Genetica dei Procarioti - 6
Dipartimento di Scienze della Vita CdS Biologia Molecolare e Cellulare (LM-6)
Prof. Laura Marri
ricevimento: previo appuntamento telefonico o e-mail A.A. 2015-16
correlato all’apparato della coniugazione che transloca DNA o substrati proteici attraverso la parete (spesso in relazione alla patogenesi)
Type IV – T4S
I batteri usano il sistema di secrezione di tipo IV (T4S) per due motivi fondamentali:
scambio genico
rilascio di molecole effettrici (EFFETTORI) a
cellule eucariotiche bersaglio
(b)
transmission electron microscopic image showing T-pili and flagella on A. tumefaciens.
(a) a model for T-pilus assembly in Agrobacterium tumefaciens
VirB4–VirB8–VirB5–VirB2 interaction sequence lead to the formation of VirB2–
VirB5 complexes followed by T-pilus assembly
Secretion pathway and structure of the T4S system
Ti è un esempio di plasmide batterico naturale
secondary amine derivatives formed by condensation of an amino acid, either with a ketoacid or a sugar
Crown gall tumors galla del colletto
Also, virulence plasmids from Salmonella, Shigella, Yersinia, Bacillus anthracis, E.coli, and others.
PLASMIDI
Elementi genetici mobili (mobile genetic elements, MGEs)
MGEs: segmenti di DNA codificanti enzimi o altre proteine che consentono lo spostamento di questi elementi nel genoma (mobilità intracellulare) o tra cellule batteriche (mobilità intercellulare)
nella maggior parte dei casi sono molecole di DNA circolari (1 - 1000 kb) ma anche lineari o integrati nel cromosoma batterico (episomi)
PLASMIDI
Bacterium releasing DNA with plasmids
plasmide superavvolto supercoiled
plasmide circolare rilassato
plasmide linearizzato nick
Le forme molecolari circolari superavvolte durante le manipolazioni sperimentali possono rilassarsi o linearizzarsi in seguito a rotture a singolo o a doppio filamento.
PLASMIDI
forma rilassata forma lineare forma superavvolta
forma linerizzata ( tagliata con un enzima di restrizione in un sito unico) In un gel di agarosio e bromuro di etidio le tre forme migrano a velocità diverse e possono essere distinte
Three forms of plasmid DNA
Large-scale purification of plasmids by cesium chloride density gradient centrifugation
“old school method of purifying plasmid”
since the 1950s
72-96 hrs
during this time, the CsCl forms a gradient and the molecules migrate according to their density until they float at their individual isopycnic points (the point in the gradient that equals the buoyant density of the molecule).
un plasmide deve contenere un’origine per la replicazione del DNA un plasmide deve contenere un’origine per la replicazione del DNA
Replicazione plasmidica Replicazione plasmidica
La capacità di replicarsi autonomamente è conferita loro dalla presenza di una origine di replicazione, ori (oriV, “ori vector”)
host protein
P1
richiedono proteine plasmidiche e/o dell’ospite batterico
replicazione
(uni o bi-direzionale)
circolo rotante
REPLICONI Plasmid replication
1. Plasmid replication requires host DNA replication machinery.
2. Most wild plasmids carry genes needed for transfer and copy number control.
3. All self replication plasmids have a oriV: origin of replication 4. Some plasmids carry and oriT: origin of transfer.
5. There are 5 main “incompatibility” groups of plasmid replication. Not all plasmids can live with each other.
6. Agents that disrupt DNA replication destabilize or cure plasmids from cells.
Funzioni dell’origine di replicazione
Oltre ad essere essenziale per la replicazione, l’origine di replicazione oriV controlla:
Il numero di copie
La specificità d’ospite
I gruppi di incompatibilità
NUMERO DI COPIE e MODALITA' DI REPLICAZIONE
I plasmidi si replicano con due modalità diverse
Alcuni, generalmente quelli di grandi dimensioni, si replicano in maniera coordinata con la replicazione del cromosoma batterico e si dicono sottoposti a
controllo stringente
In genere sono presenti in una o poche copie per batterio.
NUMERO DI COPIE e MODALITA' DI REPLICAZIONE
Altri, in genere di piccole dimensioni, si replicano in maniera indipendente dalla replicazione batterica e si dicono sottoposti a
controllo rilassato
Sono presenti in molte copie - fino a 1000 - per batterio.
