas. B ląstelės per antigeno pateikimą ir vėliau antikūnų susidarymą gali paskatinti ligos progresavimą nuo lokalios ligos iki sisteminio vaskulito [7]. Sustiprintas ląstelinis autoimunitetas ir įgimtas imunitetas stimuliuoja B ląsteles, kurios lemia antigenų, specifiškų ANCA, gamybą. Autoantikūnai jungiasi ir aktyvuoja cirkuliuojančius neutrofilus. Degranuliuoti neutrofilai išskiria savo žalingas sudedamąsias dalis ir MPO su PR3 nusėda į glomerulus. Vėliau, CD4 + T ląstelės atpažįta autoantigenus (MPO/PR3) glomeruluose ir pritraukia papildomas imunines ląsteles. Tai sukelia sunkias inkstų traumas. ANCA autoimuninį atsaką palengvina nepakankamas T ir B ląstelių reguliavimas [40, 20].
22 Sergantiems ASV aktyvuoti neutrofilai prasiskverbia pro kraujagyslių sieneles išlaisvindami toksiškus deguonies radikalus ir žalingus fermentus, kurie sukelia neutrofilų nekrozę ir apoptozę gretimose kraujagyslių sienelių ląstelėse [22]. Neutrofilų apoptozė ar nekrozė skatina organizmo tolerancijos praradimą MPO ar PR3 baltymams. Po neutrofilų ląstelių žūties išskiriamos granulių sudedamosios dalys, MPO ir PR3 pernešami į ląstelės paviršių, kur jie pradeda veikti kaip antigenai. Neutrofilų apoptozė yra susijusi su lėtesniu ląstelių žūties mechanizmu [20, 7, 40].
1.3.4 ANCA klasifikacija tiriant netiesioginės imunofluorescencijos metodu
Antikūnams prieš neutrofilų citoplazmos antigenus nustatyti dažniausiai naudojamas atrankinis testas yra netiesioginės imunofluorescencijos (NIF) analizė [43]. ANCA skirstomi pagal jų sukeliamą imunofluorescencijos vaizdą, matomą neutrofiluose bei pagal jų antigenus. Naudojant netiesioginės imunofluorescencijos metodą galima išskirti du autoantikūnų prieš etanolyje fiksuotų granuliocitų citoplazmą švytėjimo tipus – citoplazminį ANCA (cANCA) ir perinuklearinį ANCA (pANCA) [16, 43–44].
Tiriant netiesioginės imunofluorescencijos metodu cANCA būdingas difuziškas citoplazmos grūdėtumas siejamas su PR3 antikūnais [3–4]. pANCA - perinuklearinis neutrofilų modelis (tiriant NIF švytėjimas matomas aplink branduolį) siejamas su MPO antikūnais [25]. Šis modelis atsiranda dėl neigiamo krūvio citoplazmos autoantigenų aplink branduolio apvalkalą ant etanoliu fiksuoto neutrofilų substrato [33, 4]. Tai priskiriama "tipiniams" ANCA modeliams. Tačiau visus ANCA modelius galima pastebėti ir kitų uždegiminių būklių metu, kurios sumažina ANCA tyrimo specifiškumą NIF metodu [44].
Netipinis modelis, vadinamas A-ANCA (atipinis), yra retas ir sujungia abu - citoplazminį ir perinuklearinį arba branduolių dezoksiribonukleino rūgšties (DNR) švytėjimus [25]. Blankus, vienodas, difuzinis citoplazmos nusidažymas be centrinio ryškumo dažnai vadinamas "atipiniais cANCA", o aiškus perinuklearinis nusidažymas be branduolio švytėjimo formaline dažnai vadinamas "netipiška pANCA". Netipiniai modeliai svarbūs autoantigenų susijusių su kitos kilmės vaskulitais ar autoimuninėmis ligomis, atskyrimui. Tačiau atskirti tipinius nuo netipinių ANCA nėra paprasta, sunkumų kyla dėl neatitikimų tarp laboratorijų (nesant standartizuotų interpretavimo kriterijų) ir skirtingų tyrimo protokolų schemų. Tyrimo interpretaciją taip pat gali įtakoti trukdžiai, susiję su homogeniniu ar kt. antikūnų prieš branduolio antigenus (ANA) švytėjimu, kuris būna panašus ir maskuoja pANCA buvimą [33].
1999 m. Tarptautinio sutarimo tvirtinimu (angl. International Consensus Statement) rekomenduojama, kad netipiniai pANCA modeliai turėtų būti priskiriami "pANCA" kategorijai, o ne atskirai kaip "atipiniai pANCA", "netipiniai pANCA" arba "ANCA“. Tačiau priskiriant netipinius
23 ANCA modelius prie "pANCA", žymiai sumažėja pANCA rezultatų diagnostinė vertė. Tyrimai aiškiai parodo, kad klasikinės perinuklearinės ANCA diferenciacija nuo netipinės pANCA imunofluorescencijos metodu, nepriklausomai nuo rezultatų, žymiai pagerina NIF tyrimo klinikinį naudingumą [43].
Keturi ANCA dažymosi fluorescencijos modeliai nurodomi etanolyje ir formaline fiksuotuose neutrofilų substratuose (4 lentelė). Išskiriami citoplazminis ANCA (cANCA), perinuklearinis ANCA (pANCA), netipinis cANCA ir netipinis pANCA dažymosi modeliai [33].
4 lentelė. ANCA dažymosi tipai ANCA tipas Charakteristika
cANCA Smulkių granulių švytėjimas etanolyje ir formaline fiksuotų neutrofilų citoplazmoje.
pANCA Smulkių granulių švytėjimas formaline fiksuotų neutrofilų citoplazmoje ir perinuklearinis švytėjimas etanolyje fiksuotų neutrofilų citoplazmoje.
Netipinis cANCA Smulkių granulių švytėjimas etanolyje fiksuotų neutrofilų citoplazmoje; formaline fiksuotų neutrofilų citoplazma nešvyti.
Netipinis pANCA Perinuklearinis švytėjimas etanolyje fiksuotų neutrofilų citoplazmoje; formaline fiksuotų neutrofilų citoplazma nešvyti.
1.3.5 Antikūnų prieš neutrofilų citoplazmos antigenus diagnostika
Aptikti antikūnai prieš neutrofilų citoplazmos antigenus yra labai svarbūs diagnozuojant ir stebint ASV [25]. Autoimuniniams kraujagyslių sutrikimams, tokiems kaip granulomatozė su poliangitu (GPA, anksčiau Wegenerio granulomatozė), mikroskopinis poliangitas (MPA), eozinofilinė granulomatozė su poliangitu (EGPA, anksčiau Churg-Strauss sindromas), būdingas kraujagyslių uždegimas, audinių nekrozė ir antikūnų prieš neutrofilų citoplazmos antigenus atsiradimas [44–46, 18, 25]. Antikūnai prieš neutrofilų citoplazmos antigenus laisvai cirkuliuoja kraujotakoje [16, 24]. Citoplazminio ANCA modelio radimas būdingiausias pacientams, sergantiems granulomatoze su poliangitu [8, 5]. Perinuklearinis ANCA modelis randamas sergant mikroskopiniu poliangitu, izoliuotu (idiopatiniu) nekrozuojančiu glomerulonefritu ir eozinofiline granulomatoze su poliangitu, kurių atveju matomas homogeniškas perinuklearinis branduolio švytėjimas [33, 4, 47, 38]. Ne visiems pacientams, sergantiems sisteminiu vaskulitu arba granuliomatose su poliangitu, randamas ANCA teigiamas rezultatas [8].
Vaskulitų klinikiniai požymiai panašūs į jungiamojo audinio ligų požymius, todėl rasti skirtumus yra gana sunku. Specifiniai ANCA testai labai svarbūs pradinės diagnostikos vertinimui pacientams su diferencine diagnostika, kuri apima jungiamojo audinio ligas ir vaskulitus. ANCA testo specifiškumo nustatymas yra svarbus vaskulito diagnozei sprendžiant atlikti biopsiją ar taikyti toksišką imunosupresinę terapiją [31, 3]. Klinikiniai simptomai bei aukšti ANCA titrai su teigiama PR3 ir/arba MPO yra svarbūs veiksniai ASV diagnozei pagrįsti [4].