Plasmidi ori N. di copie
PUC e derivati ColE1 500-700
pACYC e derivati p15A 10-12
pSC101 e derivati Psc10 1-5
NUMERO DI COPIE e MODALITA' DI REPLICAZIONE
H I H G
C O P Y
N U M B E R
Sistema di ripartizione
L O W
C O P Y
N U M B E R
Sistema di ripartizione
Bacterial plasmids encode partitioning (par) loci that ensure ordered plasmid segregation prior to cell division
Plasmid R1 was first isolated from Salmonella paratyphi
Plasmid R1-encoded ParMRC plasmid segregation system.
The parMRC operon.
parC is composed of two blocks of five short repeats, which are interrupted by a 39 bp region containing the promoter for parM and parR (PMR).
ParR, an adaptor protein, binds to parC and represses transcription.
ParR, an adaptor protein, binds to parC and represses transcription.
Plasmids ParR ParM
undergo catastrophic disassembly following ATP hydrolysis to ADP plus inorganic phosphate (Pi),
or
become capped by a ParR–parC complex and undergo stable bipolar elongation.
ParM forms short filaments in the presence of ATP, which either
(A) Formation of MinD filament bundles in the presence of MinE, and ATP
In vitro polymerization of cytoskeletal proteins of the MinD/ParA superfamily
(B) Formation of a ParA (ParM) filament bundle in the presence of ParB (ParR), and ATP
Actina-omologo
Controllo del numero di copie
I plasmidi possono controllare il numero di copie regolando l’inizio della replicazioneplasmidica
inibizione mediante RNA + proteina dell’inizio della replicazione
Plasmidi Col:
conferiscono un vantaggio al batterio portatore nei confronti di batteri della stessa specie o specie affini
La maggior parte dei vettori di clonaggio derivano dal plasmide ColE1 codificano per le batteriocine (scoperte da
André Gratia nel 1925) capaci di permeabilizzare le membrane o degradare gli acidi nucleici
Controllo del numero di copie
ori RNA II
Rnasi H
la replicazione è innescata da un primer (RNA II), trascritto da un promotore situato 550 bp a monte di oriV.
Gli ibridi DNA:RNA formati dal filamento di DNA e dall’RNA II nascente, costituiscono un substrato per la Rnasi H che taglia l’ibrido e fornisce l’OH al 3’ per la replicazione del DNA.
ori
RNA I rop
RNA II è controllato da RNA I, trascritto sul filamento opposto della stessa regione di DNA e, quindi, complementare a RNA II .
RNA I-RNA II compete con l’appaiamento tra RNA II e il filamento stampo, riducendo la frequenza di inizio della replicazione.
Il prodotto del gene rop stabilizza il complesso RNA I-RNA II , riducendo ulteriormente la frequenza di inizio.
RNA II
origin
P-II
P-I
Replicazione del plasmide ColE1
RNA I
RNA II
RNA I (108 b)
RNA II is required for priming DNA synthesis at the origin. Positive regulation.
P-I & P-II: promotori
-555 -20
RNA polimerasi
Funzioni dell’origine di replicazione
Oltre ad essere essenziale per la replicazione, l’origine di replicazione oriV controlla:
Il numero di copie
Lo spettro d’ospite
I gruppi di incompatibilità
Alcuni plasmidi sono in grado di replicare in un numero limitato di specie batteriche e si dicono a specificità d'ospite limitata : narrow host range
Altri sono in grado di replicarsi in una vasta gamma di specie batteriche e si dicono a largo spettro d'ospite: broad host range, BHR
I plasmidi BHR derivano questa loro proprietà dal possesso di funzioni per il riconoscimento dell' origine di replicazione, dipendono meno, quindi, dall'apparato replicativo dell'ospite batterico
SPETTRO D’OSPITE
Funzioni dell’origine di replicazione
Oltre ad essere essenziale per la replicazione, l’origine di replicazione oriV controlla:
Il numero di copie
La specificità d’ospite
I gruppi di incompatibilità
Plasmidi con la stessa origine di replicazione sono incompatibili tra loro.
Se in uno stesso batterio entrano due plasmidi con la stessa origine di replicazione, questa compete per componenti proteici comuni.
Come risultato nel giro di poche generazioni uno dei due plasmidi verrà perso.
GRUPPI DI INCOMPATIBILITA’
Plasmidi con la stessa origine di replicazione sono incompatibili tra loro.
Se in uno stesso batterio entrano due plasmidi con la stessa origine di replicazione, questa compete per componenti proteici comuni.
Come risultato nel giro di poche generazioni uno dei due plasmidi verrà perso.