24 Specifiniai PR3 ANCA su citoplazminiu ANCA švytėjimu yra daugiausiai susiję su GPA [25, 47, 27]. Daugumai pacientų specifiniai PR3 ANCA koreliuoja su ligos aktyvumu bei sunkumu. Dažni klinikiniai paūmėjimo atvejai pasitaiko esant aukštiems PR3 ANCA titrams. Specifinių PR3 ANCA padidėjimas gali atsirasti uždegiminėmis sąlygomis, įskaitant tam tikras infekcijas [48, 42]. cANCA su specifine PR3 ANCA neturėtų būti naudojami sisteminių vaskulitų diagnozei patvirtinti ar paneigti be kitų papildomų ištyrimų. Klaidingas vaskulitų diagnozes gali įtakoti klaidingai teigiami rezultatai [8].
Specifiniai MPO antikūnai yra susiję su pANCA modeliu ir daugiausia pastebėti pacientams, sergantiems MPA [25, 47, 27]. Klinikinės diagnozės patvirtimas cANCA teigiamu rezultatu kartu su specifiniu PR3 nustatymu ar pANCA teigiamu rezultatu su MPO nustatymu yra daug patikimesnis diagnostinis testas [8, 23].
1.3.6 ASV sąsajos su klinikiniais ir laboratoriniais tyrimais
ANCA rezultatai visada turėtų būti vertinami kartu su klinikiniais rezultatais ir kitais laboratoriniais tyrimais [8]. Įrodyta, kad ANCA titro padidėjimas gali nurodyti ligos aktyvumą, bet priimti gydymo sprendimus remiantis vien tik ANCA titrais yra nepatartina. Antikūnų prieš neutrofilų citoplazmos antigenus, susijusių su vaskulitais, klinikiniai požymiai gali būti labai įvairūs ir reikalauja skirtingų diagnostikos ir gydymo metodų [18, 31].
C-reaktyvusis baltymas (CRB) modifikuojamas iš pentamerinio CRB (pCRP) į monomerinį CRB (mCRP) gali sukelti trombozę, kurios klinikiniai simptomai gali būti panašūs į vaskulitų. Savo ruožtu, segant vaskulitu, suaktyvėjusios uždegiminės reakcijos, skatinančios CRB modifikaciją, gali sukelti trombozę. ANCA suaktyvinti neutrofilai sudaro tinklus (sankaupas), kurie gali aktyvuoti trombocitus ir ant jų pradeda formuotis mCRP. Naujai sukurtas mCRP gali dar labiau sustiprinti trombocitų aktyvaciją, trombogenezės procesą ir uždegiminį atsaką. Didelė cirkuliuojančių pCRP koncentracija yra ne tik jautrus žymuo sprendžiant ligos aktyvumą, bet ir dalyvauja su ANCA susijusių vaskulitų patofiziologijoje. Cirkuliuojančio CRB koncentracija yra padidėjusi pacientams, sergantiems ASV aktyvaus etapo metu, ir greitai padidėja su ligos paūmėjimu. Xu ir kt. mano, kad cirkuliuojančio pCRP padidėjimas gali būti potencialus terapijos taikinys ASV atveju ir jo nustatymui turėtų būti skiriama daugiau dėmesio [36].
Uždegimo žymenys eritrocitų nusėdimo greitis (ENG) ir C-reaktyvusis baltymas (CRB) yra jautrūs tyrimai negydytų pacientų aktyvaus vaskulito atveju, todėl yra naudingi atmetant vaskulitus ar skiriant papildomus tyrimus, tačiau jokiu būdu nėra tinkamiausias pirminis diagnostinis pasirinkimas [47].
25
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI
2.1 Tiriamųjų kontingentas
Pirminiame etape tolesnei analizei atrinkti 184 pacientai, kurių kraujo mėginiai buvo tirti LSMUL KK Laboratorinės medicinos klinikoje 2015–2016 metais ir 2016–2017 metais Imunologijos ir alergologijos klinikoje, ir kuriems nustatyti teigiami ANCA tyrimų rezultatai. Tyrimai atlikti gavus LSMU Bioetikos centro leidimą (Leidimas atlikti biomedicininį tyrimą 2015-11-06, Nr. BEC-LMB (M) – 78) (1 priedas). ANCA tyrimai atlikti kokybiniu netiesioginės imunofluorescencijos metodu (NIF) in vitro tyrimų sistema, rinkiniais Granulocyte Mosaic 13 ir EUROPLUS Granulocyte Mosaic 25, Euroimmun, Vokietija. Atrinktiems pacientams su teigiamais ANCA tyrimo rezultatais atliktas patvirtinamasis specifinių PR3 ir MPO antikūnų žmogaus serume ar plazmoje tyrimas. Atliekant pacientų rezultatų analizę taip pat nagrinėti CRB, anti-CCP, RF ir anti-dsDNR tyrimai.
Tiriamuosius sudarė 74 vyrai ir 110 moterų. Tyrimui atrinktų 184 tiriamųjų amžiaus vidurkis 53,11 ± 19,45 metai. Jų amžius buvo nuo 1 iki 86 metų. Analizuojant laboratorinių tyrimų rezultatus tiriamieji buvo suskirstyti į amžiaus grupes [31, 49]:
I – vaikų amžiaus grupė iki 18 metų; II – nuo 19 iki 50 metų;
III – nuo 51 iki 65 metų;
IV – ir pacientus vyresnius nei 65 metai.
Atliekant tyrimą, buvo remtasi tirtų pacientų ligų istorijomis. Pagal literatūros šaltinius buvo išskirtos penkios ligų grupės [50, 18, 3]:
1. Vaskulitai susiję su sisteminėmis jungiamojo audinio ligomis, kurią sudarė: sisteminis vaskulitas su Reino sindromu, sisteminė raudonoji vilkligė, juvenilinis idiopatinis artritas, Churg-Strauss'o sindromas, reumatoidinis artritas ir kt.;
2. Į „vaskuliopatijų“ grupę buvo įtraukti pacientai, sergantys gigantinių ląstelių arteriitu, reumatine polimialgija, odos vaskulitais ir kt.;
3. Wegener‘io granuliomatozė – vaskulitai susiję su cANCA; 4. Su ANCA susiję vaskulitai – vaskulitai susiję su pANCA;
5. Prie „kitos etiologijos vaskulitų“ priskirti sergantieji tulžies latakų obstrukcija, įtariama širdies ir kraujagyslių sistemos liga, autoimuniniu tiroiditu, išemine kardiomiopatija, lėtiniu aktyviu (autoimuniniu) hepatitu ar pneumonija.
Imunologiniams ANCA tyrimams pacientų kraujas buvo surinktas į vakuminę sistemą be priedų arba su krešulio aktyvatoriumi. Naudota tiriamoji medžiaga – žmogaus serumas arba plazma. Mėginiai centrifuguojami 1300–2000 x g 10 min. Jei mėginiai nebuvo ištirti per 8 val., jie buvo
26 laikomi 2–8°C temperatūroje ne ilgiau nei 48 val. Ilgesniam laikymui serumo mėginiai buvo užšaldyti -20°C temperatūroje. Tyrimams nenaudoti ryškiai hemolizuoti, lipeminiai ar su padidėjusiu bilirubino kiekiu mėginiai.
C-reaktyvaus baltymo ir reumatoidinio faktoriaus nustatymui buvo imamas kraujas į vakuuminę sistemą be antikoagulianto arba su antikoaguliantu (ličio heparinu), per 1–1,5 val. nuo paėmimo atnešti į laboratoriją 18–25°C temperatūroje. Vėliau serumas/plazma atskirti nuo kraujo ląstelių per 2 valandas nuo ėminio paėmimo, centrifuguojama 1300–2000 g 10 min. ir tirti Beckman Coulter SYNCHRON UniCel® DxC 800 biocheminiu analizatoriumi.
Anti-CCP ir anti-dsDNR tyrimams pacientų kraujas surinktas į vakuuminę sistemą be priedų arba su krešulio aktyvatoriumi. Naudota tiriamoji medžiaga – žmogaus serumas. Mėginiai centrifuguoti 1300–2000 x g 10 min. Nesant galimybės mėginius ištirti per 8 val., jie buvo laikomi 2– 8°C temperatūroje ne ilgiau nei 48 val. Ilgesniam laikymui serumo mėginiai užšaldyti -20°C temperatūroje.
2.2 ANCA tyrimo metodika
In vitro tyrimų sistema skirta kokybiškai aptikti IgG klasės antikūnus prieš formaline ir metanolyje fiksuotų granuliocitų (neutrofilų) citoplazmą bei specifinius PR3 ir MPO antikūnus žmogaus serume. Tyrimo principas: substratų deriniai buvo inkubuojami su praskiestais pacientų mėginiais. Jei reakcija teigiama, specifiniai IgA, IgG ir IgM klasių antikūnai susiriša su antigenais. Antrajame etape susijungę antikūnai buvo dažomi fluoresceinu žymėtais žmogaus antikūnais ir tampa matomi fluorescenciniu mikroskopu.