Possono invece coesistere plasmidi con origine di replicazione diverse che appartengono a diversi gruppi di incompatibilità
GRUPPI DI INCOMPATIBILITA’
INCOMPATIBILITA’ PLASMIDICA
MARCATORI SELEZIONABILI
I plasmidi naturali a volte veicolano uno o più geni non essenziali capaci di conferire loro un vantaggio selettivo in alcune situazioni.
Per es. possono codificare per tossine o resistenza agli antibiotici
Plasmidi coniugativi e non coniugativi
Per essere coniugativo un plasmide deve possedere:
Una specifica regione di riconoscimento chiamata Ori T (origine di trasferimento)
I prodotti genici, agenti in trans, specificati dal locus tra (trasferimento)
una delle funzionitra: sintesi del pilo coniugativo
Plasmidi coniugativi e non coniugativi
plasmidi privi di queste funzioni geniche non sono trasmissibili
Tuttavia . . .
Plasmidi coniugativi e non coniugativi
se un plasmide possiede un Ori T può essere trasferito per coniugazione utilizzando funzioni helper che forniscono, in trans, i prodotti genici mancanti
Distribution of conjugative, mobilizable, and nonconjugative plasmids
according to plasmid size Schematic view of the genetic constitution of transmissible plasmids.
MPF: mating pair formation T4CP: Type IV coupling proteins
Escherichia coli S17-1λpir è in grado di mobilizzare plasmidi non coniugativi in batteri Gram-negativi grazie all’integrazione stabile nel proprio cromosoma dei geni codificanti per le funzioni di trasferimento derivate dal plasmide RP4 che agiscono sulla sequenza oriT presente sui plasmidi mobilizzabili
Escherichia coli S17.1 λpir
geni tra
Ricevente
plasmide
coniugazione oriT
MGEs: segmenti di DNA codificanti enzimi o altre proteine che consentono lo spostamento di questi elementi nel genoma (mobilità intracellulare) o tra cellule batteriche (mobilità intercellulare)
1. Plasmid replication requires host DNA replication machinery.
2. Most wild plasmids carry genes needed for transfer and copy number control.
3. All self replication plasmids have a oriV: origin of replication 4. Some plasmids carry and oriT: origin of transfer.
5. Plasmid segregation is maintained by a par locus-a partition locus that ensures each daughter cells gets on plasmid. Not all plasmids have such sequences.
6. There are 5 main “incompatibility” groups of plasmid replication. Not all plasmids can live with each other.
7. Agents that disrupt DNA replication destabilize or cure plasmids from cells.
Sistemi di cattura di MGE dagli ambienti naturali
Metodo endogeno
ricerca di plasmidi in batteri coltivabili
Sistemi di cattura di MGE dagli ambienti naturali
Metodo esogeno
sfrutta il potenziale di trasferimento degli MGE
metodo esogeno
A: INCROCI BIPARENTALI
B: INCROCI TRIPARENTALI
SISTEMI DI CATTURA DI MGE
metodo esogeno A
INCROCI BIPARENTALI
comunità microbica donatrice di
MGE
marcatore selezionabile
ceppo ricevente
SISTEMI DI CATTURA DI MGE
metodo esogeno B
INCROCI TRIPARENTALI
ceppo donatore con un plasmide mob +marcatore selezionabile comunità microbica
donatrice di MGE
ceppo ricevente
se un plasmide possiede un Ori T può essere trasferito per coniugazione utilizzando funzioni helper che forniscono, in trans, i prodotti genici mancanti
I II
III
plasmide mobilizzabile
plasmide coniugativo
??
ricevente
marcatore selezionabile
Sistemi di cattura di MGE dagli ambienti naturali
Metodo esogeno
sfrutta il potenziale di trasferimento degli MGE
PCR
SISTEMI DI CATTURA DI MGE
PCR
metodo esogeno che individua sequenze
specifiche di un MGE in DNA proveniente
da comunità microbiche
Various reporter genes have been used to examine HGT, including the luciferase genes luxAB, the β-galactosidase gene lacZ and genes encoding fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP).
Studying Plasmid Horizontal Transfer In Situ
Only fluorescence genes have been used for the in situ detection of HGT in natural environments, as no substrate has to be added to detect the product of the expressed reporter gene
LacI repressible
GFP
promoter
gene reporter Plasmide
coniugativo
confocal scanning laser micrographs showing green fluorescent transconjugant cells in the interstices of epidermal cells (a) and inside a stoma (b) of a bean leaf.
Horizontal gene transfer (HGT) in the phyllosphere
I biofilms offrono una nicchia ideale per lo scambio di DNA extracromosomico (plasmidi)