2.2.1 Tyrimo eiga
ANCA tyrimo atlikimo eiga išdėstyta 5 lentelėje, kurioje pateikti visi procedūros etapai.
5 lentelė. Tyrimo eiga
Tyrimo atlikimas
Paruošimas Prieš tyrimą reagentai atšildyti iki kambario temperatūros nuo +18°C iki +25°C ir paruošti naudojimui.
Lašinimas Į kiekvieną reagentų plokštelės laukelį pipete įlašinama 30μl praskiesto mėginio. Vengiama oro burbuliukų susidarymo. Prieš inkubavimą užlašinami visi mėginiai (1 pav.).
Inkubavimas
BIOCHIP objektiniai stikleliai įdedami į atitinkamas reagentų plokštelės išpjovas. BIOCHIP panardinama į lašus ir pradedama reakcija. Patikrinama, ar kiekvienas mėginys turi sąlytį su BIOCHIP‘u ir ar lašai nesusiliejo. Inkubuojama 30 min kambario temperatūroje (nuo +18°C iki +25°C).
27 5 lentelė. Tyrimo eiga (tesinys)
Plovimas
Naudojama laboratorinė stiklinė, BIOCHIP objektiniams stikleliams praplauti PBS – Tween tirpalo srovele ir tuojau pat pamerkiama į kiuvetę su PBS – Tween tirpalu (mažiausiai 5min).
Dozavimas
Į kiekvieną švarios reagentų plokštelės laukelį įlašinama po 25μl fluoresceinu žymėto serumo prieš žmogaus globulinus. Prieš inkubavimą sulašinami visi lašai.
Inkubavimas
Ištraukiami BIOCHIP objektiniai stikleliai iš kiuvetės, po to per 5 sekundes nusausinama sugeriamuoju popieriumi tik nugarinė plokštelės pusė ir jos kraštai bei tuojau pat įdedami į reagentų ploštelės išpjovas.
Inkubuojama 30min kambario temperatūroje (nuo +18°C iki +25°C).
Plovimas
Kiuvetė užpildoma nauju PBS – Tween buferiniu tirpalu. Naudojama laboratorinė stiklinė, BIOCHIP objektiniams stikleliams praplauti PBS – Tween tirpalo srovele ir tuojau pat pamerkiama į kiuvetę su PBS – Tween tirpalu 5min.
Padengimas
Dengiamoji terpė užlašinama ant dengiamojo stiklelio (ne daugiau kaip 10μl kiekvienam reakcijos laukeliui). Iš kiuvetės išimamas BIOCHIP stiklelis, popieriniu rankšluosčiu nusausinama nugarinė plokštelės pusė ir visi keturi kraštai. Objektinis stiklelis su žemyn nukreiptais BIOCHIP‘ais padedamas ant paruošto dengiamojo stiklelio. Patikrinama, ar dengiamasis stiklelis įtilpo į objektinio stiklelio išpjovas.
Vertinimas Vertinama fluorescencija mikroskopu.
28 2.2.2 Reagentų paruošimas ir stabilumas
Po pirmo atidarymo reagentai yra stabilūs iki galiojimo datos pabaigos, laikant temperatūroje nuo +2°C iki +8°C ir saugant nuo užteršimo.
Stikleliai buvo paruošti naudoti. Apsauginė pakuotė nuimama tik tuomet, kai stikleliai sušyla iki kambario temperatūros (nuo +18°C iki +25°C; vandens kondensatas gali sugadinti substratą). Gamintojas rekomenduoja: jei apsauginė pakuotė yra pažeista, tokio objektinio stiklelio nenaudoti diagnostikoje.
Fluoresceinu žymėti konjuguoti antikūnai (FITC) buvo paruošti naudoti. Prieš pirmą naudojimą - gerai sumaišomas. Konjugatas yra jautrus šviesai. Saugoma nuo saulės spindulių.
Teigiami ir negiami kontroliniai mėginiai buvo paruošti naudoti. Prieš pirmą naudojimą gerai sumaišoma. Teigiami kontroliniai mėginiai su nurodytu titru gali būti naudojami titro nustatymui tiek praskiesti, tiek nepraskiesti.
PBS – Tween buferinis tirpalas: 1 pakuotė „PBS druskos“ buvo ištirpinama 1 litre distiliuoto vandens (naudotas injekcinis vanduo) ir sumaišoma su 2 ml Tween 20 (maišyta 20 min., kol tampa homogeniškas). Paruoštas PBS – Tween tirpalas laikomas temperatūroje nuo +2°C iki +8°C 1 savaitę. Pagal rekomendacijas, jeigu PBS – Tween tirpalas tampa drumstas arba atsiranda nešvarumų, jo naudoti negalima.
Reagentų plokštelės duobutės hidrofiliškos, o aplinkinis plotas hidrofobiškas.
Objektiniai stikleliai ir reagentai laikomi temperatūroje nuo +2°C iki +8°C. Tinkamai laikant, galioja 18 mėnesių nuo pagaminimo datos.
2.2.3 Tyrimo charakteristika
Praskiesti mėginiai buvo inkubuojami tą pačią darbo dieną. Atliekant kokybinį tyrimą, tyrimui skirti pacientų mėginiai buvo skiedžiami PBS – Tween tirpalu santykiu 1:10, pvz., 11,1μl mėginio praskiedžiamas 100 μl PBS – Tween ir gerai sumaišomas, pvz.: 4 sekundes naudojant Vortex tipo maišyklę.
2.2.4 Tyrimo vertinimas
Atliktas tyrimas buvo vertinamas fluorescenciniu mikroskopu.
Fluorescencijos vaizdas (teigiama reakcija): išskirti du pagrindiniai autoantikūnų prieš etanolyje fiksuotų granuliocitų citoplazmą švytėjimo vaizdai. Grūdėtąjį visos granulocitų citoplazmos švytėjimą, neapimantį ląstelės branduolio (cANCA: antineutrofiliniai citoplazminiai antikūnai,
29 citoplazminis švytėjimo vaizdas) sukelia prieš neutrofilų azurofilinėse granulėse esančią proteinazę 3 nukreipti antikūnai. Antikūnai prieš baktericidinį pralaidumą didinantį baltymą (BPI, CAP57), o išimtinais atvejais antikūnai prieš mieloperoksidazę (paprastai sukeliantys pANCA švytėjimą) taip pat gali sukelti cANCA būdingą švytėjimą. Homogenišką granulocitų branduolius juosiantį fluorescencinį švytėjimą (pANCA: antineutrofiliniai citoplazminiai antikūnai, perinuklearinis švytėjimo vaizdas) gali sukelti įvairaus specifiškumo antikūnai. Identifikuotas pANCA antigenas yra mieloperoksidazė. Branduolius juosiantis (perinuklearinis) fluorescencinis pANCA vaizdas gaunamas todėl, kad inkubuojant pacientų mėginiuose esančius antikūnus su antigenais šie difunduoja iš granulių į ląstelės branduolio membraną, kurioje antikūnai pasižymi dideliu afiniškumu.
2.3 C-reaktyvaus baltymo (CRB) tyrimo metodika
C-reaktyvaus baltymo kiekybiniam nustatymui naudojamas Beckman Coulter SYNCHRON UniCel® DxC 800 biocheminis analizatorius, kurio CRB koncentracijos matavimo ribos – 1,0–250,0 mg/l; normos – <7,5 mg/l kraujo serume ar plazmoje; analizinis jautris – 0,2 mg/l. Gamintojas rekomenduoja naudoti šviežius serumo ar plazmos mėginius.
CRB koncentracija nustatoma turbidimetriniu metodu naudojant C-reaktyvaus baltymo reagentą SYNCHRON® Systems C-Reactive Protein Reagent. Šio metodo esmė yra netirpių agregatų,
sukeliančių drumstumą, susidarymas prisijungiant C-reaktyviam baltymui prie CRB dalelės, dengtos anti-CRB antikūnu. Analizatorius matuoja absorbcijos kitimus esant 600 nm bangos ilgiui. Absorbcijos kitimai proporcingi C-reaktyvaus baltymo koncentracijai mėginyje. Rezultatai pateikiami skaitine reikšme mg/l iš anksto nustatytos kalibracinės kreivės pagrindu.
Siekiant užtikrinti tyrimų teisingumą ir tikslumą buvo atliekama kalibravimo procedūra. Įprastai SYNCHRON UniCel® DxC 800 biocheminio analizatoriaus CRB reagentui kalibracija
vykdoma kas 30 dienų. Kalibracijos atlikimo periodiškumas gali kisti, kai keičiasi reagento LOT numeris, kai nepatvirtinamos dviejų lygių kontrolės ar kai atliekamos analizatoriaus techninės priežiūros procedūros ar dalių keitimas. Naudojamas SYNCHRON® Systems CAL 5 Plus kalibratorius. Kalibracija patvirtinama atliekant dviejų lygių kontroles, o kalibracijos duomenų protokolai segami į bylą.
Norint sumažinti atsitiktinių klaidų kiekį ir pašalinti sistemines klaidas, kasdien buvo atliekama vieno ar dviejų lygmenų kontrolė. Tam naudojamas VigilTM Serology Control skystas
30 2.4 Reumatoidinio faktoriaus (RF) tyrimo metodika
Reumatoidinio faktoriaus kiekybiniam nustatymui naudojamas Beckman Coulter SYNCHRON UniCel® DxC 800 biocheminis analizatorius, kurio RF koncentracijos matavimo ribos – 0–200 kU/l; normos – <14,0 kU/l kraujo serume ar plazmoje. Mėginių, kurių koncentracija viršija viršutines analizinio diapozono ribas, rezultatai pateikiami – >200 kU/l. Tokie mėginiai atskiedžiami fiziologiniu tirpalu ir ištiriami pakartotinai. Rezultatas dauginamas iš praskiedimo santykio. Gamintojas rekomenduoja naudoti šviežius serumo ar plazmos mėginius.
RF koncentracija nustatoma turbidimetriniu metodu naudojant BIOKIT QUANTEX RF (II) reagentų rinkinį. Reakcijos metu paciento mėginyje esantis reumatoidinis faktorius veikia kaip antikūnas prieš IgG, susijungia su žmogaus IgG, esančiu ant polistireno lateksinių dalelių, sudarydamas netirpius antigenų-antikūnų kompleksus. Sistema matuoja absorbcijos pokytį. Pokytis yra proporcingas reumatoidinio faktoriaus koncentracijai mėginyje. Rezultatai, išreikšti skaitine reikšme kU/l, yra pagrįsti PSO tarptautiniu standartu.
Siekiant užtikrinti tyrimų teisingumą ir tikslumą buvo atliekama kalibravimo procedūra. Įprastai SYNCHRON UniCel® DxC 800 biocheminio analizatoriaus RF reagentui kalibracija
normaliomis sąlygomis vykdoma kas 45 dienas, arba kaskart pradedant naują reagento butelį, pradedant naujo reagento LOT numerio rinkinius, esant nepatikimiems vidaus kokybės kontrolės rezultatams, taip pat atlikus UniCel® DxC 800 tam tikrų dalių pakeitimo ar techninės priežiūros procedūras. Kalibracija atliekama BIOKIT QUANTEX RF PLUS standart reagentu. Kalibracijos duomenys patvirtinami atliekant dviejų lygių kontroles, o kalibracijos duomenų protokolai segami į bylą.
Norint sumažinti atsitiktinių klaidų kiekį ir pašalinti sistemines klaidas, kasdien buvo atliekama vieno ar dviejų lygmenų kontrolė. Tam naudojama BIOKIT QUANTEX ASO-CRB-RF kontrolė. Kokybės kontrolės rezultatai spausdinami ir segami į atskirą bylą. Kas 3 mėn. spausdinami kokybės kontrolės grafikai ir segami į atskirą bylą
2.5 Antikūnų prieš ciklinius citrulinius peptidus (anti-CCP) tyrimo metodika
Anti-CCP tyrimų kiekybiniam koncentracijos nustatymui naudotas automatinis analizatorius Gemini (STRATEC Biomedical systems, Vokietija). Anti-CCP koncentracijos matavimo ribos: normos – ≤5,0 kU/l, teigiama – >5 kU/l kraujo serume. Tyrimo rezultatas išreiškiamas kU/l matavimo vienetais.
Anti-CCP koncentracija nustatoma imunofermentiniu metodu naudojant EURO DIAGNOSTICA EDIA™ Anti-CCP reagentų rinkinį. Tyrime esanti plokštelė su 96 šulinėliais yra
